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1、(10)申请公布号 CN 103620042 A (43)申请公布日 2014.03.05 CN 103620042 A (21)申请号 201280030275.9 (22)申请日 2012.06.26 11171856.5 2011.06.29 EP 11175709.2 2011.07.28 EP C12P 5/02(2006.01) C02F 11/04(2006.01) (71)申请人 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 地址 荷兰海尔伦 (72)发明人 亨德里克路易斯比杰尔 文森特帕斯卡尔佩尔恩克 (74)专利代理机构 北京东方亿思知识产权代理 有限责任公司 11258 代理人 肖善强。
2、 (54) 发明名称 消化有机物质的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种将有机物质消化成沼气的 方法， 其包括 ： 处理有机物质以减少有机物质中 的存活微生物的数量 ； 用一种或多种酶处理有机 物质 ； 将酶处理过的有机物质的液体级分与固体 级分分离 ； 消化液体级分形成沼气。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2013.12.19 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2012/062386 2012.06.26 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/000928 EN 2013.01.03 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 16。
3、 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书16页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103620042 A CN 103620042 A 1/1 页 2 1. 一种将有机物质消化成沼气的方法， 其包括 ： - 处理有机物质以减少有机物质中的存活微生物数量 ； - 用一种或多种酶处理有机物质 ； - 将酶处理过的有机物质的液体级分与固体级分分离 ； 并且 - 消化液体级分形成沼气。 2. 根据权利要求 1 的方法， 其中所述有机物质在 65-120的温度下被处理， 优选地在 65-95的温度下被处理。 3.根据权利要求1或2的方法， 。
4、其中所述有机物质在低或高pH下被处理， 优选地pH小 于 4， 更优选地 pH 小于 3， 甚至更优选地 pH 小于 2， 和或优选地 pH 大于 -1， 或优选地 pH 大于 8， 更优选地 pH 大于 9， 甚至更优选地 pH 大于 10。 4. 根据权利要求 1 至 3 中任意一项的方法， 其中为减少存活微生物的数量而处理之后 的有机物质中的 CFU 计数在存在的有机物质中低于 106CFU ml， 优选地小于 105CFU ml， 甚至更优选地小于 104CFU ml， 最优选地小于 103CFU ml。 5. 根据前述权利要求中任意一项的方法， 其中所述一种或多种酶选自蛋白酶、 脂肪。
5、酶、 裂解酶、 植酸酶、 半纤维素酶和纤维素酶。 6. 根据前述权利要求中任意一项的方法， 其中使用至少一种热稳定酶。 7. 根据前述权利要求中任意一项的方法， 其中釜馏物的液体级分在沼气发酵罐中被消 化， 其中采用 EGSB 消化池时 HRT 在 3-100 小时之间， 采用 IC 反应器时 HRT 在 3-100 小时之 间， 采用 UASB 时 HRT 在 10-100 小时之间， 采用 CSTR 时 HRT 在 1-20 天之间或采用厌氧膜生 物反应器时 HRT 在 3-12 天之间。 8. 根据前述权利要求中任意一项的方法， 其中釜馏物的液体级分在沼气发酵罐中被消 化， 所述沼气发酵。
