一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103913538 A (43)申请公布日 2014.07.09 CN 103913538 A (21)申请号 201410169129.5 (22)申请日 2014.04.24 G01N 30/88(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (71)申请人 江苏太湖地区农业科学研究所 地址 215155 江苏省苏州市相城区望亭镇北 桥 (72)发明人 张丽 陆皓茜 董明辉 杨代凤 邓金花 顾俊荣 刘腾飞 钱辉 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 马明渡 (54) 发明名称 一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法。

2、 (57) 摘要 一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方 法， 其特征在于 ： 茶鲜叶试样用含体积分数为 1% 乙酸的乙腈溶液超声提取， 再用适量 PSA、 C18 和 GCB 混合填料净化， 上清液氮吹浓缩至近干， 用丙 酮溶解定容， DB-1701 石英毛细管柱程序升温分 离， GC/FPD 检测， 最后用基质外标法定量。通过试 验确证， 该方法线性范围宽， 检测灵敏度、 准确度 及精密度等技术指标均满足残留分析的要求， 并 且前处理操作简单、 方便快速， 为测定茶鲜叶中有 机磷类农药残留的分析研究提供了可靠的手段。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 1 页 。

3、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103913538 A CN 103913538 A 1/2 页 2 1. 一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法， 其特征在于 ： 所述定量检测方法有两 部分组成 ： 第一部分， 用气相色谱法建立已知梯度浓度的被测的有机磷农药的标准曲线 ； 所述标 准曲线的建立由以下步骤组成 ： 第一步， 制备空白基质提取液， 制备方法由以下步骤组成 ： （1） 称取 5.0 g 经测定不含被测的有机磷农药的空白茶鲜叶样品， 置于 50 mL 离心管 中， 再向离心管中加入 10 mL。

4、 含体积分数为 1% 乙酸的乙腈溶液， 混匀， 超声提取 10 15 min， 再加入 2 g 无水乙酸钠和 1 g 无水硫酸镁， 涡旋 1.5min2.5min， 然后， 以 9000 r/min 的转速离心 3.5min4.5min， 取上清液即为待净化的空白基质提取液 ； （2） 另取一支10 mL离心管， 加入0.15g C18、 0.15g N-丙基乙二胺、 0.12 g 石墨化碳黑 和 0.3g 无水硫酸镁， 加入 4mL 所述待净化的空白基质提取液， 涡旋 1.5min2.5min， 以 9000 r/min 的转速离心 4.5min5.5min ； 离心后移取 2.0 mL 上。

5、清液至刻度试管中， 再在 50 60水浴下将上清液用氮气缓慢吹至 5070L ； 再在上清液中加入丙酮以定容至 1.0 mL， 过有机系滤膜后， 得到用于配制有机磷农药的空白基质提取液 ； 第二步， 以所述第一步中得到的空白基质提取液为溶剂配制有机磷农药的基质混合标 准工作溶液， 其中， 所述有机磷农药是指敌敌畏、 乐果、 毒死蜱、 甲基对硫磷、 马拉硫磷、 杀螟 硫磷、 三唑磷 ； 所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各有机磷农药的浓度范围为 ： 第三步， 用气相色谱法测定所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各农药组分的 色谱峰保留时间和色谱峰面积， 以色谱峰保留时间定性， 然后以质量浓。

6、度为横坐标， 以色谱 峰面积为纵坐标绘制出有机磷农药的标准曲线 ； 其中， 测定有机磷农药的色谱条件为 ： 色谱柱 ： 型号为 DB-1701 的毛细管色谱柱， 规格为 30m0.32mm0.25m ； 进样量 ： 1.0L， 不分流进样 ； 进样口温度 ： 220， 隔垫吹扫 3mL/min ； 柱温 ： 初始温度 90， 保持 1min， 20 /min 升至 200， 保持 9min， 30 /min 升至 245， 保持 8min ； 载气 ： 高纯氮气， 纯度 99.999% ； 恒流模式， 流速 3mL/min ； 检测器 ： 火焰光度检测器 ； 检测器温度 ： 245 ； 氢气 。

7、： 流量为 75 mL/min ； 空气 ： 流量为 100 mL/min ； 尾吹气 ： 高纯氮气， 流量为 60mL/min ； 权 利 要 求 书 CN 103913538 A 2 2/2 页 3 第二部分， 测定茶鲜叶样品中所述第一部分中的 7 种有机磷农药残留量， 定量检测方 法包括以下步骤 ： 第一步， 对茶鲜叶样品进行提取 ； 称取已粉碎的茶鲜叶样品， 置于 50 mL 离心管中， 再加入含体积分数为 1% 乙酸的乙腈 溶液， 其中， 所述茶鲜叶样品与所述乙腈溶液的投入比为向每 0.5g 茶鲜叶样品中投入 1mL 乙腈溶液， 混匀， 超声提取 10 15 min ； 再加入无水乙。

