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1、10申请公布号CN104080466A43申请公布日20141001CN104080466A21申请号201280058871822申请日20121022102011010822320111021KRA61K36/09200601C07D307/12200601A61K31/341200601A61P3/10200601A61P3/0420060171申请人韩国海洋科学技术院地址韩国京畿道安山市72发明人任挺汉金一赞韩世锺李亨锡吴贤哲74专利代理机构北京律诚同业知识产权代理有限公司11006代理人徐金国54发明名称阻碍蛋白质酪氨酸磷酸酶1B的二萜呋喃类化合物及其用途57摘要本发明涉及一种阻碍蛋。
2、白质酪氨酸磷酸酶1BPTP1B活性的二萜呋喃类化合物及其用途，更具体地涉及一种南极地衣类提取物二萜呋喃DITERPENEFURANOIDS、所述二萜呋喃的制造方法及含有该二萜呋喃作为有效成分的用于治疗型糖尿病的药学组合物及用于降低血糖或改善肥胖的功能食品。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014052986PCT国际申请的申请数据PCT/KR2012/0086852012102287PCT国际申请的公布数据WO2013/058631KO2013042551INTCL权利要求书7页说明书17页附图12页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书7页说明书17页附图1。
3、2页10申请公布号CN104080466ACN104080466A1/7页21一种霍尔克拉里杰拉提取物，其对蛋白质酪氨酸磷酸酶1BPTP1B活性具有阻碍性能。2根据权利要求1所述的霍尔克拉里杰拉提取物，其特征在于其使用选自水、碳原子数为1至4的低级醇及由其混合物构成的群中的溶剂提取。3一种二萜呋喃类DITERPENEFURANOIDS化合物，选自如下化学式1至4构成的群中的任何一种以上。化学式1化学式2化学式3化学式4权利要求书CN104080466A2/7页34一种霍尔普拉诺德HUEAFURANOIDS化合物的分离方法，所述霍尔普拉诺德化合物如下化学式1或化学式2所示，所述分离方法包括如下步。
4、骤化学式1化学式2A使用溶剂提取霍尔克拉里杰拉，所述溶剂选自碳原子数为1至4的低级醇及由其混合物构成的群中；B将在A步骤中提取的霍尔克拉里杰拉提取物利用柱层析在70V/V甲醇水溶液甲醇水7030中进行洗脱；以及，C将在上述B步骤中洗脱的划分物利用反相高效液相色谱法在2060V/V乙腈CH3CN水溶液CH18CN水20608040中分离得出如下化学式1及2所示的化合物。5一种霍尔普拉诺德化合物的分离方法，所述霍尔普拉诺德化合物如下化学式3或化学式4所示，所述分离方法包括如下步骤化学式3权利要求书CN104080466A3/7页4化学式4A使用溶剂提取霍尔克拉里杰拉，所述溶剂选自碳数为1至4的低级。
5、醇及由其混合物构成的群中；B将在A步骤中提取的霍尔克拉里杰拉提取物利用柱层析在75V/V甲醇水溶液甲醇水7525中进行洗脱；以及，C将在上述B步骤中洗脱的分划物利用反相高效液相色谱法在4060V/V乙腈CH3CN水溶液CH3CN水40606040中分离得出如下化学式3及4所示的化合物。6一种含有霍尔克拉里杰拉提取物作为有效成分的用于治疗型糖尿病的药学组合物。7一种含有霍尔克拉里杰拉提取物作为有效成分的用于治疗肥胖的药学组合物。8一种含有选自如下化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物作为有效成分的用于治疗型糖尿的药学组合物。化学式1化学式2权利要求书CN104080466A4/7页5。
6、化学式3化学式49一种含有选自如下化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物作为有效成分的用于治疗肥胖的药学组合物。化学式1化学式2权利要求书CN104080466A5/7页6化学式3化学式410一种含有霍尔克拉里杰拉提取物作为有效成分的用于降低血糖的功能食品。11一种含有霍尔克拉里杰拉提取物作为有效成分的用于改善肥胖的功能食品。12一种含有选自如下化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物作为有效成分的用于降低血糖的功能食品化学式1化学式2权利要求书CN104080466A6/7页7化学式3化学式413一种含有选自如上下化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物作为有。