6、罐为 USAB、 IC、 厌氧膜生物反应器或 EGSB 反应器。 9. 根据前述权利要求中任意一项的方法， 其中所述有机物质被一种或多种酶处理， 所 述处理需要 2-50 小时， 优选地为 3-30 小时。 权 利 要 求 书 CN 103620042 A 2 1/16 页 3 消化有机物质的方法 发明领域 0001 本发明涉及一种消化有机物质的方法。 0002 发明背景 0003 通过厌氧消化有机物质制备沼气是可再生能源的一个迅速发展的来源。 这是个复 杂的过程 ； 几个生物技术工艺的联合作用决定了所制备沼气的稳定性、 效率和产率。 最佳的 工艺设计仍然处于实验室和试验厂(pilot pla。
7、nt)的积极研究之中。 底物例如草(grass)、 粪便 (manure) 或污泥 (sludge) 由于其高产率的潜力， 能够用作沼气制备的进料 (feed)。 0004 消 化 系 统 通 常 被 分 为 单 级 消 化 池 (one-stage digester) 和 两 级 消 化 池 (two-stage digester)。在单级消化池中， 厌氧消化的所有微生物阶段在一个罐 (tank) 或 发酵罐 (fermenter) 中发生。在两级消化池中， 水解和酸化在第一个反应器中发生， 产乙酸 (acetogenesis)和产甲烷(methanogenesis)在第二个反应器中发生。 。
8、该两段(two phase) 概念常常被用于消化工艺的优化以生产更多的甲烷。单级工艺和两级工艺的共同点是， 厌 氧消化的所有的阶段都是这样的微生物工艺 ： 所述微生物工艺涉及适合的微生物组合的存 在。 0005 用于从各种废物 ( 废水 ) 处理系统生产沼气的几种反应器配置为 ： CSTR( 连 续搅拌釜式反应器， continuously stirred tank reactor)， SBR( 顺序批量式反应器， sequential batch reactor)， 后者涉及定期的沉降阶段 (settling phase) 以使微生物存 活更久， 并通过这种方式将生长率 (growth ra。
9、te) 与水力停留时间 (hydraulic retention time) 解偶联 (uncoupling)。另一种选择是应用厌氧膜生物反应器 (anaerobic membrane bioreactor， AnMBR)。更复杂的系统是 UASB( 上流式厌氧污泥床， upflow anaerobic sludge blanket)、 EGSB( 膨胀颗粒污泥床， expended granular sludge bed) 或 IC( 内循 环， Internal Circulation) 反应器通常用于各种废物废水处理系统、 设计的沼气生产， 目 的在于达到较高的OLR(有机负荷率(org。
10、anic loading rate)、 降低的HRT(水力停留时间 (hydraulic retention time) 和较高的甲烷 ( 沼气 ) 产率的优化。 发明概要 0006 本发明提供了有机物质消化产生沼气的一种改进的方法。该方法为两级工艺， 其 中只有第二级是微生物的消化。 第一阶段中有机物质被热处理以防止存在的微生物生长并 且经热处理的有机物质被酶处理。第一阶段的流出物 (effluent) 被分离为液体级分和被 洗涤的 (washed) 固体级分。液体级分被送入第二阶段来生产沼气。热处理和酶处理能够 控制并优化在活性的微生物环境中不能实现的该步骤 ( 第一阶段 )。与现有技术的。
11、方法相 比， 本发明方法使整体停留时间更短并且不损失产气率 (gas yield)。 附图说明 0007 图1显示了用于减少猪粪中微生物数目的溶解酶(lytic enzymes)的组合和顺序 的变化。 说 明 书 CN 103620042 A 3 2/16 页 4 0008 发明描述 0009 沼气是厌氧消化或可生物降解物质的发酵的产物。 沼气主要包含甲烷和二氧化碳 并可能有少量的硫化氢、 水分和硅氧烷。在特殊情况下， 氢是目标产物。 0010 有机物质或生物物质是指来自死亡生物 (once-living organism) 或存活生物 (still-living organism)的物质 ；。
12、 能够腐败， 或者产物能够腐败。 优选地， 有机物质是微生 物物质如来自纯化、 发酵或消化过程的污泥或生物质。 特别地， 根据本发明能够有利地处理 来自好氧纯化工艺的菌泥 (bacterial sludge) 或来自好氧消化的细菌生物质 (bacterial biomass)。 0011 污泥或活性污泥 (activated sludge) 是指废水或污水处理系统的固体废物或固 体废物产物或固体生物质。固体废物产物主要由细菌组成。优选地， 使用好氧纯化步骤或 系统中的污泥。能够用于本发明方法的合适的有机废物流 (organic waste streams) 为来 自工业发酵工业的发酵液 (fe。
