一种从水华蓝藻中制备脱镁叶绿酸A甲酯的方法.pdf

本发明涉及一种制备脱镁叶绿酸A甲酯的方法，其特征在于使用水华蓝藻作为原料，所述方法包括以下四个步骤：(i)将水华蓝藻进行组织破坏，(ii)用有机溶剂提取，(iii)将上述步骤中得到的有机溶剂提取物甲酯化，得到粗品，以及(iv)纯化。本发明通过简便的方法从淡水的水华蓝藻即可制备获得脱镁叶绿酸A甲酯，不但可以解决蓝藻水华的治理中资源利用的问题，而且为癌症患者带来了福音。

1.  一种制备脱镁叶绿酸A甲酯的方法，其特征在于使用水华蓝藻作为原料，所述方法包括以下四个步骤：(i)将水华蓝藻进行组织破坏，(ii)用有机溶剂提取，(iii)将上述步骤中得到的有机溶剂提取物甲酯化，得到粗品，以及(iv)纯化。

2.  根据权利要求1的方法，其中所述水华蓝藻为太湖蓝藻。

3.  根据权利要求1或2的方法，其中所述组织破坏步骤为机械破碎法或冷冻破碎法，其中所述机械破碎方法例如用对蓝藻进行剪短磨碎；冷冻破碎法是在蓝藻中加入低温液体，搅拌破坏细胞和组织。

4.  根据权利要求3的方法，其中所述低温液体选自能够达到-50℃至-120℃的低温液体，优选液氮、液氮与有机溶剂形成的低温溶剂或干冰与有机溶剂形成的低温溶剂，其中所述有机溶剂选自C3-C6酮、C1-C4低级烷基醇和C4-C6醚，优选丙酮、甲醇、乙醇和乙醚，更优选丙酮。

5.  根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述有机溶剂提取步骤是在经组织破碎后的样品中加入有机溶剂，通过浸泡或回流方式进行一次或多次提取，其中提取时采用的有机溶剂选自C3-C6酮、C4-C6醚、C1-C4低级烷基醇、C1-C2卤代烷烃、以及上述溶剂与水或C5-C8烷烃的混合溶剂，其中优选丙酮、乙醇、乙醚、二氯甲烷、75％-95％的上述有机溶剂与水的混合溶液，含有5％-25％石油醚或正己烷的上述有机溶剂的混合溶剂，更优选丙酮。

6.  根据权利要求1-5任一项的方法，其中所述甲酯化步骤是将用有机溶剂提取得到的提取液浓缩至干后，加入甲醇，在酸存在下反应，反应完毕后，用有机溶剂和水或碱水萃取，分离有机相，干燥，浓缩得到脱镁叶绿酸A甲酯粗品。

7.  根据权利要求6的方法，其中所述酸选自无机强酸，如：浓硫酸、氯化氢等；或有机酸，如甲磺酸、对甲苯磺酸等，优选硫酸；所述萃取时采用的有机溶剂选自C1-C2卤代烷烃、C4-C6醚、C3-C6酯，优选二氯甲烷、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯，更优选二氯甲烷；所述碱水优选碳酸氢钠水溶液，稀氢氧化钠水溶液。

8.  根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述纯化步骤是将在甲酯化反应之后浓缩得到的粗品用有机溶剂溶解，加入石油醚或C5-C8烷烃产生沉淀，用石油醚或C5-C8烷烃洗涤至接近无色，干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯。

9.  根据权利要求8的方法，其中所述溶解粗品采用的有机溶剂选自C6-C8芳香烃和C1-C2卤代烃，优选二氯甲烷、甲苯和苯，更优选二氯甲烷；所述C5-C8烷烃优选正己烷。

10.  根据权利要求1的方法，包括以下步骤：
步骤1，将太湖蓝藻置于1-8倍重量的丙酮中，搅拌下加入液氮，直至冷冻固化；
步骤2，在得到的固体浆状溶液中加入1-8倍重量的丙酮，回流或浸泡提取1次或多次，合并提取后的丙酮溶液；
步骤3，将得到的丙酮溶液浓缩至干，加入含有2-10％的硫酸的甲醇溶液，反应至完全，倾入水中，用二氯甲烷萃取，将有机相浓缩、干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯粗品；
步骤4，将得到的粗品用二氯甲烷溶解，加入石油醚或正己烷至沉淀完全，过滤，将得到的固体用石油醚或正己烷洗涤至基本无色，干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯纯品。