7、效成分的用于改善肥胖的功能食品化学式1化学式2权利要求书CN104080466A7/7页8化学式3化学式4权利要求书CN104080466A1/17页9阻碍蛋白质酪氨酸磷酸酶1B的二萜呋喃类化合物及其用途技术领域0001本发明涉及一种阻碍蛋白质酪氨酸磷酸酶1BPTP1B活性的二萜呋喃类化合物及其用途，更具体地涉及一种源自南极地衣类霍尔克拉里杰拉HUEACORALLIGERA的二萜呋喃DITERPENEFURANOIDS及含有该化合物作为有效成分的用于治疗型糖尿病的药学组合物及功能食品。背景技术0002糖尿病是一种因胰腺细胞分泌的胰岛素不足或不能发挥其功能，导致葡萄糖不能被吸收并储存在肌肉或肝等。
8、细胞中，而以高浓度存在于血液内后从尿中排出的疾病，一般被认为其有两种形态。0003I型糖尿病是指由于遗传因素、病毒感染等导致胰腺细胞功能降低，几乎不分泌胰岛素的状态，需要注射胰岛素才能调节血糖，因此，又称为胰岛素依赖型糖尿病。0004与此相反，型糖尿病是指体内虽然可生成胰岛素，但胰岛素的活性下降或末梢组织细胞对胰岛素的敏感性减弱，产生胰岛素耐性，血糖调节就会出问题，注射胰岛素也不能有效调节血糖，而需要以降血糖药或饮食疗法调节血糖，因此，又称非胰岛素依赖型糖尿病。这种型糖尿病随着生活水平的提高和整体饮食生活的提高，使摄取的热量大幅度增加，加上缺乏运动和生活暴露于各种精神压力下，导致胰岛素功能下降。
9、，而且，因这种生活习惯引起肥胖，发病率呈现增加的趋势，型糖尿病占糖尿病患者的95以上。0005目前型糖尿病的治疗剂主要使用降血糖药，根据治疗机制及作用药物的作用靶点，可分为磺脲类SULFONYLUREAS药物、双胍类BIGUANIDES药物及噻唑烷二酮类THIAZOLIDINEDIONE药物。磺脲类系是一种主要促进在胰腺细胞中的含有胰岛素的颗粒包移动，以间接促使胰岛素分泌的药物，据报告它会诱发低血糖等严重的副作用，但最近正在开发最小化其副作用的药物。双胍类是一种促使糖移动到肌肉细胞中，并抑制肝生成糖的药物，使用于肥胖的糖尿病患者，但对于老年人和心血管疾病患者要特别注意使用。至于噻唑烷二酮类是最。
10、新开发出的，它能激活属核受体并促进基因转录的因子过氧化物酶体增殖体激活受体PPAR改善胰岛素耐性。但是，仅用口服降糖药无法有效降低血糖，而且大部分已知的药物都表现出副作用，因此，需要开发来自天然物中的更具有安全性的糖尿病治疗剂或预防剂。0006最近发现了型糖尿病与蛋白质酪氨酸磷酸酶1BPROTEINTYROSINPHOSPHATASE1B,PTP1B的关联性，于是人们开始注意到能否把该阻碍物质作为糖尿病治疗剂的可开发性EXPOPTIN,INVEST,DRUGS,8139,1999。据报告，去除蛋白质酪氨酸磷酸酶1B基因后的小鼠对胰岛素表现出敏感性，这显示给小鼠注射胰岛素后在肝和肌肉细胞中增加胰。
11、岛素受体的磷酸化，而且其持续时间比较长，表示蛋白质酪氨酸磷酸酶1B对被激活的胰岛素受体的脱磷酸化起了决定性作用，抑制该酶对治疗型糖尿病非常有效ELCHEVLYETAL,SCIENCE,2831544,1999。另外，有文献报告，抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶1B的物说明书CN104080466A2/17页10质对型糖尿病疾患模型小鼠表现出血糖降下或克服胰岛素耐性等，对治疗型糖尿病有效JMEDCHEM,423199,1999；JBIOLCHEM,27510300,2000。于是要将蛋白质酪氨酸磷酸酶1B抑制剂开发为糖尿病治疗剂的努力正在积极进行NATUREREVIEWDRUGDISCOVERY,1,69。
12、6709。0007蛋白质酪氨酸磷酸酶1BPROTEINTYROSINEPHOSPHATASE1B,PTP1B是主要在胰岛素敏感组织中表达的酶，缺乏PTP1B的小鼠与正常的小鼠相比，可确认其表现出胰岛素过敏性和肥胖抵抗性特征。PTP1B还对具有调节能量积累和消耗功能的瘦素LEPTIN的活性进行调节。缺乏PTP1B的小鼠的肥胖度明显下降，因基础代谢率和总能量消耗的增加，食源性肥胖被抑制。由此可确认，PTP1B在体内作为能量平衡、胰岛素感受性、体脂肪蓄积的主要调节因子。因此，抑制PTP1B可以作为治疗第2型糖尿及肥胖的新方法。有鉴于PTP1B与诸多疾病的生物化学及遗传的相关性，化学合成/医药行业正在。