13、rmentation broths) 或其级分。另一种合适的有机废物流是 粪便如牛粪、 猪粪、 山羊粪或马粪。 0012 有机物质中的有机物含量是指有机物质减去灰分后的干物质含量。 COD(化学需氧 量 (Chemical Oxygen Demand) 测试常常被用于间接测量有机物质的有机物含量， 例如参 见 ISO6060(1989)。 0013 本发明提供了一种将有机物质消化成沼气的方法， 其包括 ： 0014 - 处理有机物质以减少有机物质中的存活微生物数量 ； 0015 - 用一种或多种酶处理有机物质 ； 0016 - 将酶处理过的有机物质的液体级分与固体级分分离 ； 并且 0017 。
14、- 消化液体级分形成沼气。 0018 本发明方法能够处理各种可消化的有机物质。酶步骤 (enzymatic step) 和微生 物消化的分离能够对处理有机物质的条件进行最佳控制和选择。 适合的底物例如是能源作 物 (energy crop) 如草、 农场废物如粪便或农业废弃物、 来自废水处理系统的污泥、 市政废 物的有机级分、 来自发酵工业和生物精炼厂的生物质。一些有机物质的混合物也能够在本 发明方法中使用。 0019 本发明方法能够处理各种可消化有机物质如污泥或其他有机物质， 优选地为菌泥 或其他细菌有机废物。特别地， 根据本发明能够处理来自好氧纯化工艺的菌泥或来自好氧 消化的细菌生物质。这。
15、些好氧工艺的细菌被发现是酶可消化的。这些细菌的细胞壁被发 现能够被溶解酶降解， 所述溶解酶任选地与本文所述的污泥或生物质的预处理相结合。酶 步骤与任选的微生物消化的分离为处理有机物质的条件提供了最佳控制和选择。污泥的 级分或几种污泥的混合及其级分能够用于本发明的方法。此外污泥可以与其他的有机物 质或底物如草或粪便混合或组合。除了污泥， 其他的微生物物质如源自例如酵母或真菌发 酵工业如酿酒厂的生物质或来自藻类培养的藻类生物质也能够用于本发明的方法。本发 明方法被发现对富氮底物或可消化的有机物质非常有用。有机物质被优选地在 65-120， 更优选地 65-95的温度下进行适当时间的热处理或巴氏灭菌。
16、 (pasteurized)。巴氏灭菌 (pasteurization)是在潮湿环境中将有机物质加热至特定温度并持续特定时间的工艺。 例 如， 在 72下巴氏灭菌 30 秒就足够了。例如在 120。C 下 1 小时和在 90下 4 小时的 CFU 计数(见下文)的结果是相同的。 一般地， 高温可能导致更多的蛋白质变性以及有毒化合物 说 明 书 CN 103620042 A 4 3/16 页 5 的产生。一般地， 如果巴氏灭菌的时间更长， 巴氏灭菌的温度能够更低。巴氏灭菌的水含量 应当足以达到巴氏灭菌的效果。一般地， 水含量在 30wt和 95wt之间， 优选地在 50wt 和 90wt之间。该。
17、方法减慢了有机物质中微生物的生长。巴氏灭菌或热处理目的不是杀 死有机物质中所有的微生物。取而代之， 巴氏灭菌或热处理的目的在于减少存活微生物的 数量， 使得它们在本方法第一级 ( 或第一个步骤或第一阶段或酶处理 ) 中不会大量地产生 沼气或其他发酵产物如有机酸和醇 (alcohols)。一般地， 总的沼气中少于 2， 优选地小 于 1的沼气在第一级中产生。根据本发明的巴氏灭菌或热处理之后， 存在的有机物质中 CFU 计数一般低于 106CFU ml， 优选地小于 105CFU ml， 甚至更优选地小于 104CFU ml， 最优选地小于 103CFU ml。在微生物学上， 菌落形成单位 (CF。
18、U 或 cfu) 是对存活细菌数目 或真菌数目的量度。不同于所有细胞 ( 死细胞和活细胞 ) 都计算在内的直接显微镜计数法 (direct microscopic counts)， CFU 测量活细胞。巴氏灭菌步骤也促进了直接源自采集酶 生产发酵 (harvested enzyme production fermentations) 的酶或酶混合物的使用。 0020 另一种表征减少微生物数量的处理的功效的方式是通过计算起始物质的 CFUs 数 目除以处理后物质的 CFUs 数目的对数。这种方法的优点是因为杀灭微生物一般被认 为是一级反应 (first-order reaction)处理的对数下。
