用于检测人类疱疹病毒8型感染的多肽及试剂盒技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种多肽以及人类疱疹病毒8型感染的间
接ELISA抗体检测试剂盒。
背景技术
人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8，HHV-8)，又称卡波西肉瘤相关疱疹病毒
(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)，属于γ-2型疱疹病毒。HHV-8为双链
DNA病毒，病毒基因组全长约170kb，包含至少81个开放阅读框(open reading frame，ORF)。
与其他疱疹病毒一样，绝大多数的HHV-8在感染细胞后，以附加体的形式潜伏存在，随细胞
的分裂而增殖。ORF50基因编码产物作为“分子开关”控制着HHV-8由潜伏到增殖状态的转
换，被其激活后的HHV-8大量增殖，最终引起细胞破裂并释放子代病毒。
人类疱疹病毒8型是一种重要的人类肿瘤病毒，它与卡波西肉瘤(Kaposi’s
sarcoma，KS)、原发性渗出性淋巴瘤、多中心卡斯特莱曼病和嗜生发中心淋巴细胞增殖紊乱
等多种血液系统恶性疾病的发生密切相关，其中卡波西肉瘤是艾滋病患者常见的肿瘤及致
死原因。艾滋病毒流行前，地中海地区HHV-8的人群感染率为4％～35％，而卡波西肉瘤的发
病率每年只有0.03％，为美国的10倍；非洲KSHV的人群感染率高达30％～60％，而卡波西肉
瘤只占男性肿瘤的6.4％～6.6％，女性中几乎没有卡波西肉瘤患者。但是在艾滋病流行后，
非洲乌干达卡波西肉瘤患者占据男性癌症患病的48.6％，女性癌症患者的17.9％，成为当
地最常见的肿瘤之一；在美国，卡波西肉瘤也成为患有艾滋病的男性同性恋者的常见肿瘤。
艾滋病毒的感染能够极大的提高卡波西肉瘤的发病率，并且艾滋病相关的波济肉瘤具有更
强的侵袭性(常常播散到肺、胃肠道、肝、脑和脾脏)和较高的死亡率。
艾滋病流行前我国人群卡波西肉瘤的发病率较低，上个世纪80年代起新疆地区才
有少量病例报告。然而，艾滋病毒的流行使我国艾滋病相关的卡波西肉瘤患者急剧增加。目
前我国人群的艾滋病毒感染数量已逾300万，并且仍处于增长期。随着艾滋病毒感染者数量
的进一步增加，预计不久的将来中国将会出现大量的艾滋病相关卡波西肉瘤患者。为了评
估疱疹病毒8型的感染率及由此发生艾滋病相关卡波西肉瘤的可能风险，可以高通量、快
速、简便的检测疱疹病毒8型感染的试剂盒在当下就显得尤为重要。然而，目前国内尚无检
测疱疹病毒8型感染的试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种分离的多肽及其应用，本发明还提供了用于
检测疱疹病毒8型感染的试剂盒及其应用，采用该试剂盒检测疱疹病毒8型感染不仅简便、
快速，而且具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在一优选例中，检测人类疱疹病毒8型感染及相关疾病的产品为间接ELISA抗体检
测试剂盒，但产品并不局限于此，还包括应用胶体金、斑点杂交、Western blot等方法的试
剂盒。
本发明中出现的“5％脱脂奶粉”的制备方法为：每取5g脱脂奶粉(BD公司，货号
232100)，需要在其中加入PBS(Beyotime公司，货号C0221A)直至100mL，即得到“5％的脱脂
奶粉”。其它“1％脱脂奶粉”、“2.5％脱脂奶粉”和“10％脱脂奶粉”依此类推。“1％BSA”的制
备方法为：每取1g BSA(Beyotime公司，货号ST023)，需要在其中加入PBS(Beyotime公司，货
号C0221A)直至100mL。本发明中出现的“待检测样品、阳性血清和阴性血清分别用5％脱脂
奶粉按1:100进行稀释”是指当分别每取检测样品、阳性血清和阴性血清1mL时，需要分别在
其中加入100mL的5％脱脂奶粉进行稀释。其它比例依此类推。
本发明中出现的PBS-T洗涤液的制备方法为：每1L PBS(Beyotime公司，货号
C0221A)溶液中加入1mL吐温20(Beyotime公司，货号ST825)，混匀后即为PBS-T洗涤液。
本发明中出现的“辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗的工作浓度为1:2500”是指
在使用辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗时，需采用5％脱脂奶粉以1:2500的比例加以稀
释，即每取辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗1mL时，需在其中加入2500mL的5％脱脂奶粉。
