一种糖化血红蛋白的核酸适配子及其应用和检测糖化血红蛋白的试剂盒技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，具体的说是涉及一种糖化血红蛋白的核酸适配子
及其应用和检测糖化血红蛋白的试剂盒。
背景技术
糖化血红蛋白是一种糖蛋白，其于1958年首次从其他类型的血红蛋白中分离出
来，是由血糖和血红蛋白通过不可逆的反应结合而成，且与血糖浓度成正比，能保持120天
左右，可以反映血糖8-12周内的情况。血液中糖化血红蛋白的含量与抽血时间，是否空腹，
是否使用胰岛素等因素干扰不大。国际糖尿病联盟推出了新版的亚太糖尿病防治指南，明
确规定糖化血红蛋白是国际公认的糖尿病监控“金标准”。
现阶段我国的糖尿病患者已经高达9800万人，且发病率仍然呈现出不断上升的趋
势，是严重威胁我国人民健康的公共卫生问题，长期存在高血糖，是导致眼、肾、心脏、血管
和神经的慢性损害及功能障碍的原因。传统的糖尿病诊断和监测大多是进行空腹血糖、餐
后血糖以及糖耐量实验，而随着人们对糖化血红蛋白认识的不断深入，其在糖尿病诊断监
测中的地位不断提高。
核酸适配子(适配子/适体，aptamer)是通过指数富集的配基系统进化技术
(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其靶物质(氨基酸、蛋白质、金属离子、
甚至整个细胞)进行高亲和力、专一性结合，其在生化分析、环境监测、基础医学、新药的合
成及筛选等方面已经展现出了广阔的应用前景。
中国专利CN102965378A公开了一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法，其具
体公开了4种核酸适配子序列，并记载了此4种核酸适配子结合糖化蛋白的能力是结合非糖
化血红蛋白能力的20-80倍，具备较高的特异性和灵敏度。但是该现有技术中，其未记载和
公开其适配体的具体性能参数，如与糖化血红蛋白的亲和力、检测限、结合常数等，只能在
其实施例5的几张结果图上粗略推测分析其结合常数可能大于50nM以上，即与糖化血红蛋
白亲和力较差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种糖化血红蛋白的核酸适配子，使得所述核
酸适配子与糖化血红蛋白的亲和更高，同时具有更高的特异性和灵敏度。
本发明的另一个目的在于提供所述核酸适配子在制备检测糖化血红蛋白产品中
的应用，特别是检测试剂盒中，并同时提供一种检测糖化血红蛋白的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种糖化血红蛋白的核酸适配子，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示核苷酸序
列；或为在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2任意一个所示核苷酸序列基础上发生取代碱基、缺失
碱基和添加碱基三种情形中的一种或两种以上情形的核苷酸序列。
针对现有糖化血红蛋白核酸适配子灵敏度和亲和力都不高的缺陷，本发明设计出
两个对糖化血红蛋白具有高亲和力、特异性和灵敏度的核酸适配子，解决了现有技术问题。
其中，所述取代碱基、缺失碱基和添加碱基分别优选为取代一个或多个碱基，缺失
一个或多个碱基，以及添加一个或多个碱基，所述三种情形以不影响核酸适配子正常功能
前提下进行。
采用本发明所述核酸适配子进行亲和力的检测，其与糖化血红蛋白的结合常数Kd
分别为为11.91nM和10.24nM，这说明这两条序列与目标蛋白糖化血红蛋白有较高的亲和
力，均已经达到nM级别；同时，所述核酸适配子与糖化血红蛋白结合较好，吸光度成梯度，与
阴性对照形成显著区别，同时与现有专利中的适配子相比，与糖化血红蛋白的亲和更高，两
者相差1-2个数量级；并且所述核酸适配子与血红蛋白的结合较少，其可以将糖化血红蛋白
和血红蛋白明显的区分出来。
此外，所述核酸适配子检测血液样本不同糖化血红蛋白含量，其信号梯度较为明
显，可以用于实际样本的糖化血红蛋白含量检测研究中。
基于以上各种有益的技术效果，本发明提供了所述核酸适配子在制备检测糖化血
红蛋白的产品中的应用。其中，所述产品形式包括但不限于试纸条、试剂盒等，所述试剂盒
优选为ELISA试剂盒，而ELISA试剂盒又可基于不同原理分为直接ELISA试剂盒、间接ELISA
试剂盒、夹心ELISA试剂盒、竞争抑制ELISA试剂盒，以及由这四类试剂盒衍生的其他ELISA
试剂盒。
在本发明的具体实施方式中提供了一种检测糖化血红蛋白的ELISA试剂盒，包括
本发明所述核酸适配子。本发明以举例但非限制的方式提供所述ELISA试剂盒的组分可选
择如下之一：