19、降值 (log reduction) 很大程 度不依赖于存在的微生物的实际数目。一个消毒 (sterilization) 过程可能需要达到高至 log10 的下降值 (log10reduction)( 将杀死多达 108或更多的微生物 )， 但在本发明的情况 下不需要或者甚至不希望如此高的功效。本发明的一个有效的处理过程将产生 CFUs 数目 至少 log1 的下降， 优选地为 log2， 甚至更优选地为 log3 的下降。 0021 一般地， 低或高pH下的热处理对本方法是有益的， 例如在pH-1时进行， 或者例如在pH8、 更优 选地 pH9、 甚至更优选地 pH10 时的高 pH 处理。。
20、高和低 pH 下的热处理的优点例如是聚合 物如蛋白质、 碳水化合物、 如淀粉如半纤维素酶和脂类的增溶 (solubilization) 和部分水 解， 同时通过极端 pH 将强化存活细胞的减少， 导致例如热处理所需温度的降低和或时间 的减少。高 pH 处理的其他优点例如是提高热处理和酶处理结束时的固液分离， 提高了蛋 白质和脂肪的增溶， 提高了具有高氨含量的原料的氨吹脱 (ammonia stripping)。用于调 节 pH 的化学品可以例如是用于降低 pH 的盐酸、 磷酸和硫酸， 或用于提高 pH 的氢氧化钾和 氢氧化钠。 0022 根据本发明， 有机物质的酶处理期间几乎没有任何沼气形成，。
21、 沼气的产生发生在 沼气发酵罐中。本方法的另一个有利之处是所用的酶几乎不会被存在的微生物失活或消 耗。存在的低数量的活微生物对添加的酶及其活性几乎没有任何影响。 0023 热处理需要向有机物质添加能量。注意到相比没有热处理的情形， 能量的添加被 增加的沼气产量所补偿。在大多数情况下， 甚至以沼气的形式产生了多于热处理所需的能 量。 0024 任选地， 在巴氏灭菌或热处理之前、 期间或之后， 可以预处理(部分的)有机物质， 使物质例如存在的纤维素更利于酶的利用。该预处理可以例如是机械预处理、 化学预处理 或热预处理或其组合。 蒸汽爆破处理或高于120的高温处理是热处理的范例。 化学氧化或 ( 例。
22、如使用强酸或强碱化合物的 ) 化学水解可以用作化学预处理。超声波处理或研磨 ( 或 混合或均质化 ) 是机械预处理的范例。向温度处理 (temperature treated) 的有机物质中 说 明 书 CN 103620042 A 5 4/16 页 6 添加一种或多种酶。所述的酶 ( 一种或多种 ) 使得巴氏灭菌或热处理过的介质中的有机物 质的降解变为可能， 其中微生物的生长受到限制。 相比其中没有使用酶的方法， 这将提高沼 气的产量。 一般使用一种以上的酶， 有利地使用酶组合物， 其至少包括蛋白酶和或纤维素 酶， 优选地至少包括蛋白酶、 脂肪酶和纤维素酶， 和任选地包括淀粉酶、 半纤维素酶。
23、、 植酸酶 (phytase) 和或裂解酶 (lysing enzyme)。酶将复杂的碳水化合物、 蛋白质和脂质的长链 分解成更短的部分。 例如， 多糖被转换成寡糖和或单糖。 蛋白质被分裂成肽和氨基酸。 也 能够使用促进有机物质降解的其他的酶组合物。 酶可以被混合形成所选择的组合或者由选 定的菌株在选定的发酵条件下作为一种混合物而产生。 例如可以使用得自如Trichoderma、 Aspergillus或Talaromyces的真菌发酵液或如Bacillus的细菌发酵液的酶混合物。 可以 根据所添加的底物或有机物质的组成来设计酶混合物。例如存在高量脂肪物质的情况下， 可以在工艺中添加脂肪酶， 。
24、存在碳水化合物的情况下， 所用的酶中可以包含淀粉酶。 0025 酶步骤可以作为单步骤工艺或多步骤工艺来完成。 多步骤工艺允许针对例如酶特 性对工艺进行最优化。 因此， 纤维素酶和蛋白酶的处理可以单独完成， 或者可以重复纤维素 酶和蛋白酶的处理。 0026 优选地， 所用的其中一种酶是热稳定的。 优选地， 酶组合物中的活性物可以是热稳 定的。此处， 这意味着活性物的最适温度为 60或更高， 例如 70或更高， 如 75或更高， 例如 80或更高如 85或更高。酶组合物中的所有活性通常不具有相同的最适温度， 但优 选地仍将是热稳定的。 0027 纤维素酶是水解纤维素 (-1， 4- 葡聚糖或 D-。