13、努力开发PTP1B的抑制剂。另一方面，进来，从自然物筛选PTP1B抑制剂的研究也正在开始进行。0008地衣类LICHENS是一种真菌FUNGI和藻类ALGAE及/或蓝藻细菌CYANOBACTERIA的共生复合体，约有17,000余种。曾有人提出将地衣类的次级代谢产物SECONDARYMETABOLITES作为抗菌剂ANTIMICROBIALAGENT或抗食草动物剂ANTIHERBIVOREAGENT使用的方案。而且，一些地衣类提取物曾在民间作为各种治疗剂使用过，并已被发现地衣类代谢产物具有多样的生物活性，包括抗生素ANTIBIOTICAGENT、抗分支杆菌ANTIMYCOBACTERIAL、抗。
14、病毒ANTIVIRAL、止痛ANALGESIC、解热性能ANTIPYRETICPROPERTIES、抗氧化性能ANTIOXIDATIVEPROPERTIES等。于是，地衣类代谢产物作为药物学PHARMACOLOGICALAGENTS的潜在来源受到相当大的关注。0009于此，本发明人等为了解决上述问题，付出不断努力的结果，在从南极地衣类探索抑制PTP1B活性的物质PTP1BINHIBITORYCOMPOUNDS的过程中，按照生物活性追踪分离法BIOASSAYGUIDEDFRACTIONATION对从霍尔克拉里杰拉干燥样品中获取的甲醇提取物进行分离，获得4种新的地衣类代谢产物，再将其分为二萜类DI。
15、TERPENOIDS,14,在提取过程中发现其对PTP1B表现出明显的抑制效果，于是完成了本发明。发明内容0010本发明的目的在于提供二萜呋喃化合物，其从霍尔克拉里杰拉分离得出，阻碍PTP1B的活性。0011本发明的另一个目的在于提供含有上述二萜呋喃化合物DITERPENEFURANOIDS作为有效成分的用于治疗型糖尿病的药学组合物及功能食品。0012为了达到上述目的，本发明提供抑制PTP1B活性的霍尔克拉里杰拉提取物。0013根据本发明，其特征在于上述提取物使用选自水、碳原子数为1至4的低级醇及由其混合物构成的群中的溶剂提取。0014本发明还提供如化学式1至4所示的二萜呋喃DITERPENE。
16、FURANOIDS化合物。0015化学式10016说明书CN104080466A103/17页110017化学式200180019化学式300200021化学式400220023本发明还提供如下化学式1或如下化学式2所示化合物的分离方法，其包括如下步骤A使用溶剂提取霍尔克拉里杰拉，该溶剂选自碳原子数为1至4的低级醇及由其混合物构成的群中；B将在A步骤中提取的霍尔克拉里杰拉提取物利用柱层析在70V/V甲醇水溶液甲醇水7030中进行洗脱；以及，C将在上述B步骤中洗脱的划分物利用反相高效液相色谱法在2060V/V乙腈CH3CN水溶液CH3CN水20608040中分离得出如下化学式1及2所示的化合物。。
17、0024化学式1说明书CN104080466A114/17页1200250026化学式200270028本发明还提供如下化学式3或如下化学式4所示化合物的分离方法，其包括如下步骤A使用溶剂提取霍尔克拉里杰拉，其中该溶剂选自碳数为1至4的低级醇及由其混合物构成的群中；B将在A步骤中提取的霍尔克拉里杰拉提取物利用柱层析在75V/V甲醇水溶液甲醇水7525中进行洗脱；以及，C将在上述B步骤中洗脱的划分物利用反相高效液相色谱法在4060V/V乙腈CH3CN水溶液CH3CN水20608040中分离得出如下化学式3及4所示的化合物。0029化学式300300031化学式40032说明书CN10408046。
18、6A125/17页130033本发明还提供含有霍尔克拉里杰拉提取物作为有效成分的用于治疗型糖尿病的药学组合物。0034本发明还提供用于制造型糖尿治疗剂的霍尔克拉里杰拉提取物的用途。0035本发明还提供利用霍尔克拉里杰拉提取物治疗型糖尿的方法。0036本发明还提供含有霍尔克拉里杰拉提取物作为有效成分的用于治疗肥胖的药学组合物。0037本发明还提供用于治疗肥胖的霍尔克拉里杰拉提取物的用途。0038本发明还提供利用霍尔克拉里杰拉提取物治疗肥胖的方法。0039本发明还提供含有选自如上述化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物作为有效成分的用于治疗型糖尿的药学组合物。0040本发明还提供选自如。