其它比例依此类推。
本发明第一方面提供了分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列选自：
1)包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
2)多肽的同源序列，其与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少70％-99％的同一
性；或
3)多肽变体，其与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸的取
代、缺失和/或添加；或
4)多肽衍生物，其为1)-3)所述的多肽的序列的变体；
在一优选例中，所述多肽为能与人类疱疹病毒8型感染者血浆和/或血清抗体发生
特异性结合。
本发明第二方面提供了分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列选自：
1)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
2)多肽的同源序列，其与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列有至少70％-99％的同一
性；或
3)多肽变体，其与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸的取
代、缺失和/或添加；或
4)多肽衍生物，其为1)-3)所述的多肽的序列的变体。
本发明第三方面提供了分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列选自：
1)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或
2)多肽的同源序列，其与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列有至少70％-99％的同一
性；或
3)多肽变体，其与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸的取
代、缺失和/或添加；或
4)多肽衍生物，其为1)-3)所述的多肽的序列的变体。
本发明第四方面提供了多肽组合，包括所述的多肽。
本发明第五方面提供了所述的多肽和多肽组合在制备检测人类疱疹病毒8型感染
及相关疾病的产品中的应用。
在一优选例中，所述相关疾病为卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤和多中心卡斯
特莱曼病中的任意一种。
在一优选例中，检测人类疱疹病毒8型感染及相关疾病的产品为间接ELISA抗体检
测试剂盒。
本发明第六方面提供了一种预包被酶标板，包括所述的多肽。
在一优选例中，所述预包被酶标板采用以下方法制备而成：将所述的多肽的水溶
液用包被液稀释，然后采用酶标板包被过夜，最后加入封闭液进行封闭。
在一优选例中，所述多肽的水溶液的浓度为1mg/mL。
在一优选例中，所述包被液为浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液。
在一优选例中，所述多肽的水溶液是用包被液稀释至10μg/mL。
在一优选例中，所述包被过夜的温度是4℃。
在一优选例中，所述封闭液为5％的脱脂奶粉。
在一优选例中，所述5％脱脂奶粉为脱脂奶粉的PBS溶液，其中脱脂奶粉在溶液中
的质量体积比为5％。
在一优选例中，所述封闭液的工作条件为：37℃孵育60min。
在一优选例中，所述预包被酶标板采用以下方法制备而成：用蒸馏水分别溶解所
述的多肽至浓度均为1mg/mL，用浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释多肽浓度
至10μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜，然后分别在每孔继续加入200μ
L 5％的脱脂奶粉进行封闭，37℃温箱中孵育1小时，用PBS-T洗涤液洗涤3次。
本发明第七方面提供了预包被酶标板组合，包括含有所述的多肽的预包被酶标
板、含有所述的多肽的预包被酶标板和含有所述的多肽的预包被酶标板。
在一优选例中，所述含有所述的多肽的预包被酶标板采用以下方法制备而成：将
所述的多肽的水溶液用包被液稀释，然后采用酶标板包被过夜，最后加入封闭液进行封闭。
在一优选例中，所述多肽的水溶液的浓度为1mg/mL。
在一优选例中，所述包被液为浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液。