25、 葡萄糖苷键 ) 生成葡萄糖、 纤维 二糖、 纤维寡糖之类的酶。增强纤维素酶的蛋白质例如 GH61 也被本文术语纤维素酶所包 含。 0028 传统上纤维素酶分为以下主要几类 ： 内切葡聚糖酶 (“EG” ， (E.C.3.2.1.4)， 其水 解葡萄糖单元之间的 -1， 4- 键 )(EC3.2.1.4)(“EG” )， 外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶 (“CBH” (E.C.3.2.1.91)， 其从纤维素的还原性末端和非还原性末端水解纤维二糖， 一种葡 萄糖二糖 ) 以及 - 葡萄糖苷酶 (-D- 葡糖苷葡萄糖水解酶 (“BG” ， (E.C.3.2.1.21)， 其将纤维二糖的-1， 4糖。
26、苷键水解生成葡萄糖)。 见例如Knowles等， TIBTECH5， 255-261， 1987 ； Shulein， Methods Enzymol.， 160， 25， pp.234-243， 1988。内切葡聚糖酶主要作用于 纤维素纤维的无定形部分 (amorphous parts)， 而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素 (Nevalainen 和 Penttila， Mycota， 303-319， 1995)。因此， 需要纤维素酶系统中存在纤维 二糖水解酶来有效增溶结晶纤维素 (Suurnakki， 等。Cellulose7 ： 189-209， 2000)。- 葡 萄糖苷酶作用在。
27、于从纤维二糖、 纤维寡糖和其他葡萄糖苷中释放 D- 葡萄糖单元 (Freer， J.Biol.Chem.vol.268， no.13， pp.9337-9342， 1993)。 0029 蛋白酶 ( 降解或修饰蛋白质的酶 ) 例如是内切作用的蛋白酶 ( 丝氨酸蛋白酶、 金 属蛋白酶、 天冬氨酰蛋白酶、 巯基蛋白酶 )， 外切作用的肽酶， 其将一个氨基酸或二肽、 三肽 等等 (etceteras) 从多肽链的 N- 末端 ( 氨肽酶 ) 或 C- 末端 ( 羧肽酶 ) 切下。 0030 脂肪酶或脂肪物质分离酶例如是三酰甘油脂肪酶、 磷脂酶 ( 如 A1， A2， B， C 和 D) 和 半乳糖脂。
28、酶。 0031 半纤维素酶是一组分解半纤维素的酶的总称。例如是木聚糖酶、 - 木糖苷酶、 a-L- 阿拉伯呋喃糖苷酶， a- 半乳糖苷酶、 乙酰酯酶、 - 甘露糖苷酶和 - 葡萄糖苷酶。 说 明 书 CN 103620042 A 6 5/16 页 7 0032 植酸酶 ( 肌醇六磷酸酯磷酸水解酶 ) 是催化水解植酸 ( 肌醇六磷酸酯 )( 谷物和 油籽中发现的一种难消化的有机形式的磷 )， 并释放可用形式的无机磷的任何类型的磷酸 酶。 0033 裂解或溶解酶是指能够裂解微生物细胞壁的酶。微生物包括细菌、 真菌、 古细菌 (archaea) 和原生生物 (protists) ； 藻类 ； 和如浮。
29、游生物 (plankton) 和涡虫 (planarian) 的动物。优选地， 微生物是细菌、 真菌、 酵母或藻类。微生物或微菌 (microbe) 是单细胞生 物或生活在细胞生物群落中的生物。 0034 裂解酶可以例如是蛋白酶。裂解酶的示例有溶菌酶 (lysozyme) 或胞壁质酶 (muramidase)( 来自鸡蛋 )， 来自 Trichoderma harzianum 的裂解酶， 来自 Lysobacter 如 Lysobacter enzymogenes 的溶解酶， 来自 Arthrobacter luteus 的溶细胞酶 (lyticase) 以 及 来 自 Streptomyce。
30、s globisporus ATCC21553 的 变 溶 菌 素 (Mutanolysin)，来 自 Streptomyces fulvissimus 的 labiase 或 来 自 Staphylococcus 的 溶 葡 球 菌 酶 (lysostaphin)。示例的裂解酶例如可以购自通过污泥或其他细菌物质 的裂解， 细胞内容物 (cell contents) 从细胞中释放出来， 使得除了添加的酶之外， 污泥细 胞或者细菌物质中存在的酶可以用于本发明。 释放的酶甚至可能含有可以裂解其他细菌的 溶解酶。 0035 有机物质优选地在 65-120的温度下、 更优选地在 65-95的温度下被巴。