19、上述化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物对治疗型糖尿的用途。0041本发明还提供利用选自如上述化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物治疗型糖尿的方法。0042本发明还提供含有选自如上述化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物作为有效成分的用于治疗肥胖的药学组合物。0043本发明还提供选自如上述化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物对治疗肥胖的用途。0044本发明还提供利用选自如上述化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物治疗肥胖的方法。0045本发明还提供含有霍尔克拉里杰拉提取物作为有效成分的用于降低血糖或改善肥胖的功能食品。0046本。
20、发明还提供含有选自如上述化学式1至4所示的化合物群中的任何一种以上的化合物作为有效成分的用于降低血糖或改善肥胖的功能食品。附图说明0047图1是双倒数LINEWEAVERBURK作图，显示霍尔普拉诺德霍尔普拉诺德A化学式1的化合物导致蛋白质酪氨酸磷酸酶1BPTP1B活性降低的运动分析。0048图2是霍尔普拉诺德A化学式1的化合物的1HNMR图谱。0049图3是霍尔普拉诺德A化学式1的化合物的13CNMR图谱。0050图4是霍尔普拉诺德A化学式1的化合物的COSY图谱。0051图5是霍尔普拉诺德A化学式1的化合物的HMQC图谱。0052图6是霍尔普拉诺德A化学式1的化合物的HMBC图谱。0053。
21、图7是霍尔普拉诺德A化学式1的化合物的QCTOCSY图谱。0054图8是霍尔普拉诺德A化学式1的化合物的NOESY图谱。0055图9是霍尔普拉诺德B化学式2的化合物的1HNMR图谱。0056图10是霍尔普拉诺德B化学式2的化合物的13CNMR图谱。0057图11是霍尔普拉诺德B化学式2的化合物的COSY图谱。0058图12是霍尔普拉诺德B化学式2的化合物的HMQC图谱。说明书CN104080466A136/17页140059图13是霍尔普拉诺德B化学式2的化合物的NOESY图谱。0060图14是霍尔普拉诺德C化学式3的化合物的1HNMR图谱。0061图15是霍尔普拉诺德C化学式3的化合物的13。
22、CNMR图谱。0062图16是霍尔普拉诺德C化学式3的化合物的COSY图谱。0063图17是霍尔普拉诺德C化学式3的化合物的HMQC图谱。0064图18是霍尔普拉诺德C化学式3的化合物的NOESY图谱。0065图19是霍尔普拉诺德D化学式4的化合物的1HNMR图谱。0066图20是霍尔普拉诺德D化学式4的化合物的13CNMR图谱。0067图21是霍尔普拉诺德D化学式4的化合物的COSY图谱。0068图22是霍尔普拉诺德D化学式4的化合物的HMQC图谱。0069图23是霍尔普拉诺德D化学式4的化合物的NOESY图谱。具体实施方式0070本发明在一方面涉及具有阻碍蛋白质酪氨酸磷酸酶1B活性性能的霍。
23、尔克拉里杰拉提取物。0071根据本发明的霍尔克拉里杰拉提取物可以将南极地衣类之一种的霍尔克拉里杰拉按照通常的提取方法制造。0072根据本发明，用于提取霍尔克拉里杰拉的溶剂可以使用选自水、碳数为1至4的低级醇及由这些混合物组成的群中的溶剂。上述碳原子数为1至4的低级醇可以包括甲醇、乙醇、丙醇，丁醇等，优选使用甲醇或甲醇水溶液。此时，霍尔克拉里杰拉可以原样使用或粉碎后使用，所用到的溶剂使用量可以每按干燥后的霍尔克拉里杰拉100G使用01至5L。用于提取的温度可以是4至120，但并不局限于此。而且，提取时间可以是10至30分钟，但并不特别限定，并可以利用通常的提取装置、超声粉碎提取装置或划分装置。制。
24、造的提取物可以经过减压过滤及/或冻干而除去溶剂。0073本发明在另一方面涉及阻碍PTP1B活性的二萜呋喃类DITERPENEFURANOIDS化合物。0074本发明的二萜呋喃类DITERPENEFURANOIDS化合物是利用层析从霍尔克拉里杰拉提取物洗脱分离得到的。0075如下化学式1或化学式2所示的二萜呋喃类DITERPENEFURANOIDS化合物的分离方法包括如下步骤A使用溶剂提取霍尔克拉里杰拉，其中该溶剂选自碳数为1至4的低级醇及由其混合物构成的群中；B将在A步骤中提取的霍尔克拉里杰拉提取物利用柱层析在70V/V甲醇水溶液甲醇水7030中进行洗脱；以及C将在上述B步骤中洗脱的划分物利用。
