药物递送增强的末端树枝状聚合物.pdf

本发明提供了两亲性末端树枝状聚合物，其聚集以形成特征为疏水性核和亲水性外部的纳米载体。所述纳米载体核可包括两亲性官能度，例如胆酸或胆酸衍生物，并且所述外部可包括支化或线性聚(乙二醇)片段。纳米载体载物，例如疏水性药物和其他物质，可以经由非共价手段而隔离在所述核中，或者可以与所述末端树枝状聚合物构建单元共价结合。末端树枝状聚合物结构可以经调整以改变负载性能、与诸如生物膜的材料的相互作用以及其他特性。

1.  通式I的化合物：
(PEG)_m-A-L-D-(R)_n  (I)
其中
D为具有单中心基团、多个支化单体单元X和多个端基的树枝状聚合物；
L为与所述树枝状聚合物的中心基团连接的键或连接物；
每一PEG为聚乙二醇(PEG)聚合物，其中每一PEG聚合物具有1kDa至100kDa的分子量；
A为与至少两个PEG基团连接的单体或低聚物；
每一R独立地选自所述树枝状聚合物的端基、疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物和药物，使得当R不为端基时，每一R与所述端基之一连接；
下标n为整数2至20，其中下标n等于在所述树枝状聚合物上的端基的数量，并且其中数量n个R基团的至少一半各自独立地选自疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物和药物；并且
下标m为整数2至20。

2.  如权利要求1所述的化合物，其中每一支化单体单元X独立地选自二氨基羧酸、二羟基羧酸和羟基氨基羧酸。

3.  如权利要求2所述的化合物，其中每一二氨基羧酸独立地选自2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2,5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2,6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁酸和5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。

4.  如权利要求2所述的化合物，其中每一二羟基羧酸独立地选自甘油酸、2,4-二羟基丁酸、2,2-双(羟基甲基)丙酸、2,2-双(羟基甲基)丁 酸、丝氨酸和苏氨酸。

5.  如权利要求2所述的化合物，其中每一羟基氨基羧酸独立地选自丝氨酸和高丝氨酸。

6.  如权利要求2所述的化合物，其中所述二氨基羧酸为氨基酸。

7.  如权利要求2所述的化合物，其中每一支化单体单元X为赖氨酸。

8.  如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：

其中每一支化单体单元X为赖氨酸。

9.  如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：

其中每一支化单体单元X为赖氨酸。

10.  如权利要求1所述的化合物，其中连接物L选自聚乙二醇、聚丝氨酸、聚甘氨酸、聚(丝氨酸-甘氨酸)、脂肪族氨基酸、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、4-氨基丁酸以及β-丙氨酸。

11.  如权利要求1所述的化合物，其中所述连接物L具有以下通式：


12.  如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物的(PEG)_m-A部分选自：

其中每一K为赖氨酸。

13.  如权利要求1所述的化合物，其中每一R独立地选自胆酸、(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-4OH)、(3α,5β,7α,12α)-7-羟基-3,12-二(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-5OH)、(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(3-氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-3OH-NH₂)、胆固醇甲酸酯、多柔比星以及大黄酸。

14.  如权利要求1所述的化合物，其中每一R为胆酸。

15.  如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：

其中
每一K为赖氨酸；
每一PEG为PEG2k；
每一支化单体单元X为赖氨酸；
每一R为胆酸；以及
连接物L具有以下通式：


16.  通式II的化合物：
(PEG)_m-L-D-(R)_n  (II)
其中
D为具有单中心基团、多个支化单体单元X和多个端基的树枝状聚合物；
L为与所述树枝状聚合物的中心基团连接的键或连接物；
每一PEG为聚乙二醇(PEG)聚合物，其中每一PEG聚合物具有1kDa至100kDa的分子量；
每一R独立地选自疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物和药物，其中存在至少两个不同的R基团；
下标n为整数2至20，其中下标n等于在所述树枝状聚合物上的端基的数量，并且其中数量n个R基团的至少一半各自独立地选自疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物和药物；并且
下标m为0或1。

17.  如权利要求16所述的化合物，其中每一支化单体单元X独立地选自二氨基羧酸、二羟基羧酸和羟基氨基羧酸。

18.  如权利要求17所述的化合物，其中每一二氨基羧酸独立地选自2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2,5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2,6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁酸和5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。

19.  如权利要求17所述的化合物，其中每一二羟基羧酸独立地选自甘油酸、2,4-二羟基丁酸、2,2-双(羟基甲基)丙酸、2,2-双(羟基甲基)丁酸、丝氨酸和苏氨酸。

20.  如权利要求17所述的化合物，其中每一羟基氨基羧酸独立地选自丝氨酸和高丝氨酸。

21.  如权利要求17所述的化合物，其中所述二氨基羧酸为氨基酸。

22.  如权利要求17所述的化合物，其中每一支化单体单元X为赖氨酸。

23.  如权利要求16所述的化合物，其中每一R独立地选自胆酸、(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸、(3α,5β,7α,12α)-7-羟基-3,12-二(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸、(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(3-氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆酸、胆固醇甲酸酯、多柔比星以及大黄酸。

24.  如权利要求16所述的化合物，其中所述化合物选自：

其中
每一支化单体单元X为赖氨酸；以及
R’和R”各自独立地选自所述树枝状聚合物的端基、疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物和药物，使得R’和R”不同。

25.  如权利要求24所述的化合物，其中：
每一R’选自胆酸(CA)、(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-4OH)、(3α,5β,7α,12α)-7-羟基-3,12-二(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-5OH)和(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(3-氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-3OH-NH₂)；以及
每一R”选自胆固醇甲酸酯(CF)、多柔比星(DOX)和大黄酸(Rh)。

26.  如权利要求25所述的化合物，其中所述化合物具有以下通式：

其中
每一X为赖氨酸；
PEG为PEG5k；以及
每一R’和R”为CA-4OH，或
每一R’和R”为CA-5OH，或
每一R’和R”为CA-3OH-NH₂。

27.  如权利要求25所述的化合物，其中所述化合物具有以下通式：

其中
每一X为具有α氨基和ε氨基的赖氨酸，其中每一R’与所述α氨基连接且每一R”与所述ε氨基连接；
PEG为PEG5k；以及
每一R’为CA且每一R”为CF，或
每一R’为CF且每一R”为CA，或
每一R’和R”为Rh，或
每一R’为CA且每一R”为Rh，或
每一R’为Rh且每一R”为CA。

28.  如权利要求25所述的化合物，其中所述化合物具有以下通式：

其中
每一X为赖氨酸；
PEG为PEG(10k)；以及
每一R’和R”为DOX。

29.  如权利要求16所述的化合物，其中连接物L选自聚乙二醇、聚丝氨酸、聚甘氨酸、聚(丝氨酸-甘氨酸)、脂肪族氨基酸、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、4-氨基丁酸以及β-丙氨酸。

30.  如权利要求16所述的化合物，其中所述连接物L具有以下通式：


31.  具有内部和外部的纳米载体，所述纳米载体包含多个权利要求1或16所述的化合物，其中每一化合物在水性溶剂中自组装以形成所述纳米载体，使得在所述纳米载体的内部中形成疏水性口袋，以及其中每一化合物的PEG在所述纳米载体的外部上自组装。

32.  如权利要求31所述的纳米载体，其中所述纳米载体还包含疏水性药物或成像剂，使得所述疏水性药物或成像剂被隔离在所述纳米载体的疏水性口袋中。

33.  如权利要求31所述的纳米载体，其中所述单体单元的至少一个任选地与选自光学探针、放射性核素、顺磁剂、金属螯合物和药物的成员连接。

34.  如权利要求32所述的纳米载体，其中所述疏水性药物选自硼替佐米、紫杉醇、SN38、喜树碱、依托泊苷和多柔比星、多西他赛、道诺霉素、VP16、强的松、地塞米松、长春新碱、长春花碱、替西罗莫司和卡莫西尼。

35.  如权利要求31所述的纳米载体，其中每一两亲性化合物R独立地选自胆酸、别胆酸、蟒胆酸、禽胆酸、脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸。

