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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910118897.0 (22)申请日 2019.01.26 (71)申请人 沈阳农业大学 地址 110161 辽宁省沈阳市沈河区东陵路 120号沈阳农业大学 (72)发明人 刘宝山 尹荣焕 姚龙泉 韩小虎 吴长德 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/21(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测副猪嗜血杆。
2、菌的RPA引物、 RPA 探针、 试剂盒及核酸检测方法 (57)摘要 本发明公开一种用于检测副猪嗜血杆菌的 RPA引物、 RPA探针、 试剂盒及核酸检测方法， 其中 RPA引物包括正向引物为infBRPAF， 其序列为： CATTGAATCAGCWGGYCCATCAATTCCTGTGGA， 反向引 物 为 i n f B R P A B ，其 序 列 为 ：B i o - CACTTTTACTTCTGCCGTTGAAAGCTCGTGTAAA， 其中基 于RPA引物扩增区域设计的RPA探针为infBRPAP， 其序 列为 ： FI TC- ACTTTC AGG CG TACC AG CCGCAG。
3、GTGATGAAGHGACAGTGGTGCGTGAT- C3spacer。 本发明将副猪嗜血杆菌样品的简易处 理、 RPA技术和侧流层析检测有机结合， 通过设计 特异的RPA引物、 RPA探针， 可简便、 快速、 准确的 进行副猪嗜血杆菌的诊断和检测。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 109593869 A 2019.04.09 CN 109593869 A 1.一种用于检测副猪嗜血杆菌的RPA引物和RPA探针， 其特征在于， 所述的RPA引物包括 正向引物为infBRPAF， 其序列为： CATTGAATCAGCWGGYCCATCAATTCCTGTGGA， 反向引物为infBRP。
4、AB， 其序列为： Bio-CACTTTTACTTCTGCCGTTGAAAGCTCGTGTAAA， 其中基于RPA引物扩增区域设计的RPA探针为infBRPAP， 其序列为： FITC-ACTTTCAGGCGTACCAGCCGCAGGTGATGAAGHGACAGTGGTGCGTGAT-C3 spacer。 2.一种用于检测副猪嗜血杆菌的RPA试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要求1所述的RPA 引物和RPA探针。 3.根据权利要求2所述的一种用于检测副猪嗜血杆菌的RPA试剂盒， 其特征在于， 还包 括： (1)样品处理液： 0.2M KOH溶液； (2)检测反应液： 50mM pH7.9的Tr。
5、is-HCl； 100mM的乙酸 钾； 2mM的二硫苏糖醇； 3mM的腺嘌呤核苷三磷酸； 20mM的磷酸肌酸； 5 g的肌酸激酶； 5质量 分数的聚乙二醇， 200 M的脱氧核糖核苷三磷酸， RPA引物， 14mM的醋酸镁； (3)干粉管： 3.75 g冻干的重组酶uvsX、 750ng冻干的重组酶uvsY、 30 g的单链结合蛋白、 900ng链置换聚合酶； (4)侧流试纸条； (5)阳性对照反应液： 副猪嗜血杆菌infB基因片段； 10mM pH8.0的TE缓冲 液； (6)阴性对照反应液： 10mM pH8.0的TE缓冲液； (7)上样处理液： 0.01M pH为7.3的PBST缓 冲液。