(1)包括标记有生物素的所述核酸适配子、包被有糖化血红蛋白的酶标板、标记有
辣根过氧化物酶的亲和素以及TMB显色底物；其中，标记有生物素的所述核酸适配子的浓度
优选为100nM；
(2)包括标记有生物素的所述核酸适配子、包被有亲和素的酶标板、糖化血红蛋白
的单克隆抗体、标记有辣根过氧化物酶的二抗以及TMB显色底物；具体地包括：标记有生物
素的本发明所述核酸适配子，浓度为100nM；包被有亲和素的酶标板，亲和素浓度为1μg/mL；
糖化血红蛋白的单克隆抗体，浓度为1μg/mL；标记有辣根过氧化物酶的二抗以及TMB显色底
物。
上述两种ELISA试剂盒基于直接ELISA和夹心ELISA原理设置，在掌握本发明核心
的核酸适配子后，可以轻易的根据其他ELISA原理设置其他形式的ELISA试剂盒。
由以上技术方案可知，本发明提供了两个新型的糖化血红蛋白核酸适配子，其和
糖化血红蛋白的结合常数能够达到nM级，并且与血红蛋白的结合较少，具备较高的特异性
和灵敏度，在检测实际样本时信号梯度较为明显，与阴性对照形成显著区别，可以用于糖化
血红蛋白含量检测研究中。
附图说明
图1所示为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸适配子表面等离子体共振测试拟
合的曲线，横坐标为核酸适配子浓度值，单位nM；
图2所示为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的核酸适配子表面等离子体共振测试拟
合的曲线，横坐标为核酸适配子浓度值，单位nM。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种糖化血红蛋白的核酸适配子及其应用和检测糖化血红
蛋白的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出
的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在
本发明内。本发明所述核酸适配子及其应用和相关试剂盒已通过较佳实施例进行了描述，
相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和应用进行改动或
适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种糖化血红蛋白的核酸适配子及其应用和检测糖化血
红蛋白的试剂盒做进一步说明。
实施例1：表面等离子体共振法检测糖化血红蛋白核酸适配子与糖化血红蛋白的
结合常数
将20μg/ml的糖化血红蛋白孵育组装到金膜上，用BSA封闭并清洗未组装上的蛋白
后读取数据，再将溶于结合缓冲液的SEQ ID NO：1和2所示核苷酸序列核酸适配子加入到金
膜上，待其反应完成后，洗脱未结合的序列，待数值稳定后读取波长红移数据。按照此方法
分别读取糖化血红蛋白核酸适配子浓度为6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM的数值，再根
据此数值拟合SEQ ID NO：1和2所示核苷酸序列核酸适配子与糖化血红蛋白的结合常数Kd
值(采用sigmaplot软件计算)。波长红移数据见表1、2，拟合曲线见图1、2。结合常数Kd值的
计算方法如下：
其中Bmax表示最大结合量。
表1 SEQ ID NO：1所示核苷酸序列核酸适配子与糖化血红蛋白结合的波长红
移值
经过拟合，结果显示SEQ ID NO：1所示核苷酸序列核酸适配子与糖化血红蛋白的
结合常数Kd为11.91nM。
表2 SEQ ID NO：2所示核苷酸序列核酸适配子与糖化血红蛋白结合的波长红移值
糖化血红蛋白核酸适配子浓度(nM)
波长红移值(nm)
6.25
1.12
12.5
2.19
25
3.16
50
3.29
100
3.27
经过拟合，结果显示SEQ ID NO：2所示核苷酸序列核酸适配子与糖化血红蛋白的
结合常数Kd为10.24nM。
从上述试验结果可以看出，SEQ ID NO：1和2所示核苷酸序列的糖化血红蛋白核酸
适配子与糖化血红蛋白的结合常数Kd分别为11.91nM和10.24nM，这说明这两条序列与目标
蛋白糖化血红蛋白有较高的亲和力，均已经达到nM级别。
实施例2：抗体夹心法检测糖化血红蛋白核酸适配子与糖化血红蛋白的结合情况
取SEQ ID NO：1和2所示核苷酸序列的糖化血红蛋白核酸适配子，采用抗体夹心法
考察序列与糖化血红蛋白的结合情况，以CN102965378A中的4条适配体作为性能对照，具体
试验操作如下：
取SEQ ID NO：1和2所示核苷酸序列的糖化血红蛋白核酸适配子，经在3′端标记生
物素、连接10个T碱基，得到生物素化的糖化血红蛋白核酸适配子。在酶标板上包被一层亲
和素(包被亲和素浓度1μg/mL，每孔100μl)，封闭后将生物素化的糖化血红蛋白核酸适配子