36.  治疗疾病的方法，其包括向需要这样的治疗的个体给予治疗有效量的权利要求32所述的纳米载体，其中所述纳米载体还包含药物。

37.  如权利要求36所述的方法，其中所述药物为隔离在所述纳米载体的内部中的疏水性药物。

38.  如权利要求36所述的方法，其中所述纳米载体还包含成像剂。

39.  如权利要求36所述的方法，其中所述纳米载体还包含放射性核素。

40.  成像的方法，其包括向待成像的个体给予有效量的权利要求32所述的纳米载体，其中所述纳米载体还包含成像剂。

药物递送增强的末端树枝状聚合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年12月21日提交的第61/578,579号美国临时申请的优先权，该申请以整体形式并入本文用于所有目的。
对于在联邦政府资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
本发明在国立卫生研究院授予的第CA115483号和第CA140449号基金资助下受政府支持完成。政府对本发明拥有一定权利。
发明背景
用于治疗各种癌症类型的多种有效的化学治疗剂在水中是非常不可溶的，需要引发不期望的副作用的制剂。最近，纳米治疗制剂，例如(负载紫杉醇的白蛋白纳米颗粒)、(负载多柔比星的脂质体)以及其他制剂已表现为改善药物的临床毒性特性，但它们的抗肿瘤作用仅略微好于原始的药物制剂。这一部分归因于纳米治疗制剂的相对大的尺寸(通常>100nm)，其限制了药物可渗入肿瘤块的程度。在一些情况中，这种大尺寸还导致纳米治疗剂被捕获在肝脏和网状内皮组织系统(RES)中。因此，需要开发用于体内有效递送抗癌药物的更小(20-80nm)的隐形且生物相容的纳米载体。
我们最近开发了多种新颖的用于紫杉醇(PTX)或其他疏水性药物的纳米载体。这些新颖的纳米载体包含聚(乙二醇)(PEG)和低聚胆酸，所述纳米载体能在水性条件下自组装以形成可在疏水性内部中运载PTX的核-壳(胆烷-PEG)结构。这些两亲性负载药物的纳米颗粒通过自身具有改善的临床毒性特性而为治疗的。更重要地，当由癌细胞表面靶向配体和/或肿瘤血管配体修饰时，这些纳米载体能向肿瘤位点递送毒性治疗剂。纳米载体的最终尺寸(10nm至100nm)通过使用各种不同的胆烷-PEG制剂或其组合而为可调节的。纳米载体组分，即PEG 和胆酸，均为生物相容的且很大程度上为无毒的。实际上，PTX纳米治疗剂在用于小鼠模型和伴侣犬的抗癌治疗的体内给药中表现出安全特性。然而，纳米载体在体外和体内均表现出一些溶血活性，以及对于某些药物表现出降低的负载容量。因此，对开发具有改善的生物相容性和多功能性的纳米载体存在着需求。
本发明基于以下出人意料的发现：对组成构建单元(building blocks)的亲水性片段和疏水性片段的某些改变在不干扰纳米载体组装的情况下改善治疗性质，解决了上述需求。
发明简述
在第一方面，本发明提供了通式I的化合物：
(PEG)_m-A-L-D-(R)_n  (I)
其中通式I的基团D为具有单中心基团、多个支化单体单元X和多个端基的树枝状聚合物。通式I的基团L为与树枝状聚合物的中心基团连接的键或连接物。通式I的每一PEG为聚乙二醇(PEG)聚合物，其中每一PEG聚合物具有1kDa至100kDa的分子量。通式I的基团A为与至少两个PEG基团连接的单体或低聚物。通式I的每一R独立地为树枝状聚合物的端基、疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物或药物，使得当R不为端基时，每一R与端基之一连接。通式I的下标n为整数2至20，其中下标n等于在所述树枝状聚合物上的端基的数量，并且其中数量n个R基团的至少一半各自独立地为疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物或药物。通式I的下标m为整数2至20。
在第二方面，本发明提供了具有内部和外部的纳米载体，所述纳米载体包括多个通式I的化合物，其中每一化合物在水性溶剂中自组装以形成所述纳米载体，使得在所述纳米载体的内部中形成疏水性口袋，并且其中每一化合物的PEG在所述纳米载体的外部上自组装。
在第三方面，本发明提供了治疗疾病的方法，其包括向需要这样的治疗的个体给予治疗有效量的上述纳米载体，其中所述纳米载体还包括药物。
在第四方面，本发明提供了成像的方法，其包括向待成像的个体 给予有效量的上述纳米载体，其中所述纳米载体还包括成像剂。
在第五方面，本发明提供了通式II的化合物：
(PEG)_m-L-D-(R)_n  (II)
其中通式II的基团D为具有单中心基团、多个支化单体单元X和多个端基的树枝状聚合物。通式II的基团L为与树枝状聚合物的中心基团连接的键或连接物。通式II的每一PEG为聚乙二醇(PEG)聚合物，其中每一PEG聚合物具有1kDa至100kDa的分子量。通式II的每一R独立地为疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物或药物，其中存在至少两个不同的R基团。通式II的下标n为整数2至20，其中下标n等于在所述树枝状聚合物上的端基的数量，并且其中数量n个R基团的至少一半各自独立地为疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物或药物。通式II的下标m为0或1。
附图简述
图1示出末端树枝状聚合物构造的实例。
图2示出蝴蝶结形末端树枝状聚合物的A-L-D-(R)_n片段的多种构造。
图3示出成蝴蝶结形的聚合物1和2在负载PTX和DOX之前和之后的粒径和药物负载容量。
图4示出用于PTX递送而设计和合成的聚合物的结构和性质。
图5示出在不同时间点：(A)4h和(B)20h，与PEG^5kCA₈和PEG^2kCA₄相比，蝴蝶结形聚合物(PEG^2k)2CA₈和(PEG^2k)3CA₈的溶血性质。成蝴蝶结形的聚合物在孵育20h之后甚至在1mg/mL的最高浓度下也呈现最小的溶血性质。
图6示出末端树枝状聚合物的构建单元的合成方案。试剂和条件：i)TFAA,无水THF,0～5℃,1.5hr；ii)t-BuOH,低于5℃,然后在室温7hr；iii)NH₃·H₂O(20～30％),0～5℃12hr，然后室温4hr；iv)表氯醇,50％NaOH,(n-Bu)₄NOH·30H₂O,CH₂Cl₂,室温,16hr；v)于MeOH中的NH₃(7M)，于封闭容器中的LiCl(1.2当量),室温,24hr；vi)Fmoc-OSu(1.2当量),DIEA(1.5当量),CH₂Cl₂,12hr；vii)于CH₂Cl₂中 的50％TFA,0℃,30min；viii)LiOH水溶液(10当量),室温,18～36hr；xi)SuOH(1.2当量),DCC(1.2当量),CH₂Cl₂,室温,12hr。
图7示出将3-甘油胆酸用作构建单元的末端树枝状聚合物PEG5kCA-4OH8的化学结构。
图8示出胆酸末端树枝状聚合物的结构和性质。(A)具有不同官能团的改性胆酸衍生物的化学结构；(B)在PTX负载之前和之后的末端树枝状聚合物PEG^5kCA-4OH₈胶束的DLS粒径；(C-D)在不同浓度和不同孵育时间下，与PEG^5kCA₈相比，在PTX负载之前和之后的末端树枝状聚合物PEG^5kCA-4OH₈的溶血性质。
图9示出经改造和杂化的末端树枝状聚合物PEG^10kCONH-DOX₄、PEG^10kCONHN＝DOX₄、PEG^5k-Rh₈、PEG^5k-CA₄CF₄、PEG^5k-Rh₄^αCA₄^ε和PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε的结构。
图10示出PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε末端树枝状聚合物的表征。PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε的MALDI-TOF MS谱揭示了明确定义的结构；DLS粒径分析示出在PTX负载之前和之后的窄分散粒径；D₂O中的质子NMR谱示出PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε和DOX-PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε的核结构的显著抑制信号，表明胶束中的紧密核结构形成。
图11示出针对细胞培养物中三种淋巴瘤细胞系，在DOX负载之前和之后的杂化PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε末端树枝状聚合物的细胞毒性。
图12示出与其他末端树枝状聚合物制剂相比，在孵育不同时间(A,4h；B,20h)之后PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε胶束的溶血性质。PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε在DOX负载之前和之后未表现出可观察到的溶血，然而，典型的末端树枝状聚合物甚至在较早的时间点(4h)处表现出显著的溶血。
图13示出在MTD研究中静脉内给予相等剂量的游离DOX或DOX-PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε胶束的正常BALB/c小鼠(n＝4)的体重变化。
图14示出在皮下Raji肿瘤异种移植小鼠模型中不同DOX制剂的静脉内治疗之后的体内抗肿瘤效能(A)、Kaplan-Meier存活曲线(B)和体重变化(C)。分别在第0天、第4天和第8天以10mg/kg剂量向携带肿瘤的小鼠(n＝5-8)静脉内给予PBS、DOX、DOX-PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε胶束。
图15示出治疗研究中的血清化学(肝功能和肾功能测试)，包括BUN(A)、AST(B)和ALT(C)。
图16概述在治疗研究中于最后给药之后第7天的血细胞计数。
图17示出在携带Raji肿瘤的小鼠中于不同DOX制剂的最后给药之后第7天的肌氨酸激酶(CK,B)和乳酸脱氢酶(LDH,A)的血清水平。每一数据点表示为平均值±SEM。*P<0.05。
发明详述
I.概述
本发明提供了末端树枝状聚合物，其具有亲水性聚(乙二醇)(PEG)片段以及支化疏水性片段或支化两亲性片段。末端树枝状聚合物的PEG片段可以包含一个或多个具有线性或支化构造的PEG链。还描述了杂化末端树枝状聚合物，且其具有共价结合的载物部分(cargo moieties)，例如胆酸基团和疏水性药物。末端树枝状聚合物可以聚集以形成具有疏水性内部和亲水性外部的纳米载体。可由具有疏水面和亲水面的胆酸来提供纳米载体的疏水核。胆酸部分可以经化学改性以改变纳米载体组装和稳定性。例如，可以使用具有改性的亲水面的胆酸衍生物。纳米载体可非共价地隔离疏水性药物或用于向个体递送的具有低水溶解度的其他载物。
II.定义
如本文所用，术语“树枝状聚合物(dendrimer)”和“树枝状聚合物(dendritic polymer)”是指包含中心、多个支化单体单元和多个端基的支化聚合物。单体连接在一起以形成从中心延伸并在端基结束的臂(或“树突(dendrons)”)。树枝状聚合物的中心可以与本发明化合物的其他片段连接，并且端基可以被其他化学部分进一步官能化。
如本文所用，术语“末端树枝状聚合物”是指以下树枝状聚合物，其包含亲水性PEG片段以及与该树枝状聚合物的一个或多个端基共价结合的一个或多个化学部分。这些部分可以包括但不限于疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物以及药物。使用正交保护基团策略， 可以将不同的部分选择性地安装于期望的端基。
如本文所用，术语“蝴蝶结形(bow-tie)树枝状聚合物”或“蝴蝶结形末端树枝状聚合物”是指包含使用连接物部分在其中心处连接在一起的两个支化片段(例如，树枝状聚合物和支化的PEG部分)的树枝状聚合物。
如本文所用，术语“树枝状聚合物(dendrimer)”和“树枝状聚合物(dendritic polymer)”是指包含中心、多个支化单体单元和多个端基的支化聚合物。单体连接在一起以形成从中心延伸并在端基结束的臂(或“树突(dendrons)”)。树枝状聚合物的中心可以与末端树枝状聚合物的其他片段连接，并且端基可以被其他化学部分进一步官能化。
如本文所用，术语“纳米载体”是指由本发明的树枝状聚合物缀合物(conjugate)的聚集而产生的胶束。纳米载体具有疏水性核和亲水性外部。
如本文所用，术语“单体”和“单体单元”是指二氨基羧酸、二羟基羧酸和羟基氨基羧酸。本发明的二氨基羧酸的实例包括但不限于2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2,5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2,6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁酸和5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。本发明的二羟基羧酸的实例包括但不限于甘油酸、2,4-二羟基丁酸、甘油酸、2,4-二羟基丁酸、2,2-双(羟基甲基)丙酸和2,2-双(羟基甲基)丁酸。羟基氨基羧酸的实例包括但不限于丝氨酸和高丝氨酸。本领域技术人员会认识到其他单体单元可用于本发明。
如本文所用，术语“氨基酸”是指携带胺官能团的羧酸。氨基酸包括上述二氨基羧酸。氨基酸包括天然存在的α-氨基酸，其中胺结合于与羧酸的羰基碳相邻的碳。天然存在的α-氨基酸的实例包括但不限于L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸和L-精氨酸。氨基酸还包括天然存在的α-氨基酸的D-对映异构体以及β-氨基酸和其他非天然存在的氨基酸。
如本文所用，术语“连接物”是指使树枝状聚合物缀合物的一个片段与另一个片段相连接的化学部分。用于将连接物连接于树枝状聚合 物的片段的键的类型包括但不限于酰胺、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫醚、硫代氨基甲酸酯、硫代碳酸酯和硫脲。本领域技术人员会认识到其他键类型可用于本发明。
如本文所用，术语“低聚物”是指五个或更少的共价连接在一起的如上所述的单体。单体可以以线性或支化方式连接在一起。低聚物可以用作末端树枝状聚合物的支化片段的中心。
如本文所用，术语“疏水性基团”是指不可溶于水的或被水排斥的化学部分。疏水性基团的实例包括但不限于长链烷烃和脂肪酸、碳氟化物、硅酮、诸如胆固醇的某些类固醇，以及许多聚合物，包括例如聚苯乙烯和聚异戊二烯。
如本文所用，术语“亲水性基团”是指可溶于水的或被水吸引的化学部分。亲水性基团的实例包括但不限于醇、短链羧酸、季胺、磺酸盐、磷酸盐、糖和某些聚合物，例如PEG。
如本文所用，术语“两亲性化合物”是指具有疏水性部分和亲水性部分二者的化合物。例如，本发明的两亲性化合物能具有化合物的一个亲水面和化合物的一个疏水面。可用于本发明的两亲性化合物包括但不限于胆酸以及胆酸类似物及衍生物。
如本文所用，术语“胆酸”是指(R)-4-((3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊[a]菲-17-基)戊酸。胆酸还被称为3α,7α,12α-三羟基-5β-胆烷酸；3-α,7-α,12-α-三羟基-5-β-胆烷-24-酸；17-β-(1-甲基-3-羧基丙基)本胆烷-3α,7α,12α-三醇；胆酸(cholalic acid)；以及胆酸(cholalin)。胆酸衍生物及类似物，例如别胆酸、蟒胆酸、禽胆酸(avicholic acid)、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸，也可用于本发明。胆酸衍生物可以设计为调节由末端树枝状聚合物组装而产生的纳米载体的性质，例如胶束稳定性和膜活性。例如，胆酸衍生物能具有被一个或多个甘油基团、氨基丙二醇基团或其他基团修饰的亲水面。
如本文所用，术语“药物”或“治疗剂”是指能治疗和/或减轻病况或疾病的作用剂。药物可以为疏水性药物，其为任何排斥水的药物。可用于本发明的疏水性药物包括但不限于紫杉醇、多柔比星、依托泊苷、 伊立替康、SN-38、环孢菌素A、鬼臼毒素、卡氮芥、两性霉素、伊沙匹隆、帕土匹龙(埃博霉素类)、雷帕霉素和铂类药物。本发明的药物还包括前药形式。本领域技术人员会认识到其他药物可用于本发明。
如本文所用，术语“成像剂”是指使身体器官、组织或系统成像的化学品。示例性成像剂包括顺磁剂、光学探针和放射性核素。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指在治疗或减轻损伤、病理、病状或症状(例如疼痛)方面的任何成功标志，包括任何客观或主观参数，例如症状的减轻、消退、消失，或者使症状、损伤、病理或病况对于患者而言更耐受，减少症状或病况的频率或持续时间，或者在某些情况中，防止症状或病况的发作。症状的治疗或减轻能基于任何客观或主观的参数，包括例如体检结果。
如本文所用，术语“个体”是指动物，例如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，所述个体为人。
如本文所用，术语“治疗有效量或剂量”或“治疗足够量或剂量”或“有效或足够量或剂量”是指产生给药所预期的治疗作用的剂量。准确的剂量将取决于治疗目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；and Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)来确定。在敏化细胞中，治疗有效剂量通常可低于非敏化细胞的常规治疗有效剂量。
III.末端树枝状聚合物
本发明提供了具有亲水性聚(乙二醇)(PEG)片段和疏水性片段的两亲性末端树枝状聚合物缀合物。PEG片段可以具有包括一个或多个PEG链的支化或线性构造。蝴蝶结形末端树枝状聚合物包含具有至少两个PEG链的支化PEG片段。可由具有疏水面和亲水面的胆酸来提 供末端树枝状聚合物的疏水片段。胆酸和PEG通过包含多种酸重复单元的低聚物和/或聚合物来连接。典型地，低聚物和聚合物包括二氨基羧酸、赖氨酸。末端树枝状聚合物可以在溶液中聚集以形成具有疏水性内部和亲水性外部的胶束。该胶束可以用作纳米载体以递送药物或具有低水溶解度的其他试剂。
本发明提供了PEG化树枝状聚合物(称为末端树枝状聚合物)，其包含胆酸基团和在树枝状聚合物周围的其他部分。在一些实施方案中，本发明提供了通式II的化合物：
(PEG)_m-L-D-(R)_n  (II)
其中通式II的基团D为具有单中心基团、多个支化单体单元X和多个端基的树枝状聚合物。通式II的基团L为与树枝状聚合物的中心基团连接的键或连接物。通式II的每一PEG为聚乙二醇(PEG)聚合物，其中每一PEG聚合物具有1kDa至100kDa的分子量。通式II的每一R独立地为树枝状聚合物的端基、疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物或药物，使得当R不为端基时，每一R与端基之一连接。通式II的下标n为整数2至20，其中下标n等于在所述树枝状聚合物上的端基的数量，并且其中数量n个R基团的至少一半各自独立地为疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物或药物。通式II的下标m为0或1。
在一些实施方案中，存在至少两个不同的R基团，例如两个不同的两亲性基团，或者两亲性基团和药物，或者两亲性基团和树枝状聚合物端基，或者两种不同的药物，或者药物和树枝状端基。
所述树枝状聚合物可为任何合适的树枝状聚合物。树枝状聚合物可由包括氨基酸或其他双官能AB2-型单体的支化单体单元形成，其中A和B为两种不同的能在一起反应以使所得聚合物链具有形成A-B键的支化点的官能团。在一些实施方案中，每一支化单体单元X可为二氨基羧酸、二羟基羧酸和羟基氨基羧酸。在一些实施方案中，每一二氨基羧酸可为2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2,5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2,6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁 酸或5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。在一些实施方案中，每一二羟基羧酸可为甘油酸、2,4-二羟基丁酸、2,2-双(羟基甲基)丙酸、2,2-双(羟基甲基)丁酸、丝氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，每一羟基氨基羧酸可为丝氨酸或高丝氨酸。在一些实施方案中，二氨基羧酸为氨基酸。在一些实施方案中，每一支化单体单元X为赖氨酸。
末端树枝状聚合物的树枝状聚合物可为树枝状聚合物的任何合适的代，包括1、2、3、4、5代或更多代，其中树枝状聚合物的每一“代”是指在树枝状聚合物的一个分支之后，在中心与端基之间交汇的支化点的数量。末端树枝状聚合物的树枝状聚合物还可以包括局部代(partial-generation)，例如1.5、2.5、3.5、4.5、5.5等，其中树枝状聚合物的支化点仅具有单一的分支。参见，例如，图2的结构。树枝状聚合物的各种构造可以提供任何合适数量的端基，包括但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个端基。
末端树枝状聚合物或末端树枝状聚合物片段的中心可以为任何合适的官能团。在一些实施方案中，中心包括使末端树枝状聚合物或末端树枝状聚合物片段与另一片段连接的官能团。中心官能团可为亲核基团，包括但不限于醇、胺、硫醇或肼。中心官能团还可以为亲电子体，例如醛、羧酸或羧酸衍生物，包括酰基氯或N-羟基琥珀酰亚胺基酯。
安装在末端树枝状聚合物周围的R基团可以为任何合适的化学部分，包括亲水性基团、疏水性基团或两亲性化合物。疏水性基团的实例包括但不限于长链烷烃和脂肪酸、碳氟化物、硅酮、诸如胆固醇的某些类固醇，以及许多聚合物，包括例如聚苯乙烯和聚异戊二烯。亲水性基团的实例包括但不限于醇、短链羧酸、胺、磺酸盐、磷酸盐、糖和某些聚合物，例如PEG。两亲性化合物的实例包括但不限于具有一个亲水面和一个疏水面的分子。
可用于本发明的两亲性化合物包括但不限于胆酸以及胆酸类似物及衍生物。“胆酸”是指(R)-4-((3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊[a]菲-17-基)戊酸，其 具有结构：