25、反相高效液相色谱法在2060V/V乙腈CH3CN水溶液CH3CN水20608040中分离出如下化学式1及2所示的化合物。0076化学式10077说明书CN104080466A147/17页150078化学式200790080如下化学式3或如下化学式4所示的二萜呋喃类DITERPENEFURANOIDS化合物的分离方法包括如下步骤A使用溶剂提取霍尔克拉里杰拉，其中该溶剂选自碳数为1至4的低级醇及由其混合物构成的群中；B将在A步骤中提取的霍尔克拉里杰拉提取物，利用柱层析在75V/V甲醇水溶液甲醇水7525中进行洗脱；以及C将在上述B步骤中洗脱的划分物利用反相高效液相色谱法在4060V/V乙腈CH3。
26、CN水溶液CH3CN水40606040中分离出如下化学式3及4所示的化合物。0081化学式300820083化学式40084说明书CN104080466A158/17页160085这些化合物的结构是通过NMR和MS资料分析以及与现有文献比较来表明的。化合物1对治疗上的靶蛋白PTP1BIC50130UM表现出阻碍活性。通过霍尔普拉诺德A对PTP1B的阻碍活性的动态分析可以确认二萜呋喃类是PTP1B的非竞争性抑制剂。0086根据资料，至今已经发现约有1,000多种的地衣类代谢产物，大部分是经过聚酮生物合成途径生成的酚醛系化合物类。地衣类还被认为经过甲羟戊酸途径MAVALONATEPATHWAY生产。
27、萜类TERPENOIDS。三萜类TRITERPENES如ZEROIN经常使用为地衣类代谢产物，与此相比二萜类DITERPENES的提取比较罕见。而且，霍尔普拉诺德是被报告为来自HUEA属HUEASP的第一个次级代谢产物，发现这种作用于生物体的代谢产物证明了南极地衣类作为自然物质能成为重要资源。0087本发明在另一方面涉及含有霍尔克拉里杰拉提取物作为有效成分的用于降低血糖或抑制肥胖的药学组合物及含有选自上述化学式1至4所示的化合物构成的群中的任何一种以上的化合物作为有效成分的用于治疗型糖尿病的药学组合物。0088根据本发明的用于降低血糖或抑制肥胖的药学组合物可以包含选自上述霍尔克拉里杰拉提取物、。
28、优选霍尔普拉诺德AD，以及由这些混合物组成的群中的化合物作为有效成分，另外，根据剂型、使用方法及使用目的更可以包括药学上可接受的载体、赋形剂以及稀释剂。如果作为混合物提供时，上述有效成分在用于治疗型糖尿或肥胖的药学组合物中可以包含有0001至999重量，但较佳地通常按01至50重量的含量包含在其中。0089根据本发明，可以提供用于制造型糖尿治疗剂或肥胖治疗剂的霍尔克拉里杰拉提取物的用途，还可以提供利用霍尔克拉里杰拉提取物治疗型糖尿病或肥胖的方法。0090上述用于治疗糖尿或肥胖的药学组合物，可以分别根据常规的方法使其剂型化，包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆、气雾剂等的口服剂型、。
29、外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态。可以包括在含有化合物的组合物中的载体、赋形剂及稀释剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻朊酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油。当使其剂型化时，使用一般的稀释剂或赋形剂如填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等。用于口服的固体类药剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂和胶囊剂等，这些固体制剂在上述化合物中混合至少一种以上的赋形剂来制备，例如淀粉、碳酸钙CALCIUMCARBONATE、蔗糖SUCROSE或乳糖LAC。
30、TOSE、明胶等。而且，除了常规使用的简单的赋形剂以外，还可以使用润滑剂如硬脂酸镁、滑石等。用于口服的液状制剂有悬浮剂、内用液剂，乳剂、糖浆剂等，除了常用的简单的稀释剂如水、液状石蜡以外，还可以包括各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于非口服给药的制剂包括灭菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂。对于非水性溶剂和悬浮剂，可以使用丙二醇PROPYLENEGLYCOL,聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射的酯等。对于栓剂基剂可以使用威泰索尓WITEPSOL、聚乙二醇说明书CN104080466A169/17页17MACROGOL、吐温TWEEN61，可可脂、三月桂。