31、氏灭菌 或热处理， 因此酶优选地在巴氏灭菌或热处理的温度下或比所述温度低 0-10的温度下具 有最佳活性， 所以一般在55-90的温度下具有最佳活性。 酶在选定的巴氏灭菌或热处理的 温度下优选地稳定足够时间， 例如至少 30 分钟， 优选地至少 1 小时。稳定 (stability) 是 指孵育时间的一定时期之后， 反应条件下的活性至少为起始活性的一半。 0036 酶处理时的 pH 一般地在 4 和 9 之间， 优选地在 4 和 8 之间， 更优选地在 5 和 8 之 间。酶在选定的 pH 下优选地稳定足够时间， 例如至少 30 分钟， 优选地至少 1 小时。 0037 用于水解含有聚合物底物。
32、的有机物质的酶的使用， 被发现导致液相中有机物的高 提取率 (extraction yield)， 一般地高于 75。对于 ( 猪 ) 粪便或污泥其将高于 40。像 微生物一样， 酶水解保水 (water-binding) 结构 ( 蛋白质， 多糖 )， 而本身不产生聚合物结 构。酶导致相的粘性 (viscosity) 降低， 这促进固液分离。酶能够促进固液分离的另 一种方式是通过降低乳化性能。例如已知蛋白酶和脂肪酶在这方面有帮助作用。这种方式 减少了固相的体积。使得固体残余物 (solid residue) 的加工和处置 ( 这是废水厂的重要 成本因素 ) 更容易和更便宜。酶工艺的这些性能被。
33、发现很大程度地简化了固液分离， 并 且与基于微生物水解的工艺相比令人惊讶地非常有利。此外， 本发明以高产率提取可溶形 式有机物的能力有利于将该有机物加工为沼气。使用这样的可溶性底物， 可以应用基于生 物质停留的高负荷厌氧反应器 ( 例如 UASB 和 EGSB) 技术。该技术在采用部分地与缓慢地 可降解的不溶性底物的常规方法中是不适用的。 0038 巴氏灭菌或热处理步骤能够在酶处理之前或 ( 部分地 ) 在酶处理期间进行。如果 巴氏灭菌或热处理 ( 部分地 ) 与酶处理同时进行， 那么巴氏灭菌或热处理的时间可以与酶 处理时间一样长。酶处理的时间将取决于例如所采用的温度、 底物、 所使用的酶 (。
34、 一种或多 种 ) 以及酶的浓度。一般地， 酶处理将需要 2-50 小时， 优选地为 3-30 小时。酶处理可以分 批地 (batch wise) 或连续地进行， 例如可以采用 CSTR 反应器。 说 明 书 CN 103620042 A 7 6/16 页 8 0039 任选地， 酶处理结束时， 将处理过的有机物质进行处理来使存在的酶至少部分失 活。例如， 可以使用热激 (heat shock)、 改变 pH。所使用的酶也可以被选择为在酶处理过 程中在已完成其职责之后被失活。一般地， 所用的酶被选择为不会对本方法后期的沼气生 产构成实质的负面影响， 或者甚至在沼气生产阶段以积极的方式做出贡献。。
35、 0040 在固液分离步骤中， 液体级分与处理过的有机物质的固体级分分离。优选地， 在固液分离过程中选择最适条件， 如 pH、 温度、 添加絮凝剂 (flocculants) 或助滤剂 (filter aids) 等。可以使用各种合适的分离技术， 例如倾析 (decantation)、 过滤、 离心 或其组合。任选地， 在分离发生之前添加絮凝剂或助滤剂以改善分离效果。特别地， 可生物 降解的絮凝剂和助滤剂如纤维素被有利地应用。为了防止可溶性可消化物质的损失， 可以 将得到的滤饼 (filter cake) 或离心污泥进行洗涤 (washed)。洗涤液与初步得到的滤液 (filtrate) 或上。
36、清液组合。在酶孵育温度下执行这些工艺步骤将有利于分离过程。 0041 可以通过例如焚烧 (incineration)( 燃烧 (combustion)、 堆肥 (composting) 或 在耕地或森林播撒 (spreading) 来加工或使用来自固液分离的固体级分。本发明方法包 含温度处理步骤， 允许将固体级分进行堆肥或播撒而无需对固体级分的进一步热处理， 该 热处理在播撒污泥或其它生物质的情况下往往是需要的。 0042 在酶处理和或分离步骤中能够维持无氧或有氧条件。 一般不必采取特殊措施以 保持厌氧条件。 0043 来自固液分离器的液体级分被引入沼气反应器。上流式厌氧过滤器 UASB， 厌。
37、氧 填充床和 EGSB 反应器是工业规模的高速率 (high-rate) 消化池的例子。特别地， 在高有机 负荷率下应用时， UASB 和 EGSB 反应器提供高速率消化池的优点。在沼气反应器中使用液 体增溶底物 (liquid solubilized substrate) 使反应器能够承受非常高的负荷。一般地 2-70kgCOD m3天， 优选地至少 10kg COD m3天和或小于 50kg COD m3天能够 被引入到沼气反应器中。更优选地至少 20kg COD m3天可以被引入沼气反应器中。优 选地 EGSB 消化池的 HRT 在 3-100 小时之间， 更优选地在 3 和 75 小时。