胆酸衍生物和类似物包括但不限于别胆酸、蟒胆酸、禽胆酸、脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸。胆酸衍生物可以设计为调节由末端树枝状聚合物组装而产生的纳米载体的性质，例如胶束稳定性和膜活性。例如，胆酸衍生物可具有被一个或多个甘油基团、氨基丙二醇基团或其他基团修饰的亲水面。
末端树枝状聚合物端基还可以包括药物，例如紫杉醇、多柔比星、依托泊苷、伊立替康、SN-38、环孢菌素A、鬼臼毒素、卡氮芥、两性霉素、伊沙匹隆、帕土匹龙(埃博霉素类)、雷帕霉素和铂类药物。本领域技术人员会认识到其他药物可用于本发明。
在一些实施方案中，每一R可为胆酸、(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸、(3α,5β,7α,12α)-7-羟基-3,12-二(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸、(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(3-氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆酸、胆固醇甲酸酯、多柔比星或大黄酸。
末端树枝状聚合物骨架可根据分支数量以及端基和R基团的数量和化学性质而变化，其会调节溶液构象、流变学性质和其他特性。末端树枝状聚合物可具有任何合适数量n的端基和任何合适数量的R基团。在一些实施方案中，n可以为2-70，或2-50，或2-30，或2-10。在一些实施方案中，n为2-20。
末端树枝状聚合物可具有在周围上的单一类型的R基团，或任何合适比例的R基团的任何组合。通常，数量n个R基团的至少一半不是端基。例如，数量n个R基团的至少一半可为疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物、药物或其任何组合。在一些实施方案中，数量n个R基团的一半为两亲性化合物。末端树枝状聚合物的实例包括但不限于图1所示的那些。
在一些实施方案中，化合物可以具有以下通式之一：