6、； (8)吸管； (9)无菌注射器， 上述物质的浓度为在各试剂中的终浓度。 4.一种检测副猪嗜血杆菌的核酸检测方法， 其特征在于， 包括以下操作步骤： (1)样品处理： 用无菌注射器采取待检猪关节液、 脓液、 腹腔液或肺脏组织液， 往3ml样 品处理液中滴加0.05ml， 充分振荡混匀后得到样品处理液； (2)扩增： 在干粉管中滴加0.05ml检测反应液， 然后加入用微量吸管吸取的定量样品处 理液5ul， 同时设立阳性及阴性对照， 混匀， 将干粉管置于操作者腰带下反应20分钟， 得到反 应液； (3)判定： 反应完成后用吸管吸取0.01ml的反应液加入到2ml上样处理液中混匀， 然后 将侧流试。
7、纸条放入上样处理液中进行结果测定， 5分钟后观察判定结果： 如阴性对照样品中 的侧流试纸条只在C的位置上出现条带， 阳性对照样品中的侧流试纸条在C和T的位置上都 出现条带， 表明试验成立， 检测样品中的侧流试纸条的条带和阳性对照样品一样出现两个 条带为阳性， 表明待检猪中含有副猪嗜血杆菌； 和阴性对照样品一样出现一个条带为阴性， 表明待检猪中不含有副猪嗜血杆菌。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109593869 A 2 一种用于检测副猪嗜血杆菌的RPA引物、 RPA探针、 试剂盒及核 酸检测方法 技术领域 0001 本发明属于畜产品安全生物技术领域， 具体涉及一种用于检测副猪嗜血杆。
8、菌的 RPA引物、 RPA探针、 试剂盒及核酸检测方法。 背景技术 0002 副猪嗜血杆菌病又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎、 格氏病(Glasser s disease)， 是由副猪嗜血杆菌引起的一种猪的传染病， 临床上以体温升高、 关节脓肿、 呼吸 困难、 多发性浆膜炎和高死亡率为特征的传染病， 严重危害仔猪和青年猪的健康。 目前， 副 猪嗜血杆菌病已经在全球范围影响着养猪业的发展， 给养猪业带来巨大的经济损失。 0003 副猪嗜血杆菌属革兰氏阴性短小杆菌， 形态多变， 有15个以上血清型， 其中血清型 5、 4、 13最为常见(占70以上)。 该菌生长时严格需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NA。
9、D)， 不需要 X因子(血红素或其它卟啉类物质)， 在血液培养基和巧克力培养基上生长， 菌落小而透明， 在血液培养基上无溶血现象； 在葡萄球菌菌台周围生长良好， 形成卫星现象。 一般条件下难 以分离和培养， 尤其是应用抗生素治疗过病猪的病料， 因而给本病的诊断带来困难； 据报 道： 猪副嗜血杆菌的真实发病率可能为实际确诊的10倍之多。 0004 由于副猪引起的多发性浆膜炎和关节脓肿也可由猪肺疫、 传染性胸膜肺炎、 链球 菌、 猪丹毒等病原引起， 因此， 单凭症状和病变能难很难对其进行确诊， 还需要借助实验室 检测方法。 目前对副猪嗜血杆菌的检测方法主要有细菌分离培养、 PCR技术等。 但以上方。
10、法 均需要昂贵的实验室条件、 仪器设备和专业技术， 并且需要较长的时间， 难以满足现场或田 间条件下的检测需要。 0005 RPA技术近年新出现的很有临床应用潜力的等温核酸检测技术。 RPA技术依赖重组 酶、 单链结合蛋白和链置换聚合酶的共同作用在常温下就可以进行核酸的扩增， 可以在非 常短的时间内使目的基因以指数级增长， 配合标记探针和侧流层析技术便可实现对扩增产 物的现场实时监测， 不需任何专业的仪器设备， 并且简便快速， 非常适于现场或田间使用， 可以在家庭、 宠物门诊或养殖场内进行病原的检测， 对于疾病的诊断和防控具有重大的临 床应用价值， 具有广阔的应用前景。 0006 目前国内外还。
11、没有利用RPA技术和侧流层析技术对副猪嗜血杆菌进行检测。 发明内容 0007 为了解决现有副猪嗜血杆菌确诊中需要昂贵的仪器设备、 试剂或费时的问题， 本 发明提供一种可检测猪关节液、 脓液、 腹腔渗出液及肺脏组织液的即时、 简便和快速的核酸 检测方法。 0008 本发明是通过以下技术方案实现的。 0009 一种用于检测副猪嗜血杆菌的RPA引物和RPA探针， 所述的RPA引物包括正向引物 为infBRPAF， 其序列为： 说 明 书 1/4 页 3 CN 109593869 A 3 0010 CATTGAATCAGCWGGYCCATCAATTCCTGTGGA， 0011 反向引物为infBRPA。