38、之间， 甚至更优选地在 3 和 60 小时之间并且最优选地在 4 和 25 小时之间。优选地， IC 反应器中的 HRT 在 3-100 小时之间， 更优选地在 10 和 80 小时之间， 最优选地在 15 和 60 小时之间。优选地 UASB 消 化池中的 HRT 在 10-100 小时之间， 更优选地在 20 和 80 小时之间并且最优选地在 20 和 50 小时之间。优选地， CSTR 消化池的 HRT 在 1-20 天之间， 更优选地在 2-15 天之间， 最优选地 在 2-10 天之间。一般地， 不会发生液体回收 (recycling) 至第一阶段 ( 酶处理 )。在 CSTR 系统。
39、中可以采取措施保持反应器中的生物量。优选地， 厌氧膜生物反应器的 HRT 在 3-12 天 之间， 更优选地在 4 和 10 天之间。 0044 如果回收液体， 回收液中将有微生物存在， 它们会在第一阶段开始生产沼气。 如果 需要回收液体， 必须采取措施保证第一阶段中没有引入厌氧微生物而造成的沼气生产， 例 如可以将回收液巴氏灭菌或消毒。 0045 沼气反应器的 pH 将一般在 pH3 和 pH8 之间， 优选地在 pH6 和 pH8 之间。一般地， 无需采取措施来控制 pH， 系统本身能够维持 pH。如果沼气反应器的底物超过了该 pH 的范 围， 例如 pH5 或更低， 或 pH9 或更高，。
40、 该底物的 pH 优选地被中和到例如 6 和 8 之间。 0046 本发明方法在于对用于有机物质热处理的能量进行最佳利用。 直接适用本发明方 法下面的步骤可以减少在酶处理、 液固分离和沼气生产中损失的热形式的能量损失。酶 说 明 书 CN 103620042 A 8 7/16 页 9 处理、 液固分离和沼气生产可以在与热处理温度几乎相同的温度下发生， 无需添加额外 的加热或其他形式的能量供应。 因此， 固液分离优选地在70-50进行。 沼气生产优选地 在 65-30进行并且最优选地在 65-40进行。 0047 本发明方法可以以许多方式实施， 包括分批式 (batch)、 进料分批式 (fed。
41、 batch) 或连续负载式 (continuously loaded) 的反应器或发酵罐或其组合。对于酶处理， 分批式 反应器是优选的。在沼气生产阶段， 连续反应器如 UASB 或 EGSB 是优选的。 实施例 0048 方法与材料 0049 酶 0050 用于孵育各种原料 (feedstock) 的酶是半纤维素酶类、 纤维素酶类、 蛋白酶类 和溶菌酶类的商业可用的酶样品。所用的半纤维素酶产品是ARA10.000， 纤维素酶产品是NL， 溶菌酶产品是L， 并且所用的蛋白酶产品是 一种细菌蛋白酶。所有的酶产品由 DSM Food Specialties 生产。 0051 CFU 的测定方法 0。
42、052 CFU 使用 NEN-EN ISO4833 ： 2003 针对好氧计数 (Aerobic count) 来测定。厌氧计 数则使用 NEN6813 ： 1999。 0053 酶溶液中总蛋白质含量的测定方法 0054 该方法是用三氯醋酸 (TCA) 沉淀蛋白质以去除干扰物质和允许用比色双缩脲反 应(Biuret reaction)测定蛋白质浓度的组合。 在双缩脲反应中， 铜(II)被还原为铜(I)， 其与肽键的氮和碳在碱性溶液中形成复合物。紫色 (violet) 表示蛋白质的存在。根据比 尔 - 兰伯特定律 (Beer-Lambert law)， 颜色的深度 (intensity) 以及因。
43、此在 546nm 处的吸 光度与蛋白质浓度成正比例。使用 BSA( 牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumine) 进行标 准化， 蛋白质含量被表示为 g 蛋白质作为 BSA 当量 L 或被表示为 mg 蛋白质作为 BSA 当 量ml。 使用本领域中已知的标准计算方案计算蛋白质含量， 通过绘制OD546相对具有已知 浓度的样品浓度的图， 随后使用从校准线产生的方程计算未知样品的浓度。 0055 化学需氧量 (Chemical Oxygen Demand， COD)、 总 COD、 可溶性 COD(soluble COD)、 总固体 (total solids， TS)、 总悬浮固。