其中每一支化单体单元X为赖氨酸；并且R’和R”各自独立地为树枝状聚合物的端基、疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物或药物，使得R’和R”不同。在一些实施方案中，每一R’可为胆酸(CA)、(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-4OH)、(3α,5β,7α,12α)-7-羟基-3,12-二(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-5OH)或(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(3-氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-3OH-NH₂)；并且每一R”可以为胆固醇甲酸酯(CF)、多柔比星(DOX)和大黄酸(Rh)。
在一些实施方案中，化合物具有以下通式：

其中每一X为赖氨酸；PEG为PEG5k；并且每一R’和R”为CA-4OH，或每一R’和R”为CA-5OH，或每一R’和R”为CA-3OH-NH₂。
在一些实施方案中，化合物具有以下通式：

其中每一X为赖氨酸。每一R’与赖氨酸α胺连接，并且每一R”与赖氨酸ε胺连接。PEG为PEG5k。每一R’为CA且每一R”为CF；或每一R’为CF且每一R”为CA；或每一R’和R”为Rh；或每一R’为CA且每一R”为Rh；或每一R’为Rh且每一R”为CA。
在一些实施方案中，化合物具有以下通式：

其中每一X为赖氨酸；PEG为PEG(10k)；并且每一R’和R”为DOX。
连接物L可包括任何合适的连接物。通常，连接物为双官能连接物，其具有用于与两个末端树枝状聚合物片段中的每一个进行反应的两个官能团。在一些实施方案中，连接物可为杂双官能连接物。在一些实施方案中，连接物可为同双官能连接物。在一些实施方案中，连接物L可为聚乙二醇、聚丝氨酸、聚甘氨酸、聚(丝氨酸-甘氨酸)、脂肪族氨基酸、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、4-氨基丁酸或β-丙氨酸。本领域技术人员会认识到，连接物的尺寸和化学性质可根据将要连接的末端树枝状聚合物片段的结构而变化。
在一些实施方案中，连接物L具有以下通式：

任何尺寸和构造的聚乙二醇(PEG)聚合物可用于本发明的纳米载体。在一些实施方案中，PEG为1kDa至100kDa。在其他实施方案中，PEG为1kDa至10kDa。在一些其他实施方案中，PEG为约3kDa。在又一些其他实施方案中，额外的PEG聚合物连接至两亲性化合物。例如，当两亲性化合物为胆酸时，高达3个PEG聚合物连接至每一个胆酸。与两亲性化合物连接的PEG聚合物在尺寸上为200Da至10,000Da。在另一些其他实施方案中，与两亲性化合物连接的PEG聚合物在尺寸上为1kDa至5kDa。本领域技术人员会认识到其他PEG聚合物和其他亲水性聚合物可用于本发明。PEG可为任何合适的长度。
IV.具有支化PEG部分的末端树枝状聚合物
本发明的蝴蝶结形末端树枝状聚合物包含在其中心处连接在一起的两个支化片段。通常，蝴蝶结形末端树枝状聚合物包括上述或如以前(WO 2010/039496)所述的任何末端树枝状聚合物以及包含两个或更多个与低聚物中心结合的PEG链的支化PEG片段。本发明的一些实 施方案提供了通式I的化合物：
(PEG)_m-A-L-D-(R)_n  (I)
其中D、L和PEG如上所述。通式I的基团A为与至少两个PEG基团连接的单体或低聚体。通式I的每一R独立地为树枝状聚合物的端基、疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物或药物，使得当R不为端基时，每一R与端基之一连接。通式I的下标n为整数2至20，其中下标n等于在所述树枝状聚合物上的端基的数量，并且其中数量n个R基团的至少一半各自独立地为疏水性基团、亲水性基团、两亲性化合物或药物。通式I的下标m为整数2至20。
末端树枝状聚合物的树枝状聚合物可为树枝状聚合物的任何合适的代，包括1、2、3、4、5代或更多代，其中树枝状聚合物的每一“代”是指在树枝状聚合物的一个分支之后，在中心与端基之间交汇的支化点的数量。末端树枝状聚合物的树枝状聚合物还可以包括局部代，例如1.5、2.5、3.5、4.5、5.5等，其中树枝状聚合物的支化点仅具有单一的分支。参见，例如，图2的结构。树枝状聚合物的各种构造可以提供任何合适数量的端基，包括但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个端基。
在一些实施方案中，化合物可为：

其中每一支化单体单元X为赖氨酸。
在一些实施方案中，化合物可为：

其中每一支化单体单元X为赖氨酸。
蝴蝶结形末端树枝状聚合物的PEG-低聚物单元可以包含任何合适数量的PEG部分。使用正交保护基团，可以将PEG部分以位点选择性方式安装在低聚物上的不同位置。在一些实施方案中，化合物的(PEG)_m-A部分可以为：