8、酸钠和无水硫酸镁， 其中， 所述茶鲜 叶样品、 无水乙酸钠以及无水硫酸镁三者的质量比为 5:2:1， 涡旋 1.5min2.5min， 以 9000 r/min 的转速离心 3.5min4.5min， 取上清液即为待净化的茶鲜叶样品提取液 ； 第二步， 对所述待净化的茶鲜叶样品提取液进行净化 ； 另取一支 10 mL 离心管， 加入 C18、 N- 丙基乙二胺、 石墨化碳黑和无水硫酸镁， 加入所 述待净化的茶鲜叶样品提取液， 其中， 投入的 C18、 N- 丙基乙二胺、 石墨化碳黑以及无水硫 酸镁在待净化的茶鲜叶样品提取液中的含量分别为 37.5mg/mL、 37.5mg/mL、 30 mg/。

9、mL 以 及 75mg/mL， 涡旋 1.5min2.5min， 以 9000 r/min 的转速离心 4.5min5.5min ； 离心后移取 2.0mL 上清液至刻度试管中， 在 50 60水浴下将上清液用氮气缓慢吹至 5070L ； 再在 上清液中加入丙酮以定容至 1.0mL， 过有机系滤膜后， 得到用于测定有机磷农药残留的茶鲜 叶样品提取净化液 ； 第三步， 用气相色谱法测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药残留量， 记录 色谱峰保留时间和色谱峰面积， 通过色谱峰保留时间定性后， 将所述茶鲜叶样品提取净化 液检测出的色谱峰面积与所述第一部分得到的有机磷农药的标准曲线进行比较， 得到。

10、所述 茶鲜叶样品提取净化液中含有的每种有机磷农药的测定值 ； 再将所述测定值带入到定量计 算公式中， 最终得到茶鲜叶样品中待测有机磷农药残留量 ； 定量计算公式 ： =(vf)/m， 式中 ： 为样品中待测有机磷农药残留量， 单位为 mg/kg ； 为测定值， 单位为 mg/L ； m 为称取的样品量， 单位为 g ； v 为定容体积， 单位为 mL ； f 为稀释倍数 ； 其中， 测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药的色谱条件与所述第一部分的 第三步中的有机磷农药的色谱条件相同。 2. 根据权利要求 1 所述的一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法， 其特征在 于 ： 所述第一部分的第。

11、一步和所述第二部分的第一步中超声提取的条件为超声功率在 80W100W 之间， 超声温度在 20 30。 权 利 要 求 书 CN 103913538 A 3 1/9 页 4 一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法 技术领域 0001 本发明涉及农药残留量的检测方法领域， 具体涉及一种茶鲜叶中有机磷类农药的 定量检测方法， 该定量检测方法是采用改进的 QuEChERS 法对茶鲜叶进行提取、 净化， 再用 气相色谱法对有机磷类农药进行检测， 以达到快速、 简便、 可靠的目的。 背景技术 0002 茶叶是世界三大植物饮料之一， 因其独特的口感和具有抗癌、 防突变、 清除自由 基、 延缓衰老等保健功。

12、效越来越受到人们的青睐。 我国是茶叶生产大国也是出口大国， 施用 农药是保证茶叶产量， 控制其生长过程中免受病虫害威胁的最有效的手段， 有机磷类农药 （英文名称 ： Organophosphorus pesticides） 因广谱、 高效、 成本低、 用量少被广泛应用于茶 叶病虫害的防治工作。但是已有研究证实这类农药会对人体的神经系统产生毒害作用， 部 分品种具有致癌、 致畸、 致突变作用以及一定的蓄积性， 过量使用有可能在人体内累积， 造 成慢性蓄积中毒。因此， 关于有机磷类农药在茶叶中的残留一直是人们关注的焦点问题。 0003 国际上许多国家、 特别是欧盟和日本制定了苛刻的农药残留限量法规。

13、， 以限制茶 叶中农药的最大残留限量 （MRL） 。我国国家标准 GB2763-2012食品中农药最大残留限量 规定了茶叶中25种农药的MRL，中华人民共和国农业部公告第199号 规定了21种农药禁 止或限制在茶叶中使用。欧盟在 2008 年 3 月 1 日发布了新的农药残留限量标准法规 （EC） No149/2008， 更新了茶叶中农药残留的 MRL， 新法规涉及茶叶农药残留现行限量标准 221 项， 临时性限量标准 171 项， 共 392 项， 且 90% 以上的农药采用方法检出限作为 MRL。日本于 2006 年 5 月 29 日正式实施食品中农业化学品 “肯定列表制度” ， 该制度中。