在一优选例中，所述多肽的水溶液是用包被液稀释至10μg/mL。
在一优选例中，所述包被过夜的温度是4℃。
在一优选例中，所述封闭液为5％的脱脂奶粉。
在一优选例中，所述5％脱脂奶粉为脱脂奶粉的PBS溶液，其中脱脂奶粉在溶液中
的质量体积比为5％。
在一优选例中，所述封闭液的工作条件为：37℃孵育60min。
在一优选例中，所述含有所述的多肽的预包被酶标板采用以下方法制备而成：用
蒸馏水分别溶解所述的多肽至浓度均为1mg/mL，用浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液
分别稀释多肽浓度至10μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜，然后分别在
每孔继续加入200μL 5％的脱脂奶粉进行封闭，37℃温箱中孵育1小时，用PBS-T洗涤液洗涤
3次。
在一优选例中，所述含有所述的多肽的预包被酶标板采用以下方法制备而成：将
所述的多肽的水溶液用包被液稀释，然后采用酶标板包被过夜，最后加入封闭液进行封闭。
在一优选例中，所述多肽的水溶液的浓度为1mg/mL。
在一优选例中，所述包被液为浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液。
在一优选例中，所述多肽的水溶液是用包被液稀释至10μg/mL。
在一优选例中，所述包被过夜的温度是4℃。
在一优选例中，所述封闭液为5％的脱脂奶粉。
在一优选例中，所述5％脱脂奶粉为脱脂奶粉的PBS溶液，其中脱脂奶粉在溶液中
的质量体积比为5％。
在一优选例中，所述封闭液的工作条件为：37℃孵育60min。
在一优选例中，所述含有所述的多肽的预包被酶标板采用以下方法制备而成：用
蒸馏水分别溶解所述的多肽至浓度均为1mg/mL，用浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液
分别稀释多肽浓度至10μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜，然后分别在
每孔继续加入200μL 5％的脱脂奶粉进行封闭，37℃温箱中孵育1小时，用PBS-T洗涤液洗涤
3次。
在一优选例中，所述含有所述的多肽的预包被酶标板采用以下方法制备而成：将
所述的多肽的水溶液用包被液稀释，然后采用酶标板包被过夜，最后加入封闭液进行封闭。
在一优选例中，所述多肽的水溶液的浓度为1mg/mL。
在一优选例中，所述包被液为浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液。
在一优选例中，所述多肽的水溶液是用包被液稀释至10μg/mL。
在一优选例中，所述包被过夜的温度是4℃。
在一优选例中，所述封闭液为5％的脱脂奶粉。
在一优选例中，所述5％脱脂奶粉为脱脂奶粉的PBS溶液，其中脱脂奶粉在溶液中
的质量体积比为5％。
在一优选例中，所述封闭液的工作条件为：37℃孵育60min。
在一优选例中，所述含有所述的多肽的预包被酶标板采用以下方法制备而成：用
蒸馏水分别溶解所述的多肽至浓度均为1mg/mL，用浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液
分别稀释多肽浓度至10μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜，然后分别在
每孔继续加入200μL 5％的脱脂奶粉进行封闭，37℃温箱中孵育1小时，用PBS-T洗涤液洗涤
3次。
本发明第八方面提供了试剂盒，包括预包被酶标板或预包被酶标板组合；
在一优选例中，还进一步包括酶标二抗，
在一优选例中，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗；
在一优选例中，所述辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗的工作浓度为1:2500，工
作条件为：37℃孵育30min；
在一优选例中，还进一步包括PBS-T洗涤液；
在一优选例中，还进一步包括显色液；
在一优选例中，所述显色液为TMB显色液；
在一优选例中，还进一步包括终止液；
在一优选例中，所述终止液2mol/L的硫酸溶液。
本发明第九方面提供了所述预包被酶标板或所述预包被酶标板组合或所述试剂
盒在制备检测人类疱疹病毒8型感染及相关疾病的产品中的应用；
在一优选例中，所述相关疾病为卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤和多中心卡斯
特莱曼病中的任意一种；