其中每一K为赖氨酸。
在一些实施方案中，末端树枝状聚合物可为：

其中每一K为赖氨酸；每一PEG为PEG2k；每一支化单体单元X为赖氨酸；每一R为胆酸；并且连接物L具有以下通式：

V.纳米载体
本发明的末端树枝状聚合物聚集以形成具有疏水性核和亲水性外部的纳米载体。在一些实施方案中，本发明提供了具有内部和外部的纳米载体，所述纳米载体包括多个本发明的树枝状聚合物缀合物，其中每一化合物在水性溶剂中自组装以形成所述纳米载体，使得在所述纳米载体的内部中形成疏水性口袋，并且其中每一化合物的PEG在所述纳米载体的外部上自组装。
在一些实施方案中，纳米载体包括疏水性药物或成像剂，使得所述疏水性药物或成像剂被隔离在纳米载体的疏水性口袋中。可用于本发明的纳米载体的疏水性药物包括任何具有低水溶解度的药物。在一些实施方案中，在纳米载体中的疏水性药物可以为硼替佐米、紫杉醇、SN38、喜树碱、依托泊苷和多柔比星、多西他赛、道诺霉素、VP16、 强的松、地塞米松、长春新碱、长春花碱、替西罗莫司(temsirolimus)和卡莫西尼(carmusine)。
在一些实施方案中，纳米载体包括至少一个单体单元，所述单体单元任选地与光学探针、放射性核素、顺磁剂、金属螯合物或药物连接。药物可以为多种亲水性或疏水性药物，并且不限于在本发明的纳米载体的内部中被隔离的疏水性药物。
可在纳米载体中被隔离或连接于本发明的缀合物的药物包括但不限于：细胞抑制剂、细胞毒素剂(例如但不限于DNA相互作用剂(例如顺铂或多柔比星))；紫杉烷(例如泰素帝、紫杉醇)；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷)；拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康(或CPT-11)、肯托斯塔(camptostar)或拓扑替康)；微管蛋白相互作用剂(例如紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛或埃博霉素)；激素类药剂(例如它莫西芬)；胸苷酸(thymidilate)合酶抑制剂(例如5-氟尿嘧啶)；抗代谢药物(例如氨甲喋呤)；烷化剂(例如替莫唑胺(来自Schering-Plough Corporation,Kenilworth,N.J.的TEMODAR^TM)、环磷酰胺)；芳香化酶组合；阿糖胞苷、阿霉素、环磷酰胺(cytoxan)以及吉西他滨。可用于本发明的纳米载体的其他药物包括但不限于：尿嘧啶氮芥、氮芥、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基密胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、奥沙利铂、亚叶酸(leucovirin)、奥沙利铂(来自法国的Sanofi-Synthelabo Pharmaceuticals的ELOXATIN^TM)、喷司他丁(Pentostatine)、长春花碱、长春新碱、长春地辛、博来霉素、更生霉素、道诺霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、光神霉素、脱氧助间型霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、替尼泊苷、17α-炔雌醇、己烯雌酚、睾酮、强的松、氟羟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲基强的松龙、甲基睾酮、氢化波尼松、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌氮芥、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬、戈舍瑞林、顺铂、卡铂、羟基脲、安吖啶、丙卡巴肼、米托坦、米托蒽醌、左旋咪唑、诺维本(Navelbene)、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨、雷洛塞芬(Reloxafine)、 屈洛塞芬(Droloxafine)或六甲密胺。前药形式也可用于本发明。
可用于本发明的其他药物还包括放射性核素，例如⁶⁷Cu、⁹⁰Y、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re和²¹¹At。在一些实施方案中，放射性核素可在治疗上用作药物或成像剂。
成像剂包括顺磁剂、光学探针和放射性核素。顺磁剂包括铁颗粒，例如在纳米载体的疏水性口袋中被隔离的铁纳米颗粒。
本发明的一些实施方案提供了纳米载体，其中每一两亲性化合物R独立地为胆酸、别胆酸、蟒胆酸、禽胆酸、脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸。
VI.治疗方法
例如通过在纳米载体的内部隔离疏水性药物，或通过药物与纳米载体的缀合物的共价连接，本发明的纳米载体可用于治疗任何需要药物给药的疾病。通过在纳米载体的内部隔离成像剂，或通过成像剂与纳米载体的缀合物的连接，所述纳米载体也可用于成像。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病的方法，其包括向需要这样的治疗的个体给予治疗有效量的本发明的纳米载体，其中所述纳米载体包含药物。所述药物能与纳米载体的缀合物共价连接。在一些实施方案中，所述药物为隔离在纳米载体的内部的疏水性药物。在一些实施方案中，纳米载体还包括成像剂。成像剂可与纳米载体的缀合物共价连接，或者成像剂可被隔离在纳米载体的内部中。在一些其他实施方案中，疏水性药物和成像剂均被隔离在纳米载体的内部中。在另一些其他实施方案中，药物和成像剂均共价地连接至纳米载体的一个缀合物或多个缀合物。在又一些其他实施方案中，纳米载体还可包括放射性核素。
本发明的纳米载体可以被给予个体用于治疗，例如过度增殖病症，包括癌症，例如但不限于癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、成胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌和Burkitt淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道 癌、睾丸癌、宫颈癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、胰内分泌腺癌、类癌、骨癌、皮肤癌、成视网膜细胞瘤、多发性骨髓癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(其他癌症参见CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE(DeVita,V.T.等人编辑，2008))。
可通过本发明的纳米载体治疗的其他疾病包括：(1)炎性或过敏性疾病，例如全身性过敏或超敏应答、药物过敏、昆虫螯刺过敏；炎性肠疾病，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎、回肠炎和肠炎；阴道炎；银屑病和炎性皮肤病，例如皮炎、湿疹、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、荨麻疹；血管炎；脊椎关节病；硬皮病；呼吸系统过敏疾病，例如哮喘、过敏性鼻炎、超敏性肺病等，(2)自身免疫疾病，例如关节炎(类风湿性关节炎和银屑病性关节炎)、骨关节炎、多发性硬化、全身性红斑狼疮、糖尿病、肾小球肾炎等，(3)移植排斥(包括同种异体移植物排斥和移植物抗宿主病)，以及(4)将抑制其中不期望的炎性应答的其他疾病(例如，动脉粥样硬化、肌炎、神经病症如中风和封闭式头损伤、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、脑炎、脑膜炎、骨质疏松症、痛风、肝炎、肾炎、败血症、类肉状瘤病、结膜炎、耳炎、慢性阻塞性肺病、鼻窦炎和白塞氏综合征)。
此外，本发明的纳米载体可用于治疗由诸如病毒、细菌、真菌和寄生虫的病原体引发的感染。可使用本发明的纳米载体治疗其他疾病。
A.制剂
本发明的纳米载体可以以本领域技术人员已知的多种不同的方式来配制。药物可接受的载体部分地由所施用的具体组合物以及由用于施用组合物的具体方法来确定。因此，本发明的药物组合物有广泛的多种合适的制剂(参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第20版,2003,见上文)。有效的制剂包括口服和鼻用制剂、用于胃肠外给药的制剂以及为延长释放而配制的组合物。
适于口服给药的制剂可由以下组成：(a)液体溶液，例如有效量的悬浮于稀释剂(例如水、盐水或PEG400)中的本发明的化合物；(b)胶 囊、药囊、储库或片剂，每一种均包含预定量的为液体、固体、颗粒或明胶形式的活性成分；(c)在合适的液体中的悬浮剂；(d)合适的乳剂；以及(e)贴剂。上述液体溶液可为无菌溶液。药物形式可包含以下的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸以及其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂以及药物相容的载体。锭剂形式可包含在调味剂(例如，蔗糖)中的活性成分，以及包含在惰性基质(例如，明胶和甘油)中的活性成分或蔗糖和阿拉伯树胶乳液、凝胶等的锭剂(pastille)，其除了活性成分之外还包括本领域已知的载体。
药物制剂优选为单位剂型。在这样的形式中，制剂被细分为包含适量的活性组分的单位剂量。单位剂型可为包装的制剂，该包装包含离散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊以及在小瓶或安瓿中的粉末。此外，单位剂型自身可为胶囊、片剂、扁囊剂(cachet)或锭剂，或者其可为合适数量的为包装形式的这些单位剂型中的任一种。若需要，组合物还可包含其他相容的治疗剂。优选的药物制剂可递送持续释放的制剂中的本发明化合物。
可用于本发明的药物制剂还包含延长释放的制剂。在一些实施方案中，可用于本发明的延长释放的制剂描述于第6,699,508号美国专利中，其可以根据第7,125,567号美国专利制备，两个专利均通过引用并入本文。
药物制剂通常被递送至哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。使用本方法治疗的非人哺乳动物包括驯养动物(即，犬、猫、鼠、啮齿类和兔)和农业动物(牛、马、绵羊、猪)。
在本发明方法的实施中，药物组合物可以单独使用，或与其他治疗剂或诊断剂组合地使用。
B.给药
本发明的纳米载体可根据所需频率来给药，包括每小时一次，每天一次、每周一次或每月一次。用于本发明的药物方法的化合物以每 天约0.0001mg/kg至约1000mg/kg的初始剂量来给药。可使用的日剂量范围为约0.01mg/kg至约500mg/kg，或约0.1mg/kg至约200mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg，或约10mg/kg至约50mg/kg。然而，剂量可以根据患者需求、治疗的病况的严重性和所采用的化合物而变化。例如，考虑到特定患者中诊断的疾病的类型和阶段，可根据经验确定剂量。在本发明的上下文中，向患者给予的剂量应足以随时间在患者中实现有益的治疗反应。还将通过在特定患者中给予特定化合物所伴随的任何副作用的存在、性质和程度来确定剂量的大小。针对特定情况来确定适当剂量在从业者的技能范围之内。通常，以低于化合物最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，通过小幅增加来提高剂量，直至达到所处情况下的最佳效果。为简便起见，若需要，每日总剂量可被分开并在一天中分批给药。根据进行治疗的医师的决定，可以每天或隔天给药。还可在较长时段(数周、数月或数年)内定期或连续的给药，例如通过使用皮下胶囊、药囊或储库，或者通过贴剂或泵。
可以多种方式向患者给予药物组合物，包括表面、胃肠外、静脉内、皮内、皮下、肌内、结肠、直肠或腹膜内。优选地，胃肠外地、表面地、静脉内地、肌内地、皮下地、口服地或经鼻地(例如通过吸入)给予药物组合物。
在本发明方法的实施中，药物组合物可以单独使用，或与其他治疗剂或诊断剂组合地使用。用于本发明的组合方案的其他药物可分别给予，或用于该组合方案的药物中的一种或多种可一起给予，例如在混合物中。当一种或多种药物分别给予时，每一药物给药的时间和方案可以变化。其他治疗剂或诊断剂可与本发明的化合物同时给予、分别地给予或在不同时间给予。
VII.成像方法
在一些实施方案中，本发明提供了成像的方法，其包括向待成像的个体给予有效量的本发明的纳米载体，其中所述纳米载体包含成像剂。在其他实施方案中，使用具有药物和成像剂二者的纳米载体来同时完成治疗方法和成像方法。
示例性成像剂包括顺磁剂、光学探针和放射性核素。顺磁剂为在外加场下为磁性的成像剂。顺磁剂的实例包括但不限于铁颗粒，包括纳米颗粒。光学探针为可通过在一个辐射波长处激发并在第二个不同的辐射波长处检测而被检测到的荧光化合物。可用于本发明的光学探针包括但不限于Cy5.5、Alexa680、Cy5、DiD(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐)以及DiR(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物)。其他光学探针包括量子点。放射性核素为经历放射性衰变的元素。可用于本发明的放射性核素包括但不限于³H、¹¹C、¹³N、¹⁸F、¹⁹F、⁶⁰Co、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Ga、⁸²Rb、⁹⁰Sr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、^99mTc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁹I、¹³¹I、¹³⁷Cs、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹¹At、Rn、Ra、Th、U、Pu和²⁴¹Am。
VIII.实施例
实施例1.蝴蝶结形聚合物PEG^2k₂CA₈的合成

经由Fmoc肽化学，在固体树脂上合成成蝴蝶结形的聚合物。通过于DMF中的20％4-甲基哌啶的处理来除去Rink Amide树脂上的Fmoc保护基团。将HOBt/DIC用作偶联剂，将(Alloc)-Lys(Fmoc)-OH结合到树脂上的游离氨基上。在除去树脂上的Fmoc基团之后，将(Fmoc)₂Lys-OH偶联到树脂上。然后，在除去Fmoc基团后，经由HOBt/DIC结合，将PEG-COOH(2000Da)结合至树脂上的两个氨基。然后，经由于DCM中的(P(Ph)3)4Pd的处理来除去Alloc保护基团。然后，将FmocNH-EG-OH连接物结合到树脂上，然后将Fmoc2Lys-OH用作构建单元，由此在小珠上合成支化聚赖氨酸。最后，用胆酸OSu酯封盖第三代树枝状聚赖氨酸的游离氨基。然后，用TFA/TIS/水 (95:2.5:2.5)混合物溶液处理树脂以将蝴蝶结形聚合物裂解进入溶液。通过鼓风来除去裂解溶液，然后将聚合物由冰冷冻的乙醚沉淀，并用冷冻乙醚洗涤三次。
实施例2.蝴蝶结形聚合物PEG^2k₃CA₈的合成