14、与茶叶有关的农 药残留限量标准达251项， 且大多数农药的MRL要求不大于0.1mg/kg， 对未设定限量标准的 农药全部则执行 “一律标准” ， 即含量不得超过 0.01mg/kg， 且全部采用 “干茶法” 进行检测。 这在很大程度上限制了我国茶叶的出口， 同时对茶叶中农药残留的检测也提出了更高的要 求。 0004 近年来， 有关茶叶中农药残留的分析方法已有不少研究报道， 但主要集中在成茶 上， 对茶鲜叶中的残留研究的不多。茶鲜叶作为茶叶加工的原料， 是决定茶叶品质的物质 基础， 它的质量好坏直接关系到茶叶品质的优劣。 因此， 直接测定茶鲜叶中的农药残留量具 有重要的现实意义， 不但可以实现。

15、茶叶农药的源头控制， 有效引导农民正确地对茶园用药， 提高饮茶安全性， 而且可以减少农药不合理地使用对茶园土壤环境造成污染。 0005 由于茶鲜叶比成茶含有更多的水分、 色素、 水溶性灰分、 茶多酚等干扰物质， 更容 易造成提取净化困难， 因此现有的测定茶叶中有机磷类农药的检测方法， 不适用于茶鲜叶 基质的测定。国内虽有一些关于茶鲜叶农残的研究工作报道， 但仅涉及六六六、 滴滴涕等 有机氯农药以及少数几种菊酯类农药的检测， 对有机磷等其它类型农药的检测方法研究较 少。而且在茶鲜叶农药残留提取过程中， 现有的报道主要运用传统的振荡提取、 均质提取、 液液萃取等方法， 净化手段针对不同的目标农药多。

16、采用浓硫酸磺化法和柱层析净化法。这 些前处理方法消耗有机溶剂多、 样品通量小、 应用范围有限、 操作繁琐、 耗费时间、 成本高， 说 明 书 CN 103913538 A 4 2/9 页 5 对于多类多残留不是简单或有效的方法。 发明内容 0006 本发明提供一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法， 其目的在于解决现有的 测定茶叶中有机磷类农药的检测方法耗时长、 操作繁琐、 消耗有机溶剂多以及检测结果不 够稳定可靠的问题。 0007 为达到上述目的， 本发明采用的技术方案是 ： 一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量 检测方法， 所述定量检测方法有两部分组成 ： 0008 第一部分， 用气相色谱法建立。

17、已知梯度浓度的被测的有机磷农药的标准曲线 ； 所 述标准曲线的建立由以下步骤组成 ： 0009 第一步， 制备空白基质提取液， 制备方法由以下步骤组成 ： 0010 （1） 称取5.0g经测定不含被测的有机磷农药的空白茶鲜叶样品， 置于50mL离心管 中， 再向离心管中加入10mL含体积分数为1%乙酸的乙腈溶液， 混匀， 超声提取1015min， 再加入2g无水乙酸钠和1g无水硫酸镁， 涡旋1.5min2.5min， 然后， 以9000r/min的转速 离心 3.5min 4.5min， 取上清液即为待净化的空白基质提取液 ； 0011 （2） 另取一支 10mL 离心管， 加入 0.15g 。

18、C18、 0.15g N- 丙基乙二胺、 0.12g 石墨化 碳黑和 0.3g 无水硫酸镁， 加入 4mL 所述待净化的空白基质提取液， 涡旋 1.5min 2.5min， 以 9000r/min 的转速离心 4.5min 5.5min ； 离心后移取 2.0mL 上清液至刻度试管中， 再在 50 60水浴下将上清液用氮气缓 慢吹至 50 70L ； 再在上清液中加入丙酮以定容至 1.0mL， 过有机系滤膜后， 得到用于配制有机磷农药的空白基质提取液 ； 0012 第二步， 以所述第一步中得到的空白基质提取液为溶剂配制有机磷农药的基质混 合标准工作溶液， 其中， 所述有机磷农药是指敌敌畏、 乐。

19、果、 毒死蜱、 甲基对硫磷、 马拉硫磷、 杀螟硫磷、 三唑磷 ； 所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各有机磷农药的浓度范围 为 ： 0013 0014 第三步， 用气相色谱法测定所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各农药组 分的色谱峰保留时间和色谱峰面积， 以色谱峰保留时间定性， 然后以质量浓度为横坐标， 以 色谱峰面积为纵坐标绘制出有机磷农药的标准曲线 ； 0015 其中， 测定有机磷农药的色谱条件为 ： 说 明 书 CN 103913538 A 5 3/9 页 6 0016 色谱柱 ： 型号为 DB-1701 的毛细管色谱柱， 规格为 30m0.32mm0.25m ； 进样 量 ： 。