在一优选例中，检测人类疱疹病毒8型感染及相关疾病的产品为间接ELISA抗体检
测试剂盒。
本发明第十方面提供了所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)样品准备：用一次性采血管收集2-3mL静脉血液，于室温下凝固30min以上，
1000g/min离心1min，取上清作为待检测样品；
(2)加样：将上述步骤(1)制备的待检测样品、阳性血清和阴性血清分别用5％脱脂
奶粉按1:100进行稀释，将稀释好的样品按100μL/孔的量加入预包被酶标板中；
上述预包被酶标板的制作方法：用蒸馏水分别溶解实施例1合成的多肽，存储浓度
均为1mg/mL，用浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释多肽浓度至10μg/mL，包被
96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜，然后分别在每孔继续加入200μL 5％的脱脂奶
粉进行封闭，37℃温箱中孵育1小时，用PBS-T洗涤液洗涤3次；
(3)温育：用封板膜封板后置37℃温箱中孵育1小时；
(4)洗涤：吸出样品，用PBS-T洗涤液洗涤3次，每次3-5min；
(5)二抗：将用5％的脱脂奶粉以1:2500的比例稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记
的羊抗人二抗(Promega公司，货号为W4031)按100μL/孔的量加入上述步骤(4)中洗涤好的
酶标板中；
(6)温育：用封板膜封板后置37℃温箱中孵育30min；
(7)洗涤：同步骤(4)；
(8)显色：加入新鲜配制的底物(TMB，BD公司，货号为555214)100μL/孔，37℃避光
显色10min；
(9)终止：每孔加50μL 2M H2SO4终止反应，酶标仪测定OD450nm值；
(10)结果判断：阴性血清设2个复孔，根据阴性血清OD450nm值的平均值(X)建立判定
标准。临界值(Cut-off值)定为2.1X。待检测样品对3条多肽的检测结果只要有1条大于临界
值(Cut-off值)即判定为阳性。
本发明有如下有益效果：
(1)本发明开创性的设计了源于HHV-8编码的ORF65、LANA和K8.1对应的3条多肽，
以及基于该3条多肽设计的HHV-8感染检测试剂盒，3条多肽同时配合使用时，对HHV-8感染
检出率达到100％，填补国内该领域的空白。
(2)本发明的疱疹病毒8型感染间接ELISA抗体检测试剂盒，可以对疱疹病毒8型特
异性抗体进行定性检测。
(3)本发明利用源于疱疹病毒8型的多肽包被酶标板进行特异性抗体的检测，不仅
价格低廉，而且经实验证明具有很强的特异性和较高的灵敏度本发明采。
(4)用病毒来源的多肽包被ELISA板，以其捕获已知病毒抗体，这种方式简便、快
速，可规模化批量生产，可实现自动化检测要求，为疱疹病毒8型的感染及相关临床的检测
提供了一种极为有效的手段。
本发明及后续的临床应用，将为进一步深入广泛地开展在中国不同地域、不同种
族以及可能高危人群中，为人类疱疹病毒8型的流行病学调查研究奠定了坚实的基础，将有
助于揭示疱疹病毒在中国普通人群与艾滋病毒感染人群中的分布状况，为截断其传播途径
以及预防艾滋病相关卡波西肉瘤的发生提供科学依据。
附图说明
图1为利用实施例4的人类疱疹病毒8型感染间接ELISA检测方法对6份临床确诊的
卡波西肉瘤(KS)患者进行血浆检测的检测结果示意图。
具体实施方式
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅
是说明性的，不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域
内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所用试剂未注明配制方法的，均
为常规方法进行配制；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规
产品。
实施例1
本实施例提供了一种多肽及其应用。
所述多肽的设计：人类疱疹病毒8型病毒基因组全长约170kb，包含至少81个基因。
在HHV-8编码的6种衣壳蛋白中，ORF65编码的小衣壳蛋白与其它疱疹病毒，如人单纯疱疹病
毒、人巨细胞病毒、水痘带状疱症病毒、EB病毒等，同源性最低。因此，ORF65基因重组蛋白进
行KSHV血清学分析，具有良好的免疫原性与特异性。此外，HHV-8编码潜伏相关核抗原LANA
和包膜蛋白K8.1也常用于血清学检测。因此，基于LANA、ORF65和K8.1，通过DNASTAR软件分
析3种蛋白的免疫原性，设计并合成了12条多肽，经多次实验结果惊奇的发现，多肽(SEQ ID