一种从水华蓝藻中制备脱镁叶绿酸A甲酯的方法
技术领域
本发明涉及一种从水华蓝藻制备脱镁叶绿酸A甲酯的方法，属医药、环保技术领域。
背景技术
经济的突飞猛进伴随着生态环境的急剧恶化使得人们的生存经受着强烈的考验。而当今一个很严重的污染体现是淡水中的“绿潮”和海水中的“赤潮”，绿潮即所谓的蓝藻水华。近年来“水华”频繁出现，面积逐年扩散，持续时间逐年延长。太湖、滇池、巢湖、洪泽湖都有“水华”，就连流动的河流，如长江最大支流----汉江下游汉口江段中也出现“水华”。淡水中“水华”造成的最大危害是：饮用水源受到威胁，藻毒素通过食物链影响人类的健康，蓝藻“水华”的次生代谢产物能损害肝脏，具有促癌效应，直接威胁人类的健康和生存。此外，自来水厂的过滤装置被藻类“水华”填塞，漂浮在水面上的“水华”影响景观，并有难闻的臭味。
蓝藻水华尤其是大型湖泊中的蓝藻水华的治理是世界性的难题。世界许多国家对蓝藻水华的治理尝试了许多方法，采用机械除藻，化学除藻，滤食性生物控藻和水生植被恢复等措施，短时间内取得了控制蓝藻水华的成效，然而，过一两年又会大量繁殖出现。蓝藻治理需要长期的大量投入，在一定程度上加重了社会负担。近年来，水华蓝藻被研究加工成农肥用于农业生产，也被研究用于提取一些廉价化工原料，如：γ-亚麻酸等。然而，蓝藻中含量最丰富的成分是叶绿素A，若能加以利用将创造更大价值。
脱镁叶绿酸A是一种光敏剂，可以用于通过光动力学疗法治疗肿瘤，但存在较大的光毒性。HPPH(2-[1-hexyloxyethyl]-2-devinylpyropheophorbide-a，即(2-[1-己氧基乙基]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸A)是脱镁叶绿酸A的类似物，是美国ROSWELLPARK CANCERINSTITUTE研制的第二代光敏剂，研究表明，其具有治疗肿瘤效果好、光毒性小的特点。HPPH是用脱镁叶绿酸A的甲酯化合物为原料制备的，其起始原料来源于一种海洋藻类植物Spirulinadestridratada，植物资源较少，导致HPPH生产成本很高。

2-[1-已氧基乙基]-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸A
本发明的发明人第一次发现了可以从淡水的水华蓝藻制备脱镁叶绿酸A甲酯。本发明通过简便的方法从淡水的水华蓝藻即可制备获得脱镁叶绿酸A甲酯，不但可以解决蓝藻水华的治理中资源利用的问题，而且能够降低新型光敏剂HPPH的生产成本，为癌症患者带来福音。
发明内容：
本发明提供了一种从淡水的水华蓝藻制备脱镁叶绿酸A甲酯的方法，原料来源广泛，方法简便，易操作，得到的脱镁叶绿酸A甲酯纯度高，适合工业大生产需求，同时解决了水华蓝藻资源利用问题。
本发明提供了一种制备脱镁叶绿酸A甲酯的方法，其特征在于使用水华蓝藻作为原料，所述方法包括以下四个步骤：(i)将水华蓝藻进行组织破坏，(ii)用有机溶剂提取，(iii)将上述步骤中得到的有机溶剂提取物甲酯化，得到粗品，以及(iv)纯化。
脱镁叶绿酸A甲酯结构式如下：