20、1.0L， 不分流进样 ； 进样口温度 ： 220， 隔垫吹扫 3mL/min ； 柱温 ： 初始温度 90， 保 持 1min， 20 /min 升至 200， 保持 9min， 30 /min 升至 245， 保持 8min ； 载气 ： 高纯 氮气， 纯度 99.999% ； 恒流模式， 流速 3mL/min ； 检测器 ： 火焰光度检测器 ； 检测器温度 ： 245 ； 氢气 ： 流量为 75mL/min ； 空气 ： 流量为 100mL/min ； 尾吹气 ： 高纯氮气， 流量为 60mL/ min ； 0017 第二部分， 测定茶鲜叶样品中所述第一部分中的 7 种有机磷农药残留量，。

21、 定量检 测方法包括以下步骤 ： 0018 第一步， 对茶鲜叶样品进行提取 ； 0019 称取已粉碎的茶鲜叶样品， 置于 50mL 离心管中， 再加入含体积分数为 1% 乙酸的 乙腈溶液， 其中， 所述茶鲜叶样品与所述乙腈溶液的投入比为向每 0.5g 茶鲜叶样品中投入 1mL 乙腈溶液， 混匀， 超声提取 10 15min ； 再加入 无水乙酸钠和无水硫酸镁， 其中， 所述 茶鲜叶样品、 无水乙酸钠以及无水硫酸镁三者的质量比为5:2:1， 涡旋1.5min2.5min， 以 9000r/min 的转速离心 3.5min 4.5min， 取上清液即为待净化的茶鲜叶样品提取液 ； 0020 第二步。

22、， 对所述待净化的茶鲜叶样品提取液进行净化 ； 0021 另取一支 10mL 离心管， 加入 C18、 N- 丙基乙二胺、 石墨化碳黑和无水硫酸镁， 加入 所述待净化的茶鲜叶样品提取液， 其中， 投入的 C18、 N- 丙基乙二胺、 石墨化碳黑以及无水 硫酸镁在待净化的茶鲜叶样品提取液中的含量分别为 37.5mg/mL、 37.5mg/mL、 30mg/mL 以 及 75mg/mL， 涡旋 1.5min 2.5min， 以 9000r/min 的转速离心 4.5min 5.5min ； 离心后移 取 2.0mL 上清液至刻度试管中， 在 50 60水浴下将上清液用氮气缓慢吹至 50 70L ；。

23、 再在上清液中加入丙酮以定容至 1.0mL， 过有机系滤膜后， 得到用于测定有机磷农药残留的 茶鲜叶样品提取净化液 ； 0022 第三步， 用气相色谱法测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药残留量， 记录色谱峰保留时间和色谱峰面积， 通过色谱峰保留时间定性后， 将所述茶鲜叶样品提取 净化液检测出的色谱峰面积与所述第一部分得到的有机磷农药的标准曲线进行比较， 得到 所述茶鲜叶样品提取净化液中含有的每种有机磷农药的测定值 ； 再将所述测定值带入到定 量计算公式中， 最终得到茶鲜叶样品中待测有机磷农药残留量 ； 0023 定量计算公式 ： =(vf)/m， 式中 ： 为样品中待测有机磷农药残留量。

24、， 单 位为 mg/kg ； 为测定值， 单位为 mg/L ； m 为称取的样品量， 单位为 g ； v 为定容体积， 单位为 mL ； f 为稀释倍数 ； 0024 其中， 测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药的色谱条件与所述第一部 分的第三步中的有机磷农药的色谱条件相同。 0025 上述技术方案中的有关内容解释如下 ： 0026 1、 上述方案中， 所述敌敌畏、 乐果、 毒死蜱、 甲基对硫磷、 马拉硫磷、 杀螟硫磷、 三唑 磷这 7 种农药的标准储备液质量浓度均为 1000mg/L， 购于农业部环境保护科研监测所 ； 0027 丙酮为 HPLC 级， 生产厂家为上海国药集团化学试剂有。

25、限公司 ； N- 丙基乙二胺 （英 文简称为 PSA） ， 粒径为 40 60m， 生产厂家为美国 Agela Technologies 公司 ； 石墨化碳 黑 （英文简称为 GCB） ， 粒径 120 400 目， 生产厂家为美国 Agela Technologies 公司 ； C18， 孔径 6nm， 粒度 40 60m， 生产厂家为美国 Sepax Technologies 公司 ； 乙腈、 乙酸、 无水 说 明 书 CN 103913538 A 6 4/9 页 7 乙酸钠、 无水硫酸镁， 均需在 620灼烧 4h， 均为分析纯， 生产厂家为上海国药集团化学试 剂有限公司 ； 实验用水为。