NO.1-SEQ ID NO.3)的敏感性和特异性显著优于这里的其它9条多肽和其它方式获取的多
条多肽。
3条多肽(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3)具体氨基酸序列如下：
Peptide-1(多肽1)：IASSPPGDNTPDDDPQPGPSREYRY(SEQ ID NO.1)，源于HHV-
8LANA。
Peptide-2(多肽2)：SSTTETAAPAVADARKPPSGKKK(SEQ ID NO.2)，源于HHV-8ORF65。
Peptide-3(多肽3)：SGEPSRTTRIRVSPVAENGRNSGASNR(SEQ ID NO.3)，源于HHV-
8K8.1。
上述多肽均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
上述多肽可应用于制备检测人类疱疹病毒8型感染及相关疾病的产品；所述检测
人类疱疹病毒8型感染及相关疾病的产品优选为间接ELISA试剂盒。
实施例2
本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：
(1)预包被酶标板；
(2)PBS-T洗涤液；
(3)酶标二抗；
(4)显色液；
(5)终止液；
(7)阳性血清；
(8)阴性血清。
所述预包被酶标板采用以下方法制备而成：用蒸馏水分别溶解所述的多肽1、多肽
2、多肽3至浓度均为1mg/mL，用浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释多肽浓度至
10μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜，然后分别在每孔继续加入200μL
5％的脱脂奶粉进行封闭，37℃温箱中孵育1小时，用PBS-T洗涤液洗涤3次。
本发明中出现的PBS-T洗涤液的制备方法为：每1L PBS(Beyotime公司，货号
C0221A)中加入1mL吐温20(Beyotime公司，货号ST825)，混匀后即为PBS-T洗涤液。
上述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗；所述辣根过氧化物酶标记的
羊抗人二抗的工作浓度优选为1:2500，工作条件为：37℃孵育30min。
上述显色液为TMB显色液；上述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
上述阳性血清和阴性血清均保存于深圳市第三人民医院，下同。
阳性血清的具体来源为：用一次性采血管收集卡波西肉瘤患者(人类疱疹病毒8型
阳性)的2-3mL静脉血液，于室温下凝固30min以上，1000g/min离心1min，取上清作为阳性血
清。
阴性血清的具体来源为：用一次性采血管收集健康人的2-3mL静脉血液，于室温下
凝固30min以上，1000g/min离心1min，取上清作为阴性血清。
实验证明，上述试剂盒中各组分的联合使用，效果更加优越，具体表现在特异性和
敏感度明显有益。
上述试剂盒可应用于制备检测人类疱疹病毒8型感染及相关疾病的产品；所述检
测人类疱疹病毒8型感染及相关疾病的产品优选为间接ELISA试剂盒。
实施例3
本实施例提供了人类疱疹病毒8型感染间接ELISA检测方法，该方法使用了实施例
1的多肽和实施例2的试剂盒。
本实施例在提供人类疱疹病毒8型感染间接ELISA检测方法之前，经历了以下阶
段：
1.最佳多肽及待测样品稀释度的确定
用蒸馏水分别溶解实施例1合成的多肽，存储浓度均为1mg/mL，用浓度为50mM且pH
为9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释多肽浓度至20μg/mL、10μg/mL、8μg/mL、6μg/mL、4μg/mL、2μ
g/mL和1μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜，然后分别在每孔继续加入
200μL 5％的脱脂奶粉进行封闭，37℃温箱中孵育1小时，用PBS-T洗涤液洗涤3次。将抗人类
疱疹病毒8型感染的阳性血清、阴性血清分别用5％脱脂奶粉进行1:25、1:50、1:100、1:200、
1:400和1:800稀释，将稀释后的各浓度血清100μL分别加入到上述已包被之反应孔中，进行
ELISA方阵滴定，继续在37℃温箱中孵育1小时后，用PBS-T洗涤液洗涤3次，然后再在每孔中
加入100μL以1:2500稀释(5％脱脂奶粉稀释)过的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人二抗