经由Fmoc肽化学，在固体树脂上合成成蝴蝶结形的聚合物。通过于DMF中的20％4-甲基哌啶的处理来除去Rink Amide树脂上的Fmoc保护基团。将HOBt/DIC用作偶联剂，将(Alloc)-Lys(Fmoc)-OH结合到树脂上的游离氨基上。在除去树脂上的Fmoc基团之后，将(Fmoc)₂Lys-OH偶联到树脂上。经由于DCM中的(P(Ph)3)4Pd的处理来除去Alloc保护基团，并且将HOBt/DIC用作偶联剂，将另一(Alloc)-Lys(Fmoc)-OH结合到树脂的游离氨基上。然后，在除去Fmoc基团后，经由HOBt/DIC结合，将PEG-COOH(2000Da)结合至树脂上的三个氨基。然后，经由于DCM中的(P(Ph)3)4Pd的处理来除去Alloc保护基团。然后，将FmocNH-EG-OH连接物结合到树脂上，然后将Fmoc2Lys-OH用作构建单元，由此在小珠上合成支化聚赖氨酸。最后，用胆酸OSu酯封盖第三代树枝状聚赖氨酸的游离氨基。然后，用TFA/TIS/水(95:2.5:2.5)混合物溶液处理树脂以将蝴蝶结形聚合物裂解进入溶液。通过鼓风来除去裂解溶液，然后将聚合物由冰冷冻的乙醚沉淀，并用冷冻乙醚洗涤三次。
实施例3.蝴蝶结形聚合物的表征
不受任何特定理论的限制，假设在胶束外层中的PEG的较厚层可以使胶束的药物负载性能稳定。其还可以提供足够的空间位阻以避免 胶束的疏水性核暴露于细胞膜，因此降低溶血性质。如图4所示，经由固相合成，已合成分别具有树枝状低聚胆烷以及2-臂或3-臂的支化PEG(2KDa)的成蝴蝶结形的聚合物1和2。聚合物2在药物/聚合物比例为1:4时呈现相当好的紫杉醇(PTX)负载容量以及稳定性。观察到由聚合物1和聚合物2形成的胶束的粒径在24.6nm和19.6nm处分别与药物负载之前的单分散尺寸分布相似(图3)。在以药物比聚合物为1:4的质量比来负载PTX之后，通过DLS测量，来自聚合物2的胶束保持稳定的为28.6nm的小粒径。然而，在相同条件下，从由聚合物1形成的胶束溶液观察到显著的PTX沉淀。聚合物2还证明更好的DOX负载性质。通过DLS分析，观察到DOX-PEG^2K₃CA₈(药物/聚合物m/m3:20)的粒径为15.5nm，大部分为窄分散小尺寸。然而，对于DOX-PEG^2K₂CA₈(3:20)，在相同条件下，观察到显著的沉淀，并且经由DLS分析，在463nm和1901nm处观察到多个峰。如图5所示，成蝴蝶结形的聚合物在20小时孵育之后、甚至在1mg/mL的最高浓度下具有非常低的溶血性质。
实施例4.末端树枝状聚合物的构建单元的合成
胆酸，即末端树枝状聚合物中重要的构建单元，已知作为小分子表面活性剂具有强膜活性。其已广泛用于通过磷脂双层膜的物质传递。不受任何特定理论的限制，确信胆酸分子的亲水性表面之间经由氢键的相互作用通过堆叠(stacking)来保护胆酸的极性表面。然后，暴露该疏水性表面，用于将胆酸络合物插入磷脂双层的疏水性内部。因此，低聚胆酸的亲水性表面之间的填充物(packing)的破坏可以降低这些类型的分子的膜活性。我们已经通过醚键形成而在胆酸的3α-OH和5α-OH基团上引入甘油和氨基甘油基团以增加空间位阻并同时保持面部两亲性。在图6中概述以下所述的这些衍生物的合成。
胆酸叔丁酯(3α,7α,12α-三羟基-5β-胆烷-24-酸叔丁酯)(1)
在0℃以下，将三氟乙酸酐(100 mL,45.07 mmol)滴入胆酸(25.0g,61.24mmol)干燥THF(400mL)的搅拌溶液中。在移除冰浴之后，将溶 液在室温下搅拌1.5小时。然后，再次冷却溶液，并在0℃以下添加干燥t-BuOH(150mL)。在室温下搅拌该溶液7小时之后，在5℃以下将第一部分的NH₃水溶液(120ml,28％,w/w)滴入该溶液，并将该溶液在0～5℃搅拌12小时。将另一部分的NH₃水溶液(60mL)加入该溶液中。在室温下另外4小时之后，将混合物在Et₂O(800mL)与水(200mL)之间分层。在用NaOH水溶液(1M,800mL)和水(2×500mL)洗涤之后，用无水MgSO₄干燥有机层。在蒸发之后获得泡沫，并通过用乙腈(80mL)结晶来获得胆酸叔丁酯1(27.5g,96.7％)的白色固体。MS(m/z)M+H⁺:计算464.4,实测465.5。
(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(环氧乙烷基(oxyranyl)甲氧基)-胆烷-24-酸叔丁酯(2)
在20℃以下，在剧烈搅拌下，向表氯醇(65mL)、NaOH水溶液(50％,w/w,120mL)和(n-Bu)₄NOH·30H2O(8.0g,1mmol)的混合物添加1(25g,53.84mmol)于CH₂Cl₂(15mL)中的溶液中。将混合物在室温下另搅拌16小时。通过TLC法(在正己烷/乙酸乙酯(1:1,v/v)体系中R_f＝0.4和0.6)来验证两种产物。在向混合物添加水(200mL)之后，分离有机层并通过无水MgSO₄过夜干燥。在蒸发溶剂之后，获得粉黄色油状物，并通过快速层析(正己烷/EtOAc,4:1,2:1和1:1,v/v)纯化。将所有R_f>0.4的组分收集在一起以用于3的分离。获得白色泡沫形式的化合物2(在正己烷/乙酸乙酯1:1,v/v中R_f＝0.4),12.5g,产率44.7％。HRMS(m/z)M+H⁺:计算521.3837,实测521.3839。¹HNMR(600MHz,CDCl₃):δ＝3.97(1H,s),3.83(1H,s),3.69(1H,m),3.46(1H,m),3.18(1H,s),3.12(1H,s),2.78(1H,t,J＝4.8Hz),2.60(1H,m),1.43(9H,s),1.15～2.23(23H,m),0.97(3H,d,J＝6.6Hz),0.88(3H,s),0.68(1H,s)。
(3α,5β,7α,12α)-12-二羟基-3,7-二(环氧乙烷基甲氧基)-胆烷-24-酸叔丁酯或(3α,5β,7α,12α)-7-二羟基-3,12-二(环氧乙烷基甲氧基)-胆烷-24-酸叔丁酯(3)
通过快速层析(正己烷/EtOAc,4:1,2:1和1:1,v/v)分离上述R_f>0.4的组分，并获得黄色胶状物形式的化合物3，4.5g,产率14.5％。HRMS(m/z)M+NH₄⁺:计算594.4364,实测594.4375。¹HNMR(600MHz,CDCl3):δ＝3.93(1H,s),3.81(1H,s),3.38～3.52(4H,m),3.17(2H,m),3.12(2H,s),2.78(2H,m,J＝4.2Hz),2.59(2H,m),1.43(9H,s),1.15～2.23(23H,m),0.96(3H,d,J＝6.6Hz),0.88(3H,s),0.67(1H,ds)。
(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(4)
在0℃以下，在搅拌下，将CF₃COOH(25mL)滴入2(1.6g,3.07mmol)于CH₂Cl₂(25mL)中的溶液。将混合物在室温下另搅拌1.5小时。TLC(正己烷/EtOAc,1:1,v/v)确认反应完成。在通过鼓风除去溶剂之后，获得黄色胶状物。向烧瓶添加LiOH(0.7g,10当量)的水溶液(20mL)。残留物逐渐消失，并且获得粉黄色溶液。在室温下搅拌16小时之后，将溶液冷却至5℃以下，并向该溶液滴加浓HCl。化合物4以白色固体形式沉淀，并且TLC测试确认产物是纯的并可在不进一步纯化的情况下用于接下来的步骤。在冻干后，获得4(1.25g)，产率84.4％。HRMS(m/z)M+H⁺:计算483.3317,实测483.3315。¹HNMR(600MHz,DMSO-d6):δ＝5.58(1H,ds),4.14(1H,s),4.03(2H,m),3.79(1H,s),3.74(1H,s),3.61(1H,s),3.50(1H,m),3.20(1H,m),3.02(1H,m),2.76(1H,s),2.67(1H,m),2.59(2H,m),1.15～2.24(23H,m),0.96(3H,d,J＝6.6Hz),0.82(3H,s),0.60(3H,s)。
(3α,5β,7α,12α)-12-二羟基-3,7-二(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸或(3α,5β,7α,12α)-7-二羟基-3,12-二(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(5)
在0℃以下，在搅拌下，将CF₃COOH(30mL)滴入化合物3(3.5g,6.01mmol)于CH₂Cl₂(30mL)中的溶液。将混合物在室温下另搅拌2.5小时。在通过鼓风除去溶剂之后，获得黄色胶状物。向烧瓶添加LiOH(2.0g,20当量)的水溶液(25mL)。残留物逐渐消失，并且获得粉黄色溶液。在室温下搅拌16小时之后，将溶液冷却至5℃以下，并向该溶液 滴加浓HCl。用3×100mL乙酸乙酯萃取产物，并用无水Na₂SO₄干燥有机层。在通过快速层析(CH₂Cl₂:CH₃OH＝5:1,3:1,v/v)纯化之后，获得粉黄色胶状物形式的化合物5，1.22g,产率36.5％。HRMS(m/z)M+H⁺:计算557.3684,实测557.3682。¹HNMR(600MHz,DMSO-d6):δ＝4.56(1H,s),4.46(2H,s),3.77(1H,s),3.50(4H,m),3.27(2H,m),3.16(4H,m),3.00(2H,m),2.50(3H,m),2.46(1H,s),1.17～2.25(23H,m),0.87～0.92(3H,m),0.83(3H,s),0.58～0.62(3H,ds)。
(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(3-氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆烷-24-酸叔丁酯(6)
将化合物2(6.5g,12.49mmol)溶解在密封烧瓶中的含LiCl(0.4g,mmol，当量)的NH₃甲醇溶液(7M,150mL)中，并在室温下搅拌24小时。TLC测试(R_f＝0.3,CH₂Cl₂:MeOH:NH₃·H2O(25％)＝10:1:0.1,v/v/v)证明反应完成。在通过快速层析(CH₂Cl₂:MeOH:NH₃·H2O(25％)＝10:1:0.1,v/v/v)纯化之后，获得白色泡沫形式的化合物6，6.2g,产率92.4％。HRMS(m/z)M+H⁺:计算538.4102,实测538.4099。¹HNMR(600MHz,CDCl₃):δ＝3.95(1H,s),3.83(1H,s),3.76(1H,s),3.50(1H,m),3.43(1H,m),3.12(1H,m),2.83(1H,m),2.75(2H,m),2.64(3H,s),1.43(9H,s),1.12～2.29(23H,m),0.97(3H,d,J＝6.6Hz),0.88(3H,s),0.67(3H,s)。
(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(3-Fmoc氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆烷-24-酸叔丁酯(7)