26、超纯水 （18.4M） 。 0028 2、 上述方案中， 在配制有机磷农药的基质混合标准工作溶液前， 先配制有机磷农 药混合标准储备液， 农药混合标准储备液配好后置于 4冰箱中保存， 使用时以空白基质提 取液为溶剂配制成适当浓度的农药基质混合标准工作溶液 ； 0029 其中， 有机磷农药混合标准储备液的配制方法为 ： 7 种有机磷农药标准储备液浓 度均为 1000mg/L， 分别取 1mL 置于 5mL 容量瓶中， 用丙酮稀释定容， 配制成浓度为 200mg/L 的单标溶液， 于 -20避光密封保存。根据各农药在 FPD 检测器上的响应值， 单标溶液敌敌 畏取0.5mL， 乐果、 三唑磷各取2。

27、mL， 其余有机磷单标溶液各取1mL， 置于10mL容量瓶中， 用丙 酮定容。 7种有机磷农药混合标准储备液中 ： 敌敌畏浓度为10mg/L， 毒死蜱、 甲基对硫磷、 杀 螟硫磷、 马拉硫磷浓度分别为 20mg/L， 乐果、 三唑磷浓度分别为 40mg/L。 0030 3、 上述方案中， 使用气相色谱法测定 7 种有机磷农药， 以保留时间定性， 峰面积外 标法定量。 0031 4、 上述方案中， 较佳的方案是所述第一部分的第一步和所述第二部分的第一步中 超声提取的条件为超声功率在 80W 100W 之间， 超声温度在 20 30。 0032 本发明工作原理以及有益效果是 ： 2003 年， 美。

28、国农业部农业研究服务中心的 Anastassiades M 等人提出了一种被称为 “QuEChERS” （Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe） 的新型农药多残留样品制备方法。此方法灵活性强， 应用范围广， 可以 根据样品和目标分析物的特点， 选择适合的提取溶剂和净化填料， 具有快速、 简便、 高效、 安 全等优点， 目前已成功应用于食品中数百种农药残留的分析研究， 但在茶鲜叶中的应用报 道较少。 “QuEChERS” 方法推荐使用气相色谱 - 质谱联用 （GC-MS） 或高效液相色谱 - 质谱 联用 （HPLC-MS） 进行后续的检测分。

29、析， GC-MS、 HPLC-MS 虽然既可定性又可定量， 是农药残留 分析方法发展的趋势， 但仪器价格昂贵， 对操作技术要求高， 从而限制了其广泛应用。气相 色谱仪 （GC） 作为实验室常用的分析仪器， 其价格适中， 应用范围广， 配以专属性较强的检测 器， 能获得很 好的选择性和较低的检测限， 是目前广大基层检测机构应用最普遍的检测手 段之一。 0033 针对目前基层检测部门大多没有昂贵的气质联用仪， 只有普通的气相色谱仪， 前 处理操作繁琐的不足， 本发明采用改进的 “QuEChERS” 方法对茶鲜叶进行提取、 净化， 采用气 相色谱火焰光度检测器 （英文名称 GC/FPD） 对有机磷类。

30、农药进行检测， 建立了茶鲜叶中 7 种 有机磷类农药残留的快速简便、 省时可靠的分析方法。 0034 茶鲜叶试样用含体积分数为 1% 乙酸的乙腈溶液超声提取， 再用适量 PSA、 C18 和 GCB 混合填料净化， 上清液氮吹浓缩至近干， 用丙酮溶解定容， DB-1701 石英毛细管柱程序 升温分离， GC/FPD 检测， 最后用基质外标法定量。通过试验确证， 该方法线性范围宽， 检测 灵敏度、 准确度及精密度等技术指标均满足残留分析的要求， 为茶鲜叶中有机磷类农药残 留的分析研究提供了可靠的手段。 0035 与现有茶叶农药残留检测方法和国标方法相比， 本发明前处理操作简单， 提取与 净化仅需。

31、几步即可完成， 而且提取时采用超声方法， 结果稳定， 重复性好， 方便后续批量样 品的处理， 实用性更强 ； 净化过程避免使用净化柱及大量溶剂洗脱， 农药损失少， 回收率高， 同时耗费的时间和有机溶剂大大减少， 节约检测成本， 对环境污染小， 对操作者也更安全。 说 明 书 CN 103913538 A 7 5/9 页 8 检测分析采用实验室常用的气相色谱仪 （配有 FPD） ， 价格适中， 操作维护简单， 技术要求不 如色质联用严格， 更适合在广大基层检测机构推广应用。定量方法采用基质匹配标准溶液 校准定量， 减小了待测农药的基质效应， 测定结果更准确。本发明的定量检测方法在准确 度、 精密。