(Promega公司，货号为W4031)，37℃温箱中孵育1h，用PBS-T洗涤液洗涤3次后，加入100μL底
物(TMB，BD公司，货号为555214)，37℃避光显色10min，最后用50μL 2M H2SO4终止反应。
测定各孔OD450nm值，确定抗原和检测样品稀释度。
结果表明，当抗原包被浓度为10μg/mL且抗人类疱疹病毒8型感染的阳性血清、阴
性血清以1:100稀释时P/N值最大，阳性血清OD450nm值高于1.0，阴性血清OD450nm值小于0.15。
因此，确定抗原的最适包被浓度为10μg/mL，抗人类疱疹病毒8型感染的阳性血清、阴性血清
(也即待检血清或血浆样品)的最适稀释度为1:100。
2.最佳封闭液和封闭时间的确定
用蒸馏水分别溶解实施例1合成的多肽，存储均浓度为1mg/mL，用浓度为50mM且pH
为9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释多肽浓度至10μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃
包被过夜，然后在每孔继续分别加入200μL 1％脱脂奶粉、2.5％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、
10％脱脂奶粉和1％BSA为封闭液进行封闭，37℃温箱中分别孵育30min、60min、90min和
120min，用PBS-T洗涤液洗涤3次。将抗人类疱疹病毒8型感染的阳性血清、阴性血清用上述
封闭液分别进行1:100稀释，将稀释后的各浓度血清100μL分别加入到上述已包被之反应孔
中，进行ELISA方阵滴定，继续在37℃温箱中分别孵育60min，用PBS-T洗涤液洗涤3次，然后
再在每孔中加入100μL用上述封闭液以1:2500的比例稀释过的辣根过氧化物酶(HRP)标记
的羊抗人二抗(Promega公司，货号为W4031)，37℃温箱中分别孵育30min，用PBS-T洗涤液洗
涤3次后，加入100μL底物(TMB，BD公司，货号为555214)，37℃避光显色10min，最后用50μL
2M H2SO4终止反应。
测定各孔OD450nm值，确定最佳封闭液和封闭时间。
结果表明，用5％脱脂奶粉作为封闭液的P/N值最高，而且阳性血清OD450nm值大于
1.0，阴性血清OD450nm值小于0.15，封闭效果最好。在37℃条件下封闭60min时P/N值最高。
3.最佳二抗工作浓度的确定
用蒸馏水溶解实施例1合成的多肽(分别溶解)，存储浓度均为1mg/mL，用浓度为
50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释多肽浓度至10μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入
100μL，4℃包被过夜，然后分别在每孔继续加入200μL 5％的脱脂奶粉进行封闭，37℃温箱
中孵育1小时，用PBS-T洗涤液洗涤3次。将抗人类疱疹病毒8型感染的阳性血清、阴性血清分
别用5％的脱脂奶粉进行1:100稀释，将稀释后的各浓度血清100μL分别加入到上述已包被
之反应孔中，进行ELISA方阵滴定，继续在37℃温箱中孵育1小时后，用PBS-T洗涤液洗涤3
次，然后再在每孔中加入100μL用5％的脱脂奶粉分别按照1:1000、1:2500、1:5000和1:
10000的比例稀释过的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人二抗(Promega公司，货号为
W4031)，37℃温箱中孵育30min，用PBS-T洗涤液洗涤3次后，加入100μL底物(TMB，BD公司，货
号为555214)，37℃避光显色10min，最后用50μL 2M H2SO4终止反应。
测定各孔OD450nm值，确定最佳二抗工作浓度。
结果表明，当酶标二抗工作浓度作1:2500稀释时P/N值最大。因此，确定二抗最佳
稀释度为1:2500。
由此，本实施例提供了人类疱疹病毒8型感染间接ELISA检测方法的最佳实施方
案，包括如下步骤：
(1)样品准备：用一次性采血管收集2-3mL静脉血液，于室温下凝固30min以上，
1000g/min离心1min，取上清作为待检测样品。
(2)加样：将上述步骤(1)制备的待检测样品、阳性血清和阴性血清分别用5％脱脂
奶粉按1:100进行稀释，将稀释好的样品按100μL/孔的量加入预包被酶标板中。
上述预包被酶标板的制作方法：用蒸馏水分别溶解实施例1合成的多肽，存储浓度
均为1mg/mL，用浓度为50mM且pH为9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释多肽浓度至10μg/mL，包被