(100nM，每孔100μl)与包被的亲和素孵育，洗涤后将不同浓度梯度(1μg/mL、1×10-1μg/mL、1
×10-2μg/mL、1×10-3μg/mL、1×10-4μg/mL、1×10-5μg/mL、1×10-6μg/mL、0μg/mL)的糖化血
红蛋白100μl加入进行反应，洗涤后加入糖化血红蛋白的单克隆抗体(1μg/mL，每孔100μl)，
洗涤后再加入标记了辣根过氧化物酶的二抗，最后TMB系统显色，检测吸光度，结果如表3所
示。
表3核酸适配子与糖化血红蛋白的结合情况
结果显示核酸适配子与糖化血红蛋白结合较好，吸光度成梯度，CN102965378A中
的4条适配体与糖化血红蛋白也有结合，但其结合能力与SEQ ID NO：1和2的适配体相比相
差了1-2个数量级，也从一方面证实了SEQ ID NO：1和2结合常数更优，而阴性对照的吸光度
较低，说明其与糖化血红蛋白的结合很少。
实施例3：抗体夹心法检测糖化血红蛋白核酸适配子与血红蛋白的结合情况
取SEQ ID NO：1和2所示核苷酸序列的糖化血红蛋白核酸适配子，采用抗体夹心法
考察序列与血红蛋白的结合情况，具体试验操作如下：
取SEQ ID NO：1和2所示核苷酸序列的糖化血红蛋白核酸适配子，经在3′端标记生
物素、连接10个T碱基，得到生物素化的糖化血红蛋白核酸适配子。在酶标板上包被一层亲
和素(包被亲和素浓度1μg/mL，每孔100μl)，封闭后将生物素化的糖化血红蛋白核酸适配子
(100nM，每孔100μl)与包被的亲和素孵育，洗涤后将不同浓度梯度(1μg/mL、1×10-1μg/mL、1
×10-2μg/mL、1×10-3μg/mL、1×10-4μg/mL、1×10-5μg/mL、1×10-6μg/mL、0μg/mL)的糖化血
红蛋白100μl加入进行反应，洗涤后加入糖化血红蛋白的单克隆抗体(1μg/mL，每孔100μl)，
洗涤后再加入标记了辣根过氧化物酶的二抗，最后TMB系统显色，检测吸光度，结果如表4所
示。
表4核酸适配子与血红蛋白的结合情况
结果显示核酸适配子与血红蛋白的结合较少，其可以将糖化血红蛋白和血红蛋白
明显的区分出来。
实施例4：糖化血红蛋白核酸适配子检测血液样本的情况
取SEQ ID NO：1和2所示核苷酸序列的糖化血红蛋白核酸适配子，采用抗体夹心法
检测血液样本，具体试验操作如下：
取SEQ ID NO：1和2所示核苷酸序列的糖化血红蛋白核酸适配子，经在3′端标记生
物素、连接10个T碱基，得到生物素化的糖化血红蛋白核酸适配子。在酶标板上包被一层亲
和素(包被亲和素浓度1μg/mL，每孔100μl)，封闭后将生物素化的糖化血红蛋白核酸适配子
(100nM，每孔100μl)与包被的亲和素孵育，然后洗涤。跟踪并保留一糖尿病志愿者在不同血
糖控制时期测得的不同糖化血红蛋白含量的血液样本，然后将不同糖化血红蛋白含量的
(9.3％、8.1％、6.4％和0％用于对照的无溶血血清)的血液样本稀释十倍后加入进行反应，
洗涤后加入糖化血红蛋白的单克隆抗体，洗涤后再加入标记了辣根过氧化物酶的二抗，最
后TMB系统显色，检测吸光度，结果如表5所示。
表5核酸适配子检测血液样本的情况
结果显示，核酸适配子检测不同糖化血红蛋白含量，其信号梯度较为明显，可以用
于实际样本的糖化血红蛋白含量检测研究中。
实施例5：直接ELISA检测试剂盒
3′端标记生物素并连接10个T碱基的SEQ ID NO：1或2所示序列的核酸适配子，浓
度为100nM；包被有糖化血红蛋白的酶标板；标记有辣根过氧化物酶的亲和素以及TMB显色
底物；
实施例6：抗体夹心ELISA检测试剂盒
3′端标记生物素并连接10个T碱基的SEQ ID NO：1或2所示序列的核酸适配子浓度
为100nM；包被有亲和素的酶标板，亲和素浓度为1μg/mL；糖化血红蛋白的单克隆抗体，浓度
为1μg/mL；标记有辣根过氧化物酶的二抗以及TMB显色底物。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，
这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 三诺生物传感股份有限公司
<120> 一种糖化血红蛋白的核酸适配子及其应用和检测糖化血红蛋白的试剂盒
<130> MP1621649
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
agttcgatcc ctagggggat tactagctct ttagcctgca 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ctagctgctc attctgcgta tgtaaggggg atctgaacgt 40