一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3及其应用技术领域
本发明涉及一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3及其应用，属于食品安全免
疫检测领域。
背景技术
罂粟碱是罂粟壳的主要成分之一。罂粟壳是罂粟的干燥成熟果壳，具有药用价值，
但久服易成瘾，对人体的肝脏、心脏、神经系统具有毒害作用。由于其易成瘾性，有些不法商
贩将其加入到食品中，例如火锅底料、方便面调料等，以达到吸引顾客、牟取暴利的目的。为
此，国家药品监督管理局将罂粟碱列入麻醉药品管制品种，通过检测罂粟壳中含有的吗啡
和罂粟碱等主要成分以实现对罂粟壳使用情况的监督。
为了有效监督监测食品中使用罂粟壳情况，需要寻找一种特异性好、灵敏度高的
测定方法，而目前检测方法如薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法等，分离纯化过程冗长，
灵敏度低，加上食品中干扰物多，难以获得准确结果。因此建立快速简便的罂粟碱检测方法
具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本
的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测
方法，筛选高特异性的单克隆单体是重要前提。
发明内容
本发明的目的是提供一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3，由该细胞株制备
的抗体对罂粟碱具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立罂粟碱的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3，已保藏于中国微生
物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12031。
所述罂粟碱单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCC No.12031的罂粟碱单克隆抗体
杂交瘤细胞株YH3分泌产生。
所述罂粟碱单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中罂粟碱残留的分析检测。
本发明提供的罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3的制备基本步骤为：
（1）半抗原的合成：
将化合物1（2g，5.89mmol）溶解在48％溴化氢（10mL）中，55℃下搅拌过夜，向溶液中加
入水并用乙酸乙酯萃取，将有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物。通过制
备型高效液相色谱纯化粗产物，得到化合物2（700mg，36.6％）。
将化合物2（700mg，2.15mmol）溶解在乙腈（10mL）和2-溴乙酸乙酯（536mg，
3.23mmol）的溶液中，加入碳酸钾（595mg，4.31mmol），并在室温下搅拌过夜。向溶液中加入
水并用乙酸乙酯萃取，将有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物。 通过制备
型高效液相色谱纯化粗产物，得到化合物3（100mg，11.3％）
将化合物3（100mg，0.24mmol）溶解在四氢呋喃（3mL）和水（2mL）中，加入氢氧化锂
（25.5mg，0.61mmol），并在室温下搅拌2h。反应溶液用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，用
硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过制备型高效液相色谱纯化，得到半抗原PAPA
（30mg，32.3％）；
（2）完全抗原PAPA-KLH的制备：称取4mg PAPA，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺
盐酸盐（EDC）7mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）4mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解
(称为A液)，室温搅拌反应8h。取匙孔血蓝蛋白KLH 1mL(6.8mg/mL)，加入等体积硼酸缓冲溶
液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物PAPA-KLH混
合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；
（3）小鼠的免疫：PAPA-KLH完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免
疫BALB/c小鼠。首次免疫用罂粟碱完全抗原与等量完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全
弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后
一次用PAPA-KLH完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测
血清效价和抑制；
（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细
胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进
一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞
孔进行三次亚克隆，最终筛选获得罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3；
（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
取高效价低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞
争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株YH3分泌的单克隆抗体，对罂粟碱具有较
好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.1ng/mL），可实现对水、果蔬、谷物中罂粟碱残留量的
检测，为食品中罂粟碱残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3，已保藏于中国微生
物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院
3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年1月20日，保藏编号为CGMCC No. 12031，分
类命名为单克隆细胞株。
附图说明
图1是YH3单克隆抗体对罂粟碱的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内
容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将罂粟碱完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，
通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对罂粟碱有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂
交瘤细胞株。
实施例1 杂交瘤细胞株YH3的制备
（1）半抗原的合成：将化合物1（2g，5.89mmol）溶解在48％溴化氢（10mL）中，55℃下搅拌
过夜，向溶液中加入水并用乙酸乙酯萃取，将有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得
到粗产物。通过制备型高效液相色谱纯化粗产物，得到化合物2（700mg，36.6％）。
将化合物2（700mg，2.15mmol）溶解在乙腈（10mL）和2-溴乙酸乙酯（536mg，
3.23mmol）的溶液中，加入碳酸钾（595mg，4.31mmol），并在室温下搅拌过夜。向溶液中加入
水并用乙酸乙酯萃取，将有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物。 通过制备
型高效液相色谱纯化粗产物，得到化合物3（100mg，11.3％）。
将化合物3（100mg，0.24mmol）溶解在四氢呋喃（3mL）和水（2mL）中，加入氢氧化锂
（25.5mg，0.61mmol），并在室温下搅拌2h。反应溶液用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，用
硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过制备型高效液相色谱纯化，得到半抗原PAPA
（30mg，32.3％）。
（2）完全抗原的合成：称取4mg PAPA，EDC 7mg，NHS 4mg，用300μL无水DMF溶解(称
为A液)，室温搅拌反应8h。取KLH 1mL(6.8 mg/mL)，加入等体积BB溶液（称为B液），在室温条
件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物PAPA-KLH混合液，通过透析分离完
全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。
（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取罂粟碱完全抗原与
等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐
剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫
之间间隔21天。第三次免疫后7天采血，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价
高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何
佐剂。
（4）细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进
行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5 min左右，
无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬
液，收集，离心（1200rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将
脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞： 融合前 7-10 天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-
1640 培养基在5% CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 1~ 4×107，保证融合前
SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行
细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第
3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mL
RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5 min。
离心（800 rpm，8 min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养
液中，按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选
培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全
换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，
第二步选用罂粟碱为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对罂粟碱标
准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三
次，获得细胞株YH3。
（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石
蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过
辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂
蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃
上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20
℃保存。
6.1包被：将包被原PAPA-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始倍比稀
释，100μL/孔，37℃反应2h；
6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
6.3封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃反应2h；洗涤后烘干备用；
6.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL /
孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应
30min；
6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应
15min；
6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450
值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体罂粟碱的IC50为0.1 ng/mL，说明对罂粟碱有很好的灵
敏度，可用于罂粟碱免疫分析检测。
溶液的配置：碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于
少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮
存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶
于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温 20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4.12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg
TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。