44、体 (total suspended solids， TSS)、 灰分、 挥发 性固体 (volatile solids， VS)(= 有机干物质 )、 挥发性悬浮固体 (volatile suspended solids， VSS， 系统中存在的最大细胞生物质的指征 )、 增溶率 (solubilization yield)、 总 Kjeldahl 氮、 氨氮 (ammonia nitrogen) 的测定 0056 这些参数根据本领域已知并如美国公共健康协会 (American Public Health Association) 的标准方法 (Standard Methods)(APHA，。
45、 1995) 所描述的标准规程测定。 0057 沼气组成 (CH4 和 C02) 使用配备有热导率检测器 (TCD) 的气相色谱法来测 量。挥发性脂肪酸 (VFA) 和乙醇浓度使用配备有火焰离子化检测器 (FID) 的气相色谱仪 (Shimadzu GC-2010AF， 京都， 日本 ) 来测量 (Angelidaki 等， 2009)。 0058 增溶率通过下述公式使用预处理后的总浆体 (total slurry) 和上清液的有机干 物质含量测定 ： 说 明 书 CN 103620042 A 9 8/16 页 10 0059 0060 其中 ： oDMS= 上清液的有机干物质含量 0061 。
46、oDMT= 总浆体的有机干物质含量 0062 0063 总蛋白质含量由总 Kjeldahl 氮含量乘以 6.25 计算。猪粪例外， 对猪粪而言从总 Kjeldahl 氮中减去氨氮含量， 然后与 6.25 相乘。 0064 脂质的测定方法 0065 样品称重倒入合适的小瓶并冻干。冻干后， 记录重量。将干燥的残余物均质化， 称 取约 1 克至提取筒壳 (extraction shell)( 型号 ： Whatman 纤维素提取套管 26mm60mm 单 一厚度 )。该筒壳在 Soxtec 提取单元 (Soxtec 系统 MT1043 提取单元 ) 中在 119温度下 用预先称重的合适的 Soxte。
47、c 杯在二氯甲烷 (Merck， 用于液相色谱的质量 ) 中煮 1.5 小时。 然后将筒壳回流 1 小时。随后蒸发二氯甲烷。 0066 该杯子增加的重量就是从约 1 克的干燥物质中提取的脂肪含量。针对冻干步骤期 间测定的干重进行校正后， 如此每个样品的脂肪量以 g Kg 表示。 0067 碳水化合物和木质素 (lignin) 的测定方法 0068 根据 “Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass” ， A.Sluiter等.Technical report NRELTP-510-42618测定碳水化合物和木质。
48、素的含量。 0069 实施例 1 0070 预处理条件和酶孵育对酿酒酒糟 (Brewers Spent Grain) 增溶的影响 0071 酿酒酒糟 (BSG)， 作为经研磨和干燥的物质， 从商业酿酒厂获得。在与循环水浴连 接的封闭的双壁玻璃反应室中， 将该物质悬浮于蒸馏水中至干物质含量为 10， 所述水浴 中水温被设置为所需的温度， 即 70或 90。这样的悬浮液的 pH 为 pH6.6， 并用 4N HCl 或 4N NaOH 调节至 pH1.5、 pH4、 pH11.5。随后， 将浆体孵育一定时间， 同时搅拌。或者， 将 BSG 悬浮液调整到如前所述的所需的 pH， 在消毒器 (ster。
49、ilizer) 里于烧瓶中处理需要的一段 时间， 假设温度为 120。不同的预处理后， 将浆体冷却， 用 HCl 或 NaOH 调整 pH 至 7.5， 在 60下孵育 4 小时， 添加 100mgBSG 干物质。随后， 冷却孵育物， pH 调节至 pH5.0， 并进一步在50下孵育24小时， 添加来自ARA10.000的蛋白质7.5mg/ gBSG 干物质和来自NL 的蛋白质 9mg/g BSG 干物质。 0072 2 次后续的酶孵育之前和之后， 分析每个处理的样品的有机干物质， 然后重新计算 如前所述的增溶率。整个系列的处理和酶孵育后的增溶率结果示于表 1。 0073 表1.在所示的不同pH、 温度和时间设置下， 与酶孵育结合的pH、 温度处理后的BSG 说 明 书 CN 。