脱镁叶绿酸-a甲酯
(Methyl pheophorbide-a)
在本发明优选的实施方案中，其中所述水华蓝藻为太湖蓝藻。
在本发明优选的实施方案中，其中所述组织破坏步骤为机械破碎法或冷冻破碎法，其中所述机械破碎法例如用对蓝藻进行剪短磨碎；冷冻破碎法是在蓝藻中加入低温液体，搅拌破坏细胞和组织，其中低温液体选自能够达到-50℃至-120℃的低温液体，优选液氮、液氮与有机溶剂形成的低温溶剂或干冰与有机溶剂形成的低温溶剂，其中所述有机溶剂选自C3-C6酮、C1-C4低级烷基醇和C4-C6醚，优选丙酮、甲醇、乙醇和乙醚，更优选丙酮。
在本发明优选的实施方案中，其中所述有机溶剂提取步骤是在经组织破碎后的样品中加入有机溶剂，通过浸泡或回流方式进行一次或多次提取，其中提取时采用的有机溶剂选自C3-C6酮、C4-C6醚、C1-C4低级烷基醇、C1-C2卤代烷烃、以及上述溶剂与水或C5-C8烷烃的混合溶剂，其中优选丙酮、乙醇、乙醚、二氯甲烷、75％-95％的上述有机溶剂与水的混合溶液，含有5％-25％石油醚或正己烷的上述有机溶剂的混合溶剂，更优选丙酮。要说明的一点是浸泡提取每次提取时间应该长一些，以便保证收率，一般24-48小时为宜。回流提取每次提取时间经优化根据不同溶剂一般选择在1-6小时即可。提取时间和次数仅对收率有影响，但不影响最终得到的目标化合物，不妨碍本发明的方法的实施。
在本发明优选的实施方案中，其中所述甲酯化步骤是将用有机溶剂提取得到的提取液浓缩至干后，加入甲醇，在酸存在下反应，反应完毕后，用有机溶剂和水或碱水萃取，分离有机相，干燥，浓缩得到脱镁叶绿酸A甲酯粗品；其中所述酸选自无机强酸，如：浓硫酸、氯化氢等；或有机酸，如甲磺酸、对甲苯磺酸等，优选硫酸；所述萃取时采用的有机溶剂选自C1-C2卤代烷烃、C4-C6醚、C3-C6酯，优选二氯甲烷、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯，更优选二氯甲烷；所述碱水优选碳酸氢钠水溶液，稀氢氧化钠水溶液。
在本发明优选的实施方案中，其中所述纯化步骤是将在甲酯化反应之后浓缩得到的粗品用有机溶剂溶解，加入石油醚或C5-C8烷烃产生沉淀，用石油醚或C5-C8烷烃洗涤至接近无色，干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯；其中所述溶解粗品采用的有机溶剂选自C6-C8芳香烃和C1-C2卤代烃，优选二氯甲烷、甲苯和苯，更优选二氯甲烷；所述C5-C8烷烃优选正己烷。本步骤目的是除去残余的低极性杂质，如：类胡罗卜素化合物等，这些化合物在溶液中颜色很深，若吸附在沉淀中可以通过石油醚或C5-C8烷烃洗去。
另外，还要说明的一点是，在上述步骤中制备的脱镁叶绿酸A甲酯纯度已经很高(优选大于80％，更优选大于90％)，可以用于制备HPPH的原料。若要得到更高纯度的脱镁叶绿酸A甲酯，还可以进一步采用在二氯甲烷/甲醇或二氯甲烷/乙醇体系中重结晶的方法获取。
基于以上说明，在本发明一个更为优选的实施方案中，所述制备脱镁叶绿酸A甲酯的方法包括以下步骤：
步骤1，将太湖蓝藻置于1-8倍重量的丙酮中，搅拌下加入液氮，直至冷冻固化；
步骤2，在得到的固体浆状溶液中加入1-8倍重量的丙酮，回流或浸泡提取1次或多次，合并提取后的丙酮溶液；
步骤3，将得到的丙酮溶液浓缩至干，加入含有2-10％的硫酸的甲醇溶液，反应至完全，倾入水中，用二氯甲烷萃取，将有机相浓缩、干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯粗品；
步骤4，将得到的粗品用二氯甲烷溶解，加入石油醚或正己烷至沉淀完全，过滤，将得到的固体用石油醚或正己烷洗涤至基本无色，干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯纯品。
本发明所述方法，操作简便，制备成本低廉，得到的脱镁叶绿酸A甲酯纯度高，适合工业大生产需求，同时解决了水华蓝藻环境污染和资源利用的问题。
具体实施方案
下面通过实施例对本发明进一步说明：
实施例1.
取太湖蓝藻500克置于1升丙酮中，缓慢加入液氮，搅拌直至完全冷冻固化，加入2升丙酮，回流2小时，过滤，滤渣中再加入2升丙酮，回流2小时，过滤，用500毫升热丙酮洗涤，合并所有提取后的丙酮溶液，减压浓缩至完全除去溶剂，氮气保护下，加入500毫升含5％硫酸的甲醇溶液，室温搅拌12小时，倾入至1升水中，用1升二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩至干。重新用100毫升二氯甲烷溶解，加入正己烷至沉淀完全，过滤，得到的固体用正己烷洗涤至基本无色，干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯2.0克。
根据上述方法得到的脱镁叶绿酸A甲酯，通过光谱学验证证实了其结构，数据如下：
m.p.222-224℃
UVλmax(Et₂O)667nm(5.91×10⁴)，611nm(7.71×10³)，533nm(9.73×10³)，504nm(1.21×10⁴)，407nm(1.21×10⁵)；