12、B， 其序列为： 0012 Bio-CACTTTTACTTCTGCCGTTGAAAGCTCGTGTAAA， 0013 其中基于RPA引物扩增区域设计的RPA探针为infBRPAP， 其序列为： 0014 FITC-ACTTTCAGGCGTACCAGCCGCAGGTGATGAAGHGACAGTGGTGCGTGAT-C3 spacer。 0015 本发明还提供一种用于检测副猪嗜血杆菌的RPA试剂盒， 其包括上述的RPA引物和 RPA探针， 具体地， 其还包括： (1)样品处理液： 0.2M KOH溶液； (2)检测反应液： 50mM pH7.9的 Tris-HCl； 100mM的乙酸钾； 2mM的。
13、二硫苏糖醇； 3mM的腺嘌呤核苷三磷酸； 20mM的磷酸肌酸； 5 g的肌酸激酶； 5质量分数的聚乙二醇， 200 M的脱氧核糖核苷三磷酸， RPA引物， 14mM的醋 酸镁； (3)干粉管： 3.75 g冻干的重组酶uvsX、 750ng冻干的重组酶uvsY、 30 g的单链结合蛋 白、 900ng链置换聚合酶； (4)侧流试纸条； (5)阳性对照反应液： 副猪嗜血杆菌infB基因片 段； 10mM pH8.0的TE缓冲液； (6)阴性对照反应液： 10mM pH8.0的TE缓冲液； (7)上样处理液： 0.01M pH为7.3的PBST缓冲液； (8)吸管； (9)无菌注射器， 上述物质的。
14、浓度为在各试剂中的 终浓度。 0016 本发明还提供一种检测副猪嗜血杆菌的核酸检测方法， 包括以下操作步骤： 0017 (1)样品处理： 用无菌注射器采取待检猪关节液、 脓液、 腹腔液或肺脏组织液， 往 3ml样品处理液中滴加0.05ml， 充分振荡混匀后得到样品处理液； 0018 (2)扩增： 在干粉管中滴加0.05ml检测反应液， 然后加入用微量吸管吸取的定量样 品处理液5ul， 同时设立阳性及阴性对照， 混匀， 将干粉管置于操作者腰带下反应20分钟， 得 到反应液； 0019 (3)判定： 反应完成后用吸管吸取0.01ml的反应液加入到2ml上样处理液中混匀， 然后将侧流试纸条放入上样处。
15、理液中进行结果测定， 5分钟后观察判定结果： 如阴性对照样 品中的侧流试纸条只在C的位置上出现条带， 阳性对照样品中的侧流试纸条在C和T的位置 上都出现条带， 表明试验成立， 检测样品中的侧流试纸条的条带和阳性对照样品一样出现 两个条带为阳性， 表明待检猪中含有副猪嗜血杆菌； 和阴性对照样品一样出现一个条带为 阴性， 表明待检猪中不含有副猪嗜血杆菌。 0020 由以上的技术方案可知， 本发明的有益效果是： 0021 本发明提供的一种用于检测副猪嗜血杆菌的RPA引物、 RPA探针、 试剂盒及核酸检 测方法， 首先将副猪嗜血杆菌样品的简易处理， 再将RPA技术和侧流层析检测有机结合， 通 过设计的。
16、RPA引物、 RPA探针， 可简便、 快速、 准确的进行副猪嗜血杆菌的诊断和检测。 在临床 不需要任何设备就可进行检测， 降低了购买专用仪器设备的成本， 减少了实验室建设的投 入； 操作简便， 普通人员都可以进行检测， 降低了检测的技术门槛， 养殖户、 养殖场和基层兽 医门诊医生都可以检测， 极大便利了应用和推广； 检测快速， 1小时内可以得到检测结果， 能 第一时间采取措施进行治疗处理。 附图说明 0022 图1和图2为患病猪的关节液的检测结果， 其中图1为第一头猪样品的阳性检测结 果， 图2为第二头猪样品的阴性检测结果。 说 明 书 2/4 页 4 CN 109593869 A 4 具体实。