31、酸甘油酯LAURINUM、甘油明胶等。0091另外，上述用于降低血糖或抑制肥胖的药学组合物对人体的给药量虽然根据患者的状态及体重、疾病程度、药物形态、给药途径及期间有所不同，但可以由本领域普通技术人员适当选择。为了较佳效果，本发明的化合物按每天给药00001至100MG/KG，较佳地按0001至10MG/KG给药。可以一天给药一次，也可以分几次给药。上述给药量在任何方面并不限定本发明的范围。0092本发明在另一方面涉及含有霍尔克拉里杰拉提取物作为有效成分的用于降低血糖或抑制肥胖的功能食品及含有选自上述化学式1至4所示的化合物构成的群中的任何一种以上的化合物作为有效成分的用于治疗型糖尿病的功能食。
32、品。0093霍尔克拉里杰拉提取物及选自上述化学式1至4所示的化合物中的任何一种以上的化合物可以为降低血糖的目的或抑制肥胖的目的添加于食品中。为开发功能食品可以添加上述化合物的食品包括肉类、饮料、巧克力、小吃类、饼干类、皮萨、泡面、其他面类、口香糖、冰淇淋类、酒精饮料类、维他命复合剂、保健食品类等。0094上述食品中按001至50重量，优选按005至10重量的量加入上述化学式1至4的霍尔普拉诺德类混合制备，对动物给药时可以降低血糖或改善肥胖。0095实施例0096以下，通过实施例对本发明进行详细说明。以下实施例仅为例示本发明，而并不限定本发明的保护范围，这对本领域普通技术人员来说也是清楚的。00。
33、97实施例1霍尔克拉里杰拉提取物的制备0098霍尔克拉里杰拉采自世宗南极乔治王岛KINGGEORGEISLAND的世宗基地S62133,W58470周围的BARTON半岛上，并被识别，凭证标本VOUCHERSPECIMEN保存于韩国极地研究所中。0099将采集的霍尔克拉里杰拉的干燥样品50G用甲醇9L提取24小时后，减压浓缩，得到了甲醇粗提取物CRUDEMEOHEXTRACT697G。0100实施例2从HUEA种提取物分离化合物0101将在上述实施例1中制备的霍尔克拉里杰拉的甲醇粗提取物697G加入于C18功能性闪式硅胶柱层析C18FUNCTIONALIZEDSILICAGELFLASHCOL。
34、UMNCHROMATOGRAPHY,3X15CM,ALDRICH中后，按每500ML水分别加入20、40、60、70、80、90及100V/V甲醇混合溶剂，分别获得了划分物。再将使用80甲醇水溶液洗脱的划分物置于C18功能性闪式硅胶柱层析C18FUNCTIONALIZEDSILICAGELFLASHCOLUMNCHROMATOGRAPHY中后，按每100ML水依次分别加入50、55、60、70、75、80、85、90、95及100V/V甲醇混合溶剂，分别获得了划分物。0102使用70甲醇水溶液洗脱的划分物，将含有01甲酸FORMICACID的乙腈CH3CN水溶液按20至60浓度使用的混合溶剂加。
35、入于半制备反相高效SEMIPREPARATIVEREVERSEPHASEHPLC中80分钟以上，分离出化学式1的化合物17MG；TR48MIN及化学式2的化合物09MG；TR49MIN。0103另外，将使用75甲醇洗脱的划分物，加入于半制备反相高效SEMIPREPARATIVEREVERSEPHASEHPLC中后，使用约80分钟按40至60浓度使用含有01甲酸FORMICACID的乙腈CH3CN水溶液的混合溶剂，分离出化学式3的化合物13MG；TR41MIN说明书CN104080466A1710/17页18及化学式4的化合物03MG；TR44MIN。0104实施例3划分化合物的结构分析0105。
36、从上述实施例2中，根据生物活性追踪划分法BIOASSAYGUIDEDFRACTIONATION划分出4种新的地衣类代谢产物，为了查究所划分化合物的化学结构，测定并分析了NMR及HRESIMS数据，对于NMR数据，分析了1HNMR谱及13CNMR图谱，将其分为二萜类DITERPENOIDS,14。0106对于本发明人等新发现的化学式1至4的化合物的结构分析及物性等测定结果如下010731化学式1的化合物霍尔普拉诺德A0108化学式101090110表10111在CD3OD中霍尔普拉诺德HUEAFURANOIDA1的NMR数据0112说明书CN104080466A1811/17页190113A在1。
37、00MHZ条件记录；B在400MHZ条件记录0114图2至图8是分别表示化学式1之化合物的1HNMR图谱、13CNMR图谱、COSY图谱、HMQC图谱、HMBC图谱及NOESY图谱结果的图表。0115HUEAFURANOIDA化合物1如通过正离子高分辨电喷雾质谱HRESIMSM/Z3372383MH；04MMU所预测，具有C20H32O4的分子式，这是基于利用1H核磁共振装置NMR及13CNMR进行测定并分析的数据表明出来的表1，图2及图3。由此可以预测5个阶段的不饱和性，并在CD3OD中，1HNMR及DEPT图谱表明在两个羟基的存在下，其结构具有5个甲基、一个烯亚甲基1120、4个SP3亚甲。