¹HNMR(400MHz，CDCl₃，δ ppm)：9.50(s，1H，β-meso-H)，9.38(s，IH，α-meso-H)，8.56(s，1H，δ-meso-H)，8.01(m，1H，2a-H)，6.24(s，2H，10-CH₂)，6.28-6.16(m，2H，2b & 2b’-H)，4.46(q，1H，8-H)，4.18(d，1H，7-H)，3.84(s，3H，10-CO₂CH₃)，3.64(q，2H，4a-CH₂)，3.62，3.57，3.40，3.23(4s，12H，7-CH₂CH₂CO₂CH₃，5-CH₃，1-CH₃，3-CH₃)，2.64-2.25(m，4H，7-CH₂CH₂)，1.84(d，3H，8-CH₃)，1.60(t，3H，4b-CH₃)，1.45(br.s，2H，2NH)
实施例2.
取太湖蓝藻500克置于1升丙酮中，加入干冰，搅拌直至完全冷冻固化，加入4升丙酮，浸泡24小时，过滤，滤渣中再加入4升丙酮，浸泡24小时，过滤，用500毫升热丙酮洗涤，合并所有提取后的溶液，减压浓缩至完全除去溶剂，氮气保护下，加入500毫升含20％氯化氢的甲醇溶液(通过向甲醇中通入氯化氢气体制备)，加热回流，搅拌1小时，倾入至1升水中，用1升乙酸乙酯萃取，有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩至干。重新用100毫升二氯甲烷溶解，加入石油醚(60-90)至沉淀完全，过滤，得到的固体用石油醚(60-90)洗涤至基本无色，干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯0.7克。
根据上述方法得到的脱镁叶绿酸A甲酯，m.p.221-224℃，紫外光谱和核磁共振光谱数值与实施例1中产物的数值类似。
实施例3.
取太湖蓝藻500克置于1升乙醚中，缓慢加入液氮，搅拌直至完全冷冻固化，加入2升乙醚，回流2小时，过滤，滤渣中再加入2升乙醚，回流2小时，过滤，用500毫升热丙酮洗涤，合并所有提取后的溶液，减压浓缩至完全除去溶剂，氮气保护下，加入500毫升含10％硫酸的甲醇溶液，室温搅拌12小时，倾入至1升水中，用2升叔丁基甲基醚萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩至干。重新用100毫升二氯甲烷溶解，加入正己烷至沉淀完全，过滤，得到的固体用正己烷洗涤至基本无色，干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯1.0克。
根据上述方法得到的脱镁叶绿酸A甲酯，m.p.222-225℃，紫外光谱和核磁共振光谱数值与实施例1中产物的数值类似。
实施例4.
取太湖蓝藻500克置于1升丙酮溶液中，加入干冰，搅拌直至完全冷冻固化，加入2升90％丙酮(水)溶液，回流2小时，过滤，滤渣中再加入2升90％丙酮(水)溶液，回流2小时，过滤，用500毫升热丙酮洗涤，合并所有提取后的溶液，减压浓缩至完全除去溶剂，氮气保护下，加入500毫升含10％氯化氢甲醇溶液，室温搅拌12小时，倾入至1升水中，用1升乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩至干。重新用100毫升甲苯溶解，加入石油醚(30-60)至沉淀完全，过滤，得到的固体用石油醚(30-60)洗涤至基本无色，干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯1.6克。
根据上述方法得到的脱镁叶绿酸A甲酯，m.p.223-225℃，紫外光谱和核磁共振光谱数值与实施例1中产物的数值类似。
实施例5.
取太湖蓝藻500克置于1升乙醚中，缓慢加入液氮，搅拌直至完全冷冻固化，加入2升含15％正己烷的乙醇溶液，浸泡24小时，过滤，滤渣中再加入2升含15％正己烷的乙醇溶液，浸泡24小时，过滤，用500毫升15％正己烷的乙醇溶液洗涤，合并所有提取后的溶液，减压浓缩至完全除去溶剂，氮气保护下，加入500毫升含3％硫酸的甲醇溶液，室温搅拌12小时，倾入至1升水中，用1升乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩至干。重新用200毫升甲苯溶解，加入正庚烷至沉淀完全，过滤，得到固体用正己烷洗涤至基本无色，干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯1.2克。
根据上述方法得到的脱镁叶绿酸A甲酯，m.p.221-223℃，紫外光谱和核磁共振光谱数值与实施例1中产物的数值类似。
实施例6.
取太湖蓝藻500克经研磨破碎，置于2升丙酮，回流2小时，过滤，滤渣中再加入2升丙酮，回流2小时，过滤，用500毫升热丙酮洗涤，合并所有提取后的丙酮溶液，减压浓缩至完全除去溶剂，氮气保护下，加入500毫升甲醇和2.5克对甲苯磺酸溶液，加热回流2小时，倾入至1升饱和碳酸氢钠水溶液中，用1升二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩至干。重新用100毫升二氯甲烷溶解，加入正戊烷至沉淀完全，过滤，得到的固体用正戊烷洗涤至基本无色，干燥，得到脱镁叶绿酸A甲酯0.9克。
根据上述方法得到的脱镁叶绿酸A甲酯，m.p.221-223℃，紫外光谱和核磁共振光谱数值与实施例1中产物的数值类似。