32、度、 灵敏度等各项指标上均满足农药多残留分析的要求， 为茶叶质量控制提供了科 学的监测方法和依据， 具有一定的推广使用价值。 附图说明 0036 附图 1 为本发明实施例中 7 种有机磷农药的基质混合标准工作溶液色谱图 ； 0037 附图 2 为本发明实施例中 7 种有机磷农药在茶鲜叶中的基质效应图 ； 0038 附图3为本发明实施例中用于回收率和精密度测定的茶鲜叶中添加7种有机磷农 药标准色谱图。 具体实施方式 0039 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 ： 0040 实施例 ： 一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法 0041 供试茶鲜叶取自苏州市当地某茶叶种植园， 经粉碎机打碎混。

33、匀， 装入洁净的容器， 置于 -20冰箱中保存， 备用。所述定量检测方法有两部分组成 ： 0042 第一部分， 用气相色谱法建立已知梯度浓度的被测的有机磷农药的标准曲线 ； 所 述标准曲线的建立由以下步骤组成 ： 0043 第一步， 制备空白基质提取液， 制备方法由以下步骤组成 ： 0044 （1） 称取 5.0g 经测定不含被测的有机磷农药和拟除虫菊酯农药的空白茶鲜叶样 品， 置于 50mL 离心管中， 再向离心管中加入 10mL 含体积分数为 1% 乙酸的乙腈溶液， 混匀， 超声提取 10 15min， 超声功率在 80W 100W 之间， 超声温度在 20 30， 再加入 2g 无 水乙。

34、酸钠和 1g 无水硫酸镁， 涡旋 2min， 然后， 以 9000r/min 的转速离心 3.5min 4.5min， 取上清液即为待净化的空白基质提取液 ； 0045 （2） 另取一支 10mL 离心管， 加入 0.15g C18、 0.15g N- 丙基乙二胺、 0.12g 石墨化 碳黑和 0.3g 无水硫酸镁， 加入 4mL 所述待净化的空白基质提取液， 涡旋 2min， 以 9000r/min 的转速离心5min ； 离心后移取2.0mL上清液至刻度试管中， 再在5060水浴下将每份上 清液用氮气缓慢吹至5070L ； 再在上清液中加入丙酮以定容至1.0mL， 过0.22m有机 系滤膜。

35、后， 得到用于配制有机磷农药的空白基质提取液 ； 0046 第二步， 以所述第一步中得到的空白基质提取液为溶剂配制有机磷农药的基质混 合标准工作溶液， 其中， 所述有机磷农药是指敌敌畏、 乐果、 毒死蜱、 甲基对硫磷、 马拉硫磷、 杀螟硫磷、 三唑磷 ； 所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各有机磷农药的浓度范围 为 ： 0047 说 明 书 CN 103913538 A 8 6/9 页 9 0048 第三步， 用气相色谱法测定所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中 各农药 组分的色谱峰保留时间和色谱峰面积， 以色谱峰保留时间定性， 然后以质量浓度为横坐标， 以色谱峰面积为纵坐标绘制出有机磷。

36、农药的标准曲线 ； 0049 其中， 测定有机磷农药的色谱条件为 ： 0050 色谱柱 ： 型号为 DB-1701 的毛细管色谱柱， 规格为 30m0.32mm0.25m（即长 度 粒径 液膜厚度） ； 进样量 ： 1.0L， 不分流进样 ； 进样口温度 ： 220， 隔垫吹扫 3mL/ min ； 柱温 ： 初始温度 90， 保持 1min， 20 /min 升至 200， 保持 9min， 30 /min 升至 245， 保持 8min ； 载气 ： 高纯氮气， 纯度 99.999% ； 恒流模式， 流速 3mL/min ； 检测器 ： 火焰 光度检测器 ； 检测器温度 ： 245 ； 氢。

37、气 ： 流量为 75mL/min ； 空气 ： 流量为 100mL/min ； 尾吹 气 ： 高纯氮气， 流量为 60mL/min ； 0051 第二部分， 测定茶鲜叶样品中所述第一部分中的 7 种有机磷农药残留量， 定量检 测方法包括以下步骤 ： 0052 第一步， 对茶鲜叶样品进行提取 ； 0053 称取已粉碎的茶鲜叶试样 5.0g， 置于 50mL 聚四氟乙烯离心管中， 加入 10mL 含 1% 乙酸的乙腈溶液， 混匀， 超声提取 10min， 超声功率在 80W 100W 之间， 超声温度在 20 30， 加入 2g 无水乙酸钠和 1g 无水硫酸镁， 涡旋 2min， 以 9000r/。