38、基及一个氧化的甲烷OXYGENATEDMETHANE。相当于上述碳的信号和13CNMR图谱表明了其结构由酮羰基KETONECARBONYLGROUP2031、一个SP2季碳原子QUATERNARYCARBON1572及3个SP3氧化的季碳QUATERNARYOXYGENATEDCARBONS737,747及842构成。因此，构成4个分子式的5个阶段的不饱和性可以通过分析13CNMR资料来直接类推，并能预测进一步的环结构RINGSYSTEM在化合物1中的存在。化合物1的2级结构主要基于2DNMR资料进行预测，通过1H1HCOSY及HMQCTOCSY的数据分析确认亚甲基C12及甲基C18、C19和。
39、C20的同时，确认了相当于C1C2、C4C6、C8C10及C14C17基础结构SUBSTRUCTURE的质子之间的网络。在化合物1的HMBC图谱中观察到的质子碳的相关关系，对于通过COSY及HMQCTOCSY的数据预测的基本单元SUBUNIT成为确切的证据。通过由用于调说明书CN104080466A1912/17页20查对H24的信号的同核去耦实验HOMONUCLEARDECOUPLINGEXPERIMENT获得的JH，HVALUEH5DH565/H6DH566158HZ确认了二基取代的E双键在C5C6中的存在图4及图5。并确认了不但在H1和C3之间的HMBC相关关系，在C2、C3及C4和H3。
40、20之间的HMBC相关关系也有C1至C2和C4至C6的基本单元键合于C3上图6。而且，还确认除了C7和H5之间的相关关系外，C6、C7及C8和H319之间的HMBC相关关系与包含有2个季碳、C3和C7的甲基同样与C1至C10的碳骨骼延伸有关。分离的亚甲基H212和C10、C11、C13、C14和C18之间的、H318与C10、C11和C12之间的、以及H14和C13之间的HMBC相关关系决定了分子上的最终碳结构。0116在此观点上，两个羟基和氧原子还在保留着。要说通过C3、C7、C10及C11的化学位移确定碳会与氧结合，还没有证据确认羟基的位置和醚环化。因此，化合物1的整体结构是通过化学位移与。
41、现有文献中相关碳进行比较来提出的。通过调查13CNMR对于多数具有与化合物1类似结构特征的天然物质中表现出的化学位移，确认了二氢呋喃DIHYDROFURAN的氧化碳在80PPM以上处有共振，而包含有线形碳骨骼氢基的季碳在80PPM以下处有共振。0117由此可确认，C7842及C10857与氧原子结合以形成四氢呋喃TETRAHYDROFURAN环结构，C3及C11则含有羟基以完成化合物1的结构。至于在C7及C10中立体中心的相对位置，能通过对于在环结构上位于同侧的H10和H18及H19的NOESY分析的相关关系预测来确认图7及图8。011832化学式2的化合物霍尔普拉诺德B0119化学式2012。
42、00121表20122在CD3OD中霍尔普拉诺德B2的1H及13CNMR数据01230124说明书CN104080466A2013/17页210125A在100MHZ条件记录；B在400MHZ条件记录0126图9至图13是分别表示化学式2的化合物的1HNMR图谱、13CNMR图谱、COSY图谱、HMQC图谱、HMBC图谱及NOESY图谱结果的图表。0127通过HRESIMS图谱M/Z3372374MH；D05MMU可确认霍尔普拉诺德B化合物B的分子式与化合物1相同。通过DEPT及13CNMR数据确认了化合物2的甲基、亚甲基及季碳原子数与化合物1相同表1及表2。至于1HNMR及13CNMR图谱表。
43、2，除了根据C5、C6、C8及C9位置的每个不同化学位移以外的其它部分与化合物1几乎相同图9及图10。这意味着化合物2是霍尔普拉诺德A化合物1的立体异构体STEREOISOMER，通过1D、COSY及HSQCNMR数据的详细分析，确认了化合物2具有与化合物1相同的线形结构表2、图11及12。C5C6的二基取代的双键位置相当于E基于JH,HVALUEH5DH562/H6DH548157HZ。通过CH318和CH319之间的NOESY相关关系，确认了两个甲基位置如四氢呋喃环结构的形态存在图13。因此，化合物2的整体结构如图所示。012833化学式3的化合物霍尔普拉诺德C0129化学式3013001。