17、施方式 0023 以下实施例用于说明本发明， 但不能用来限制本发明的范围。 实施例中采用的实 施条件可以根据厂家的条件作进一步调整， 未说明的实施条件通常为常规实验条件。 0024 实施例1 0025 一种用于检测副猪嗜血杆菌的RPA引物和RPA探针， 所述的RPA引物包括正向引物 为infBRPAF， 其序列为： 0026 CATTGAATCAGCWGGYCCATCAATTCCTGTGGA， 0027 反向引物为infBRPAB， 其序列为： 0028 Bio-CACTTTTACTTCTGCCGTTGAAAGCTCGTGTAAA， 0029 其中基于RPA引物扩增区域设计的RPA探针为inf。
18、BRPAP， 其序列为： 0030 FITC-ACTTTCAGGCGTACCAGCCGCAGGTGATGAAGHGACAGTGGTGCGTGAT-C3 spacer。 0031 本发明还提供一种用于检测副猪嗜血杆菌的RPA试剂盒， 其包括上述的RPA引物和 RPA探针， 具体地， 其还包括： (1)样品处理液： 0.2M KOH溶液； (2)检测反应液： 50mM pH7.9的 Tris-HCl； 100mM的乙酸钾； 2mM的二硫苏糖醇； 3mM的腺嘌呤核苷三磷酸； 20mM的磷酸肌酸； 5 g的肌酸激酶； 5质量分数的聚乙二醇， 200 M的脱氧核糖核苷三磷酸， RPA引物， 14mM的醋。
19、 酸镁； (3)干粉管： 3.75 g冻干的重组酶uvsX、 750ng冻干的重组酶uvsY、 30 g的单链结合蛋 白、 900ng链置换聚合酶； (4)侧流试纸条； (5)阳性对照反应液： 副猪嗜血杆菌infB基因片 段； 10mM pH8.0的TE缓冲液； (6)阴性对照反应液： 10mM pH8.0的TE缓冲液； (7)上样处理液： 0.01M pH为7.3的PBST缓冲液； (8)吸管； (9)无菌注射器， 上述物质的浓度为在各试剂中的 终浓度。 0032 本发明还提供一种检测副猪嗜血杆菌的核酸检测方法， 包括以下操作步骤： 0033 (1)样品处理： 用无菌注射器采取待检猪关节液、。
20、 脓液、 腹腔液或肺脏组织液， 往 3ml样品处理液中滴加0.05ml， 充分振荡混匀后得到样品处理液； 0034 (2)扩增： 在干粉管中滴加0.05ml检测反应液， 然后加入用微量吸管吸取的定量样 品处理液5ul， 同时设立阳性及阴性对照， 混匀， 将干粉管置于操作者腰带下反应20分钟， 得 到反应液； 0035 (3)判定： 反应完成后用吸管吸取0.01ml的反应液加入到2ml上样处理液中混匀， 然后将侧流试纸条放入上样处理液中进行结果测定， 5分钟后观察判定结果： 如阴性对照样 品中的侧流试纸条只在C的位置上出现条带， 阳性对照样品中的侧流试纸条在C和T的位置 上都出现条带， 表明试验。
21、成立， 检测样品中的侧流试纸条的条带和阳性对照样品一样出现 两个条带为阳性， 表明待检猪中含有副猪嗜血杆菌； 和阴性对照样品一样出现一个条带为 阴性， 表明待检猪中不含有副猪嗜血杆菌。 0036 试验： 0037 用无菌注射器无菌采取2头疑似副猪嗜血杆菌感染的患病猪的关节液， 往盛有3ml 样品处理液的处理管中滴加0.05ml(一滴)， 震荡混匀， 放置5min， 得到样品处理液， 然后用 微量吸管吸取5ul样品处理液， 和检测反应液一起加入干粉管， 混匀后置于操作者腰带下反 应20分钟， 得到反应液， 扩增完成后取反应液0.01ml放入到上样处理液中混匀， 将侧流层析 试纸条插入上样处理液中。
22、， 5分钟后观察结果。 结果阴性和阳性对照都成立， 在检测第一头 猪样品的侧流试纸条上出现了两条检测线， 表明其感染了副猪嗜血杆菌。 该猪样品的关节 说 明 书 3/4 页 5 CN 109593869 A 5 液经常规基因提取、 PCR和电泳检测结果也为阳性。 0038 当然， 上述说明并非是对本发明的限制， 本发明也并不限于上述举例， 本技术领域 的普通技术人员， 在本发明的实质范围内， 作出的变化、 改变、 添加或替换， 都应属于本发明 的保护范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 109593869 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 109593869 A 7 。