38、min 转速离心 4min， 取上 清液即为待净化的茶鲜叶样品提取液 ； 0054 第二步， 对所述待净化的茶鲜叶样品提取液进行净化 ； 0055 另取一支 10mL 聚四氟乙烯离心管， 加入 0.15g C18、 0.15g PSA、 0.12gGCB 和 0.3g 无水硫酸镁， 加入 4mL 上述待净化的提取液， 涡旋 2min， 以 9000r/min 转速离心 5min ； 离心 后移取 2.0mL 上清液至刻度试管中， 在 50 60水浴下将上清液用氮气缓慢吹至 50 70L ； 再在上清液中加入丙酮以定容至 1.0mL， 过 0.22m 有机系滤膜后， 得到用于测定有 机磷农药残留。

39、的茶鲜叶样品提取净化液 ； 0056 第三步， 用气相色谱法测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药残留， 记 录色谱峰保留时间和色谱峰面积， 通过色谱峰保留时间定性后， 将所述茶鲜叶样品提取净 化液检测出的色谱峰面积与所述第一部分得到的有机磷农药的标准曲线进行比较， 得到所 述茶鲜叶样品提取净化液中含有的每种有机磷农药的测定值 ； 再将所述测定值带入到定量 计算公式中， 最终得到 茶鲜叶样品中待测有机磷农药残留量 ； 0057 定量计算公式 ： =(vf)/m， 式中 ： 为样品中待测有机磷农药残留量， 单 说 明 书 CN 103913538 A 9 7/9 页 10 位为 mg/kg 。

40、； 为测定值， 单位为 mg/L ； m 为称取的样品量， 单位为 g ； v 为定容体积， 单位为 mL ； f 为稀释倍数 ； 0058 其中， 测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药的色谱条件与所述第一部 分的第三步中的有机磷农药的色谱条件相同。 0059 以上实施例中， 所用的仪器与设备有 ： 7890A 气相色谱仪， 配有火焰光度检测器 （FPD） 、 7693 自动进样器和 Chemstation 色谱工作站 （美国 Agilent 公司） ； KQ-500DE 数控超 声波仪 （昆山市超声仪器有限公司） ； TG16-WS 台式高速离心机 （湖南湘仪实验室仪器开发有 限公司）。

41、 ； HSC-24B 氮吹仪 （天津市恒奥科技发展有限公司） ； K600 型粉碎机 （德国博朗公司） ； VM-10 涡旋振荡器 （韩国 Daihan Scientific 公司） ； SX2-4-10 马弗炉 （上海跃进医疗器械有 限公司） ； EXCEED-AD-24 型超纯水机 （成都唐氏康宁科技发展有限公司） 。 0060 所用的药品与试剂 ： 敌敌畏、 乐果、 毒死蜱、 甲基对硫磷、 马拉硫磷、 杀螟硫磷、 三唑 磷质量浓度均为 1000mg/L， 购于农业部环境保护科研监测所 ； 丙酮， HPLC 级 （上海国药集团 化学试剂有限公司） ； N- 丙基乙二胺 （PSA） ， 40。

42、 60m（美国 Agela Technologies 公司） ； 石墨化碳黑 （GCB） ， 120 400mesh（美国 Agela Technologies 公司） ； C18， 孔径 6nm， 粒度 40 60m（美国 Sepax Technologies 公司） ； 乙腈、 乙酸、 无水乙酸钠、 无水硫酸镁 （620 灼烧 4h） 均为分析纯 （上海国药集团化学试剂有限公司） ； 实验用水为超纯水 （18.4M） 。 0061 混合标准储备液的配制 ： 0062 有机磷农药混合标准储备液的配制方法为 ： 7 种有机磷农药标准储备液浓度均为 1000mg/L， 分别取 1mL 置于 5m。

43、L 容量瓶中， 用丙酮稀释定容， 配制成浓度为 200mg/L 的单标 溶液， 于 -20避光密封保存。根据各农药在 FPD 检测器上的响应值， 单标溶液敌敌畏取 0.5mL， 乐果、 三唑磷各取2mL， 其余有机磷单标溶液各取1mL， 置于10mL容量瓶中， 用丙酮定 容。 7种有机磷农药混合标准储备液中 ： 敌敌畏浓度为10mg/L， 毒死蜱、 甲基对硫磷、 杀螟硫 磷、 马拉硫磷浓度分别为 20mg/L， 乐果、 三唑磷浓度分别为 40mg/L。 0063 上述农药混合标准储备液均置于 4冰箱中保存， 使用时用空白基质提 取液为溶 剂分别配制成适当浓度的基质混合标准工作液。 0064 本。