44、31表3说明书CN104080466A2114/17页220132在CD3OD中霍尔普拉诺德C3的1H及13CNMR数据01330134A在100MHZ条件记录；B在400MHZ条件记录0135图14至图18是分别表示化学式3之化合物的1HNMR图谱、13CNMR图谱、COSY图谱、HMQC图谱、HMBC图谱及NOESY图谱结果的图表。0136通过HRESIMS图谱确认，霍尔普拉诺德C化合物3具有比化合物1和化合物2多两个氢原子的C20H34O4的分子式。这意味着化合物3具有比化合物1和化合物2少一个的烯烃基团OLENICGROUP。通过化合物3的1HNMR数据确认，除了烯丙基甲基单峰ALLY。
45、LICMETHYLSINGLETS,CH316及CH317被替代为一对甲基二重峰METHYLDOUBLET,D091的部分以外，其余都类似于化合物1，并附加有相当于脂肪族亚甲基ALIPHATICMETHYLENE,D242和次甲基D210的信号表3及图14。并确认了13CNMR图谱中缺少由化合物1的数据观察到的两个SP2碳原子1573AND1265，但多加有对SP3碳原子549AND254的共振图15。0137综上所述，通过HSQC及COSY数据确认了化合物1的C14C15烯烃在化合物2中被除掉，对于化合物3中每个构成因素的化学位移CHEMICALSHIFT与化合物1进行了比较，化合物3的相对。
46、位置则通过NOESY数据分析来确认了图16及17。通过由NOESY分析出的H3和H319的相关关系，可以预测所有质子都位于环结构的同一侧面上图18。由此可确认，化合物3具有相对排列结构如化合物1的四氢呋喃环状结构。说明书CN104080466A2215/17页23013834化学式4的化合物霍尔普拉诺德D0139化学式401400141表40142在CD3OD中霍尔普拉诺德D4的1H及13CNMR数据014301440145A在100MHZ条件记录；B在400MHZ条件记录0146图19至图23是分别表示化学式3的化合物的1HNMR图谱、13CNMR图谱、COSY图谱、HMQC图谱、HMBC图。
47、谱及NOESY图谱结果的图表。0147通过霍尔普拉诺德D化合物4的NMR数据确认，化合物4具有与化合物3相同的分子式表4。在1HNMR图谱中第一个差异在于H5和H6信号与其在化合物3中有说明书CN104080466A2316/17页24明显的区别。细心调查化合物1至3的1HNMR图谱的结果确认，化合物4中包含有与化合物3的四氢呋喃环状结构上的右侧方面几乎相同的信号，而包含有与相当于化合物2的环状结构左侧的1HNMR信号几乎相同的信号图19及20。通过这些观察可知，化合物4的结构具有与化合物2相同的立体结构，对于C14C15烯烃意味着其为被还原的物质。这种化合物4的结构通过HSQC、COSY及N。
48、OESY数据分析得以证明了图21、22及23。0148实施例4对PTP1B阻碍活性的确认0149PTP1BHUMAN,RECOMBINANT由BIOMOLRESEARCHLABORATORIES，INC购得，用于实验，酶活性使用对硝基苯磷酸酯PNITROPHENYLPHOSPHATE作为基质进行测定。为了进行阻碍反应，抑制剂按最终体积100UL在缓冲溶液50MMCITRATEPH55,01MNACL,1MMEDTA及1MMDTT中添加PTP1B00501UL和含有PNPP的反应混合物来制备。反应混合物在30的培养器中放置30分钟后，加入10UL的10MNAOH溶液，使反应终了。对所生成的对硝基。
49、苯酚PNITROPHENOL的量在405NM处测定其吸光度来进行评估，对2MMPNPP的非酶水解，在没有PTP1B的状态之下，通过在405NM处测定吸光度来进行评估。为了分析反应速度KINETICANALYSIS，反应混合物根据化合物1的有无，构成不同PNPP浓度作为PTP1B基质，并进行了分析试验如下0150霍尔普拉诺德A化合物1按不同浓度对于IC50139UMPTP1B活性表现出阻碍效果。对于化合物1至4的阻碍活性因缺乏物质没能进行评估。测定时，使用了已知的PTP1B抑制剂乌苏酸URSOLICACID,IC50308UM作为阳性对照群POSITIVECONTROL，并为了测定化合物1引起的PTP1B抑制反应速度，基质按不同浓度进行反应。将对硝基苯磷酸酯PNITROPHENYLPHOSPHATE作为基质使用时，化合物1虽然使VMAX值减少了，但PTP1B的KM值没有改变图2。由此可确认，HUEAFURANOIDA化合物1能作用为PTP1B的非竞争性抑制剂，HUEAFURANOID可能在酶基质复合体或PTP1B内结合于变构部位AL。