将化合物6(3.0g,5.58mmol)、Fmoc-OSu(3.0g,8.90mmol)和DIEA(1.5g,11.61mmol)溶解在CH₂Cl₂(100mL)中，并在室温下搅拌16小时。TLC测试(乙酸乙酯/己烷＝5:2,v/v)证明没有起始物质剩余。在减压除去溶剂之后，通过快速层析(乙酸乙酯/己烷＝5:2,v/v,R_f＝0.3)纯化残留物。获得白色泡沫形式的化合物7，4.1g,产率96.8％。HRMS(m/z)M+H⁺:计算760.4783,实测760.4795。¹HNMR(600MHz,CDCl₃):δ＝7.30～7.76(8H,m),5.41(1H,m),4.39(2H,d,J＝7.2Hz), 4.20(1H,t,J＝7.2Hz),4.12(1H,m),3.96(1H,s),3.83(2H,s),3.51(1H,m),3.39(2H,m),3.20(1H,m),3.12(1H,m),1.43(9H,s),1.12～2.30(23H,m),0.96(3H,d,J＝6.6Hz),0.88(3H,s),0.68(3H,s)。
(3α,5β,7α,12α)-7,12-二羟基-3-(3-Fmoc氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆酸(8)
在0℃以下，在搅拌下，将CF₃COOH(100mL)滴入化合物8(11.0g,14.48mmol)于CH₂Cl₂(100mL)中的溶液。在室温下，将混合物另搅拌4.5小时。在鼓风除去溶剂之后，将残留物溶解在CH₂Cl₂(300mL)中，并用3×100mL水洗涤。在用无水Na₂SO₄干燥过夜之后，减压蒸发有机层。获得粉黄色胶状物，并通过快速层析(乙酸乙酯/CH₃OH＝20:1,v/v,R_f＝0.3)纯化。获得白色泡沫形式的化合物8，9.0g,产率88.40％。HRMS(m/z)M+H⁺:计算704.4157,实测704.4162。¹HNMR(600MHz,CDCl₃):δ＝7.28～7.75(8H,m),5.60(1H,s),4.38(2H,d,J＝7.2Hz),4.20(1H,t,J＝7.2Hz),4.11(2H,m),3.95(1H,s),3.85(1H,s),3.82(1H,s),3.61(1H,s),3.49(1H,m),3.39(2H,m),3.11(1H,s),3.10(1H,m),1.15～2.37(23H,m),1.08(1H,m)0.98(3H,d,J＝6.6Hz),0.87(3H,s),0.66(3H,s)。
胆酸衍生物的琥珀酰亚胺基酯(9,10,11)
将化合物4、5或8溶解在含SuOH(1.2当量)和DCC(1.2当量)的CH₂Cl₂中，并将混合物在室温下搅拌16小时。滤除白色沉淀物(DCU)，并将滤液在减压下浓缩，直至出现白色泡沫。在将泡沫溶解在乙酸乙酯中后，使溶液在4℃静置过夜，以用于沉淀DCU。在滤除DCU之后，再次浓缩滤液。将获得的产物在不进一步纯化的情况下直接用于偶联。
含作为构建单元的胆酸衍生物的末端树枝状聚合物的制备
通过使用作为构建单元的这些衍生化的胆酸替代胆酸，我们已进 一步合成末端树枝状聚合物(图7)。其中，末端树枝状聚合物PEG^5kCA-4OH₈表现出与原始末端树枝状聚合物PEG^5kCA₈相似的PTX负载容量和稳定性。其在PTX负载(1:4聚合物/药物,w/w)之前和之后分别具有17nm和34nm的单分散粒径(图8B)。在37℃与红血球一起孵育4小时或20小时之后，与PEG^5kCA₈相比，观察到经改造的PEG^5kCA-4OH₈胶束的溶血性质可以忽略不计(图8C-D)。在负载PTX之后，在20小时孵育之后，观察到PEG^5kCA-4OH₈胶束在多达1mg/mL下为无溶血的，而在相同条件下，在PTX负载之前和之后，原始末端树枝状聚合物PEG^5kCA₈分别导致100％和50％的溶血。
实施例5.杂化末端树枝状聚合物的合成
给定一聚合物胶束系统，药物分子与聚合物骨架之间的亲合性决定了胶束的药物负载容量和稳定性。例如，PTX在诸如PEG^5kCA₈和PEG^2kCA₄的末端树枝状聚合物胶束中表现出优异的负载容量和稳定性。我们假设将作为构建单元的其他药物类分子(DLM)引入末端树枝状聚合物中将会经由多种相互作用向胶束给予对多种药物载物的强亲合性，所述多种相互作用例如疏水性相互作用、π-π相互作用、氢键和可能的离子相互作用。我们已经通过正交Boc-Fmoc保护策略将大黄酸(Rh)和胆酸结合至杂化末端树枝状聚合物中。大黄酸(Rh)是大黄(大黄(Dahuang))(即源自大黄(Rheum palmatum)和相关物种的根茎的中药)的主要生物活性组分。报道其具有抗肿瘤和消炎性能。其是生物相容性天然化合物，其用DOX加工类似的蒽环霉素结构。
材料
盐酸多柔比星(DOX·HCl)(Novaplus)和(Ben Venue Laboratories,Inc.,Bedford,OH)得自UC Davis Cancer Center Pharmacy。单甲基封端的聚(乙二醇)单胺(MeO-PEG-NH₂,Mw＝5kDa)购自Rapp Polymere(Tuebingen,德国)。(Fmoc)Lys(Boc)-OH、(Fmoc)Lys(Dde)-OH、(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH得自AnaSpec Inc.(San Jose,CA)。四唑鎓化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯 基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓,MTS]和吩嗪硫酸甲酯(PMS)购自Promega(Madison,Wisconsin)。大黄酸、胆酸、三乙胺(TEA)和所有其他化学品购自Sigma-Aldrich(St.Louis)。
经改造的末端树枝状聚合物(PEG^10kCONH-DOX₄,PEG^10k-N＝C-DOX₄,PEG^5k-Rh₈)和杂化末端树枝状聚合物(PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε:PEG^5k-CF₄^αCA₄^ε；PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε,PEG^5k-Rh₄^αCA4^ε)的合成
将MeO-PEG-NH₂、赖氨酸和胆酸用作构建单元，经由溶液相缩合反应合成末端树枝状聚合物。简言之，Fmoc肽化学用于将(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH偶联到PEG(MW＝5或10kDa)的N-端，将二异丙基碳二亚胺(DIC,3当量)和N-羟基苯并三唑(HOBt,3当量)用作偶联剂在DMF中过夜。在反应的负Kaiser检验时，向反应溶液添加冷冻的乙醚以沉淀聚合物，其用冷冻的乙醚进一步洗涤两次。通过用于DMF中的20％哌啶处理30分钟来除去Fmoc保护基团。将聚合物沉淀并用冷冻的乙醚洗涤。
PEG^5k-Rh₈合成：经由重复三次如上所述的(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH向MeO-PEG-NH₂的偶联，从而合成第三代树枝状聚赖氨酸。最后，经由HOBt/DIC偶联化学用大黄酸封盖(capped)聚赖氨酸。
PEG^10kCONH-DOX₄合成：用过量的琥珀酸酐(对于NH₂为5当量)来处理第二代树枝状聚赖氨酸以产生羧酸基团。此外，在DIEA的存在下，经由DIC/HOBt缩合反应，将多柔比星偶联到第二代树突上的COOH基团上。
PEG^10kN＝C-DOX₄合成：将DIC用作偶联剂，如上制备的第二代羧酸官能化树枝状聚合物与HOSu反应。用过量的于DMF中的肼进一步处理活性NHS酯。最后，在作为催化剂的TFA的存在下，聚酰基肼与多柔比星反应。产生酸不稳定的酰基腙连接以用于DOX结合。将末端树枝状聚合物用冷乙醚沉淀并洗涤三次，在截留分子量(MWCO)为3.5kDa的透析管中用水进行透析24小时，然后冻干。
杂化末端树枝状聚合物合成：经由两次重复(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH 偶联至MeO-PEG-NH₂的循环，合成第二代树枝状聚赖氨酸。经由DIC/HOBt化学，将(Fmoc)Lys(Boc)-OH偶联到第二代树枝状聚赖氨酸上。通过用于DMF中的20％哌啶的处理来除去Fmoc基团，然后将大黄酸(Rh)、胆固醇氯甲酸酯(CF)或胆酸(CA)偶联到赖氨酸的α位。然后，通过于DCM中的50％TFA处理30分钟来除去Boc保护基团。然后，CA、Rh或CF分别与赖氨酸的ε位反应，以生成杂化末端树枝状聚合物。将末端树枝状聚合物用冷乙醚沉淀并洗涤三次，在截留分子量(MWCO)为3.5kDa的透析管中用水进行透析24小时，然后冻干。使用MALDI-TOF质谱分析来表征末端树枝状聚合物的分子量。
负载DOX的含大黄酸的末端树枝状聚合物胶束的制备和表征
经由脱水(dry-down)(蒸发)法制备负载DOX的PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε胶束。在将DOX封装于聚合物胶束中之前，DOX·HCl与3摩尔当量的于氯仿(CHCl₃)/甲醇(MeOH)(1:1,v/v)中的三乙胺一起搅拌过夜，以从DOX·HCl除去HCl。首先将20mg PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε末端树枝状聚合物和不同量的经中和的DOX溶解在CHCl₃/MeOH中，混合，并在旋转蒸发仪上蒸发，从而获得均质干燥的聚合物膜。将膜在1mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)中重构，然后超声处理30分钟，使样品膜分散入胶束溶液。
通过动态光散射(DLS,Microtrac)来表征DOX-PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε胶束的粒径分布。通过使用DLS监测胶束的粒径，评价负载DOX的胶束在储存时的稳定性。在氘化氯仿和水中经由质子NMR来表征PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε和DOX-PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε胶束。
细胞培养物和动物
T-细胞淋巴瘤细胞系(Jurkat和MOLT-4)和B-细胞淋巴瘤细胞系(Raji和Ramos)购自American Type Culture Collection(ATCC)；Manassas,VA,USA)。使用湿润的5％CO₂孵育器，在37℃将所有这些细胞在ATCC配制的RPMI-1640培养基中培养，所述培养基补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素G和100μg/mL链霉素。
8-10周龄的雌性SPF BALB/c小鼠购自Charles River(Hollister,CA)；6-8周龄的雌性无胸腺裸小鼠(Nu/Nu品系)购自Harlan(Livermore,CA)。所有动物根据AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)指导方针而保持在无病原体条件下，并且在任何实验前允许适应环境至少4天。所有动物实验依照制度指导方针并根据由加利福利亚大学戴维斯分校(University of California,Davis)的动物使用及饲养管理咨询委员会(Animal Use and Care Administrative Advisory Committee)批准的第07-13119号和第09-15584号方案来进行。通过在雌性裸小鼠的右侧腹皮下注射于100μL PBS和基质胶(Matrigel)(1:1 v/v)混合物中的1×10⁷个Raji淋巴瘤细胞，从而建立淋巴瘤异种移植小鼠模型。