44、实施例的试验结果 ： 0065 1、 试验农药的气相色谱分离 0066 采用上述气相色谱条件测定 7 种有机磷农药的基质混合标准工作溶液， 标样分 离效果较好， 峰形对称， 基线稳定， 说明仪器条件适合。在此色谱条件下有机磷各农药 的保留时间分别约为敌敌畏 5.941min， 乐果 13.099min， 毒死蜱 15.787min， 甲基对硫磷 15.915min， 马拉硫磷16.479min， 杀螟硫磷16.607min， 三唑磷22.684min （参见附图1所示， 附图1中标号1为敌敌畏， 浓度为0.25mg/L， 标号2为乐果， 浓度为1mg/L， 标号3为毒死蜱， 浓度为 0.5mg。

45、/L， 标号 4 为甲基对硫磷， 浓度为 0.5mg/L， 标号 5 为马拉硫磷， 浓度为 0.5mg/ L， 标号 6 为杀螟硫磷， 浓度为 0.5mg/L， 标号 7 为三唑磷， 浓度为 1mg/L） 。 0067 2、 基质效应 0068 基质效应是指样品中除待测物以外的其它基质成分对待测物测定值的影响。 基质 效应针对不同样品和待测物的情况而不同。 在气相色谱分析中大多数农药表现出不同程度 的基质增强效应， 即相同浓度的农药在基质中的响应值比其在纯溶剂中的高， 一般认为是 样品中基质成分的存在减少了色谱系统活性位点与待测物分子作用的机会， 使得待测物检 说 明 书 CN 1039135。

46、38 A 10 8/9 页 11 测信号增强。消除基质效应影响的方法有基质匹配标准溶液法、 标准添加法、 多重净化法、 分析保护剂应用及统计方法校正等。 本发明中采用基质混合标准工作溶液和纯溶剂混合标 准溶液中待测物的响应值之比表示基质效应， 比值越接近 1， 表明基质效应越小。 0069 试验结果表明， 所分析的 7 种农药化合物均存在不同程度的基质增强效应， 其中 敌敌畏、 乐果、 毒死蜱、 马拉硫磷的基质效应较强， 如附图 2 所示。所以本发明在用外标法定 量时， 用空白基质提取液为溶剂配制标样， 以消除基质干扰， 减少误差。 （在附图 2 中， 标号 1 表示含有敌敌畏的基质混合标准工。

47、作溶液和纯溶剂混合标准溶液， 浓度为 0.05mg/L ； 标 号 2 为含有乐果的基质混合标准工作溶液和纯溶剂混合标准溶液， 浓度为 0.2mg/L ； 同理， 标号 3 表示含有毒死蜱， 浓度为 0.1mg/L ； 标号 4 表示含有甲基对硫磷， 浓度为 0.1mg/L ； 标 号 5 表示含有马拉硫磷， 浓度为 0.1mg/L ； 标号 6 为杀螟硫磷， 浓度为 0.1mg/L ； 标号 7 为三 唑磷， 浓度为0.2mg/L ； Am表示基质匹配混合 标准溶液中各农药的响应值 ； As表示纯溶剂混 合标准溶液中各农药的响应值） 。 0070 3、 方法的线性范围、 回归方程与检出限 0。

48、071 配制质量浓度为 0.01 4.0mg/L 的 7 种有机磷农药基质混合标准溶液， 分别按所 述第一部分的第三步中的有机磷农药的色谱条件进行测定， 以质量浓度 （以 表示， 单位 为 mg/L） 为横坐标， 以峰面积 （y） 为纵坐标绘制标准曲线， 7 种农药在其浓度范围内线性良 好， 相关系数 （r2） 均大于 0.996， 见表 1 所示。分别以最低添加水平色谱图中噪音信号的 3 倍和 10 倍计算各农药的检出限 （LOD） 和定量限 （LOQ） 。经计算， 7 种有机磷农药的 LOD 在 0.0034 0.014mg/kg 之间， LOQ 在 0.012 0.046mg/kg 之间。 0072 表 1 供试农药的线性范围、 回归方程、 相关系数、 检出限和定量限 0073 0074 4、 方法的回收率与精密度 0075 采用空白样品加标方法进行方法回收率和精密度测定。称取 5.0g 经测定不含供 试农药的空白茶鲜叶样品若干份， 分别加入 3 种不同浓度水平的农药混合标准工作液， 有 机磷农药的添加水平为 0.025 1.0mg/kg， 每个浓度水平平行 3 份样品， 涡旋混匀后， 静置 1h 使标准溶液被样品充分吸收， 按照所述第二部分进行样品前处理和色谱条件测定。采用 基质外标法定量， 计算。