96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜，然后分别在每孔继续加入200μL 5％的脱脂奶
粉进行封闭，37℃温箱中孵育1小时，用PBS-T洗涤液洗涤3次。
(3)温育：用封板膜封板后置37℃温箱中孵育1小时。
(4)洗涤：吸出样品，用PBS-T洗涤液洗涤3次，每次3-5min。
(5)二抗：将用5％的脱脂奶粉以1:2500的比例稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记
的羊抗人二抗(Promega公司，货号为W4031)按100μL/孔的量加入上述步骤(4)中洗涤好的
酶标板中。
(6)温育：用封板膜封板后置37℃温箱中孵育30min。
(7)洗涤：同步骤(4)。
(8)显色：加入新鲜配制的底物TMB(BD公司，货号为555214)100μL/孔，37℃避光显
色10min。
(9)终止：每孔加50μL 2M H2SO4终止反应，酶标仪测定OD450nm值。
(10)结果判断：阴性血清设2个复孔，根据阴性血清OD450nm值的平均值(X)建立判定
标准。临界值(Cut-off值)定为2.1X。待检测样品对3条多肽的检测结果只要有1条大于临界
值(Cut-off值)即判定为阳性。
实施例4
根据实施例3所建立的人类疱疹病毒8型感染间接ELISA检测方法，对6份临床确诊
的卡波西肉瘤(KS)患者(编号为KS-1，KS-2，KS-3，KS-4，KS-5，KS-6)和12份EB病毒
(epstein-barr virus，EBV，又称人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus 4(HHV-4))阳性血
清进行检测，分析所建立的间接ELISA方法的有效性、特异性和灵敏度。
检测结果如图1所示，6份临床确诊的卡波西肉瘤患者血清HHV-8抗体100％为阳
性，其中KS-1和KS-3的多肽2(Peptide-2)均检测阳性，KS-5的多肽3(Peptide-3)检测阳性，
KS-2和KS-6的多肽1和多肽2检测结果均为阳性，KS-4的多肽2和多肽3检测结果均为阳性，
而12份EB病毒阳性血清HHV-8抗体100％为阴性，这表明本发明建立的人类疱疹病毒8型感
染间接ELISA检测方法有效性高且特异性好；且每份样品至少对一条多肽呈强阳性反应(样
品读值≥阴性对照平均值的4倍)，这进一步表明该方法灵敏度非常高。
实施例5
应用本实施例3的人类疱疹病毒8型感染间接ELISA检测方法对采自深圳市体检人
群血浆样本进行检测，统计结果如表1所示。
结果显示，在244例血清样本中有12例HHV-8特异性抗体呈阳性，人群感染率为
4.92％。其中男女感染率分别为5.60％和4.20％，无统计学差异；HHV-8感染以青年为主(感
染率6.15％)，各年龄组之间存在显著的统计学差异(表1)。该结果与文献报道的中国广东
地区HHV-8感染率小于10％的结果相符合。这表明本发明建立的针对人类疱疹病毒8型感染
间接ELISA检测方法具有高度的可靠性。
表1
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本
发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市第三人民医院
<120> 用于检测人类疱疹病毒8型感染的多肽及试剂盒
<130> 17PA0105CN.B1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ile Ala Ser Ser Pro Pro Gly Asp Asn Thr Pro Asp Asp Asp Pro Gln
1 5 10 15
Pro Gly Pro Ser Arg Glu Tyr Arg Tyr
20 25
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ser Ser Thr Thr Glu Thr Ala Ala Pro Ala Val Ala Asp Ala Arg Lys
1 5 10 15
Pro Pro Ser Gly Lys Lys Lys
20
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ser Gly Glu Pro Ser Arg Thr Thr Arg Ile Arg Val Ser Pro Val Ala
1 5 10 15
Glu Asn Gly Arg Asn Ser Gly Ala Ser Asn Arg
20 25