体外细胞毒性试验
MTS试验用于评价负载DOX的胶束NP对T和B淋巴瘤细胞系的细胞活性的作用。将MOLT-4、Jurkat、Raji和Ramos细胞以4×10³个细胞/孔的细胞密度接种在96-孔板中。在过夜孵育之后，用不同浓度的DOX·HCl、和负载DOX的胶束以及等剂量的空白胶束处理细胞。在72小时孵育之后，将由MTS和电子偶联剂PMS组成的水性细胞增殖试剂(Aqueous Cell Proliferation Reagent)根据制造商的说明来添加到每一孔。使用微板读数器(SpectraMax M2,Molecular Devices,USA)，通过测量490 nm处的吸光度来测定细胞活性。未处理的细胞用作对照。以一式三份的孔的平均细胞活性[(OD_处理-OD_空白)/(OD_对照-OD_空白)×100％]的形式来计算和讨论结果。
最大耐受剂量(MTD)研究
分别以5、10、15和20mg DOX/kg体重的剂量，向健康雌性SPF BALB/c小鼠静脉内给予DOX·HCl或DOX-PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε(于20mg/ml末端树枝状聚合物中的3mg/ml DOX)(n＝4)。每天监测小鼠存活和体重变化，持续两周。在注射后一周，从每一小鼠采集血液以测量血细胞计数以及包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移 酶(AST)、总胆红素(TB)、血尿素氮(BUN)和肌氨酸的血清化学。MTD定义为15％的中值体重减轻的限额(allowance)，并且既不导致由于毒性作用而产生的死亡也不导致在给药后2周内一般体征的显著变化。
体内抗肿瘤效能研究
皮下Raji淋巴瘤异种移植小鼠模型用于评价DOX的不同制剂的治疗效能。当肿瘤体积达到150-300mm³时，以10mg/kg DOX等同物(不含DOX的MTD)的剂量，向小鼠静脉内给予PBS、DOX·HCl、或DOX-PEG^5k-CA₄^αRh₄^ε(n＝5-8)。在第0天、第4天和第8天，每四天给予治疗，总计三副剂量。每周两次用数显卡尺测量肿瘤尺寸。通过式(L×W²)/2来计算肿瘤体积，其中L为最长的肿瘤直径(mm)，并且W为最短的肿瘤直径(mm)。为在组之间进行比较，在每一测量时间点计算相对肿瘤体积(RTV)(其中RTV等于在给定时间点的肿瘤体积除以在初始治疗之前的肿瘤体积)。出于人道原因，当植入的肿瘤体积达到2000mm³时处死动物，其被认为是存活数据的端点。在最后给药之后第7天，从所有小鼠获得血液样品以用于测量血细胞计数、肝功能测试或肾功能测试(ALT、AST和BUN)、以及包括肌氨酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)在内的心脏毒性的血清酶标记物。将来自每一组的一只小鼠处死，并提交其心脏以用于组织病理学评价。
统计分析
所有统计学分析的显著水平设定为P<0.05的概率。数据以平均值±标准误差(SEM)形式提供。对于两组的比较，通过Student的t-检验来进行统计学分析，并且对于多组，进行单因素方差分析(ANOVA)，然后如果总P<0.05，则进行Newman-Keuls检验。
结果和讨论
单独使用不同的成核的构建单元(例如DOX、大黄酸和胆固醇)或使用其与胆酸的组合，经由溶液相肽化学已合成经改造的末端树枝状聚合物和杂化末端树枝状聚合物(图9)。具有不同化学性质的含DOX 的末端树枝状聚合物在水溶液中组装成胶束之后具有不同的尺寸，这归因于DOX残基的疏水性的差异。与在DOX结合期间失去极性NH₂基团的PEG^10kCONH-DOX₄(19.5nm)相比，末端树枝状聚合物PEG^10k-N＝C-DOX₄具有更小的胶束尺寸(3.5nm)。然而，在PEG^10k-N＝C-DOX₄胶束中封装额外DOX之后，胶束的尺寸增加至42nm，具有窄且单分散的尺寸分布。PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε在水中自组装之后具有窄分散的粒径(30-50nm)。已证明将SN-38有效地封装至1.5mg/mL(药物/末端树枝状聚合物m/m1.5:20)，单分散粒径约120nm。
通过具有与理论值相同的分子量的MALDI-TOF MS来测定PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε的明确定义的结构(图10左侧)。PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε可以以100％负载效率负载多达4mg/mL的DOX(20％w/w)。在DOX负载之前和之后的粒径由DLS测量为6nm和18nm，具有窄分散尺寸分布(图10中部)。如图10右侧所示，PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε和负载DOX的胶束在D₂O中的质子NMR光谱示出核结构(胆烷和大黄酸)以及DOX药物分子的信号被完全抑制，表明稳定的固体样胶束核形成。经由DLS监测负载DOX胶束的粒径，在4℃和室温下于数月(>2个月)内是稳定的，没有任何沉淀。观察到，对于三种淋巴瘤细胞系，多达数百μg/mL的空的PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束是无毒的(图11)。负载DOX的PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束在细胞培养物的一些淋巴瘤细胞系(例如Jurkat和Raji细胞系)中表现出与游离的DOX和Doxil相近的IC50值。有趣地观察到与其他DOX制剂相比，针对Molt-4细胞的IC50增加(图11)。其可以表明含大黄酸的末端树枝状聚合物与DOX的协同作用。经改造的末端树枝状聚合物的溶血性质在体外血红细胞培养物中被评价为不可观察的，达到1mg/mL浓度20小时孵育；而PEG^2kCA₄和DOX-PEG^2kCA₄在37℃于4小时孵育之后表现出100％溶血(图12-左侧)。DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε纳米疗法的MTD在单次注射的小鼠中已测定为高于20mg/Kg(图13-右侧)。用25mg/kg的DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε治疗的小鼠仅观察到具有17％的体重减轻，这略高于MTD的定义(15％体重减轻)。小鼠在治疗后一周内重新增加体重。因此，DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε的MTD应非常接近于25mg/kg，这是DOX和 Doxil的MTD的2.5倍。
已观察到纳米疗法能经由EPR作用有效地靶向Raji细胞异种移植肿瘤。此外，Raji细胞对于不同DOX制剂具有相近的IC50值。因此，合理地使用Raji淋巴瘤异种移植模型以比较DOX纳米制剂与DOX临床制剂的体内抗癌效能。分别在第0天、第4天和第8天，每四天向携带Raji淋巴瘤的小鼠静脉内给予10mg/kg的等同DOX剂量(游离DOX的MTD)的游离的DOX、和DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束以及PBS对照(n＝5-8)。比较不同组中小鼠的肿瘤生长抑制和存活率，并且结果示于图14-顶部。与对照组相比，所有DOX治疗组中的小鼠表现出显著的肿瘤生长抑制(P<0.05)。然而，与游离DOX治疗组的小鼠的肿瘤生长率相比，用脂质体和胶束DOX制剂治疗的小鼠的肿瘤生长率显著更低(P<0.05)。这可以归因于经由脂质体和胶束NP的EPR作用而到达肿瘤位点的更高量的DOX。更重要地，DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束与相比呈现甚至更好的肿瘤生长抑制(P<0.05)。例如，到第28天，用游离DOX治疗的小鼠的中值RTV为9.9，而用和DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束治疗的小鼠的RTV分别为7.6和2.8。与相比，DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束的优异肿瘤抑制可以部分地解释为当经由有效的EPR作用达到肿瘤位点时由于其显著更小的粒径(18nm对140nm)而产生的在整个肿瘤组织的更深的渗透能力。与DOX-PEG^5k-CA₈和DOX-PEG^2k-CA₄胶束相比，DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束表现出体内癌症治疗的显著增强，这可以归因于其的优异稳定性。出于人道原因，当植入的肿瘤体积达到2000mm³时使动物安乐死，其被认为是存活数据的端点。每一组的小鼠存活率分别表示为Kaplan-Meier存活曲线(图14-中部)。通常，与PBS对照相比，所有DOX制剂显著延长携带肿瘤的小鼠的存活率。然而，在所有DOX制剂之中，用DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束治疗的小鼠获得最长的存活时间。PBS对照组、游离DOX组、组和DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束组中的小鼠的中值存活时间分别为20天、32天、36.5天和41天。
通过体重变化、血细胞计数以及包括肝功能和肾功能评判(hepatic  and renal function panels)以及心肌酶的血清化学来监测所有经治疗的小鼠的可能毒性。图14-底部表示随时间不同治疗组中小鼠的体重变化，作为不同制剂的整体全身毒性的指示。与PBS对照组相比，给予所有DOX制剂的小鼠以不同程度呈现最初的体重减轻，然后在治疗结束之后一周恢复体重。然而，游离DOX组中小鼠的体重减轻显著高于其他DOX纳米制剂组(P<0.05)，导致在第16天死亡一只。在最后注射之后第7天，采集血液样品以用于血细胞计数和血清化学分析。与PBS对照组相比，游离DOX组的WBC计数显著降低(P<0.05)，而所有DOX纳米制剂组的WBC计数在正常范围内(图16)。对于所有组，包括ALT、AST和BUN的肝功能和肾功能测试也在正常范围内(图15)。重要地，发现DOX在DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束NP中的封装与游离药物相比降低了心脏毒性。血清CK和LDH水平在多种心脏疾病模型中是细胞损伤的两种明确表征的标志物。与未治疗的小鼠相比，在用游离DOX治疗的小鼠中CK和LDH酶的诱导血清水平显著增加(P<0.05)(图17)。然而，与游离DOX相比，当将DOX负载在DOX-PEG^5k-CA₄^αCF₄^ε胶束中或Doxil中时，血清CK和LDH水平显著更低(P<0.05)。DOX胶束制剂的降低的心脏毒性可以归因于心脏的降低的摄取，如先前在体内生物分布研究中所证明的。尽管在完成治疗之后一周于心脏组织学检查中没有显著的发现，但可能是短期随访时间不足以辨别主要的组织学变化。
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