含酰胺或砜类取代基的海藻溴代酚类化合物及制备和应用.pdf

本发明涉及食品与化妆品添加剂领域，具体地说是含有酰胺或砜类取代基团的海藻溴代酚类化合物及其制备方法和应用。结构式A或B所示，结构式A、B，其中R1为H、OH、OCH3或Br，R2为H、OH、OCH3或Br，R3为CH3或C2H5。所化合物从海洋红藻松节藻中经提取、分离获得的具有清除自由基活性的溴酚类化合物，本发明所得溴酚类化合物具有显著的清除DPPH自由基活性，可作为食品与化妆品添加剂延缓或防止食用油脂、含油食品及油脂类化妆品因自由基诱导引起的氧化变质。

1.  一种含有酰胺或砜类取代基团的溴代酚类化合物，其特征在于：结构式A或B所示

其中：R₁为H、OH、OCH₃或Br，R₂为H、OH、OCH₃或Br，R₃为CH₃或C₂H₅。

2.  一种权利要求1所述的含有酰胺或砜类取代基团的溴代酚类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)松节藻经冲洗、阴干、粉碎到60-80目后，用有机溶液提取2-5次，合并提取液进行浓缩，得到粗提物；
2)将步骤1)中的粗提物内加入过量的水，并依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2-4次，萃取物各自浓缩得到相应的提取物，备用；
3)取步骤2)中的乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测、合并，得层析的各组分；
所述有机溶剂为100:0-0:100梯度的石油醚-乙酸乙酯；
4)将步骤3)中以石油醚-乙酸乙酯5:1到3:1梯度洗脱下的组分进行硅胶和葡聚糖凝胶柱层析，收集洗脱液浓缩后得目标化合物A；
或将步骤3)中以3:1到2:1梯度洗脱下的组分进行硅胶和葡聚糖凝胶柱层析，收集洗脱液浓缩后得目标化合物B。

3.  按权利要求2所述的含有酰胺或砜类取代基团的溴代酚类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤4)硅胶柱层析时用4:1的石油醚-丙酮或2:1的石油醚-乙酸乙酯进行等度洗脱，所得洗脱液再经葡聚糖凝胶柱层析，经甲醇等度洗脱，收集的洗脱液根据Rf值来判断、收集Rf为0.45-0.5的组分，即为纯化后的目标化合物A；所述步骤4)硅胶柱层析时用2:1的石油醚-丙酮或1:1的石油醚-乙酸乙酯进行等度洗脱，所得洗脱液再经葡聚糖凝胶柱层析，经甲醇等度洗脱，收集的洗脱液根据Rf值来判断、收集Rf为0.45-0.5的组分，即为纯化后的目标化合物B。

4.  权利要求2所述的含有酰胺或砜类取代基团的溴代酚类化合物的制备方法，其特征在于：步骤1)中的有机溶液提取液可为浓度在50-100％的乙醇或甲醇。

5.  权利要求2所述的含有酰胺或砜类取代基团的溴代酚类化合物的制备方法，其特征在于：步骤4)中硅胶层析所用的洗脱液可为洗脱剂为石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；葡聚糖凝胶柱层析所用的洗脱液可为甲醇或氯仿-甲醇。

6.  一种权利要求1所述的含有酰胺或砜类取代基团的溴代酚类化合物的应用，其特征在于：所述化合物A或B可作为食品与化妆品添加剂延缓或防止食用油脂、含油食品及油脂类化妆品因自由基诱导引起的氧化变质。

含酰胺或砜类取代基的海藻溴代酚类化合物及制备和应用
技术领域
本发明涉及食品与化妆品添加剂领域，具体地说是含有酰胺或砜类取代基团的海藻溴代酚类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
自由基诱导引起的氧化反应能导致含有食品与化妆品酸败变质。不仅如此，氧化反应还能导致食品退色、褐变等，从而严重影响食品的质量，降低食品的营养价值。另一方面，自由基引发的许多氧化产物和中间产物是公认的致癌物，会严重损害有机体的生物膜、蛋白质、酶及细胞功能，直接或间接引起许多疾病如癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、神经退行性疾病以及机体老化等的发生。
目前常用的防止食用油脂和含油食品氧化变质的主要途径之一是加入抗氧化剂，以防止或者延缓包括自由基氧化在内所引起的氧化反应的发生。其中BHT(叔丁基羟基甲苯)、BHA(叔丁基羟基茴香醚)是较常用的化学合成抗氧化剂、自由基清除剂。但是随着生活水平的提高，人类对合成抗氧化剂、自由基清除剂的安全问题越来越关注，特别是研究发现BHT、BHA存在一定的毒性(如能引起肝脏扩大并有可能致癌)，天然抗氧化剂、自由基清除剂的研究受到越来越广泛的重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然的含有酰胺或砜类取代基团的海藻溴代酚类化合物及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
含有酰胺或砜类取代基团的溴代酚类化合物：结构式A或B所示

其中：R₁为H、OH、OCH₃或Br，R₂为H、OH、OCH₃或Br，R₃为CH₃或C₂H₅制备方法包括如下步骤：
1)松节藻(Rhodomela confervoides)经冲洗、阴干、粉碎到60-80目后，用有机溶液提取2-5次，合并提取液进行浓缩，得到粗提物；
2)将步骤1)中的粗提物内加入过量的水，并依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2-4次，萃取物各自浓缩得到相应的提取物，备用；
3)取步骤2)中的乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测、合并，得层析的各组分；
所述有机溶剂为100:0-0:100(体积比)梯度的石油醚-乙酸乙酯；
4)将步骤3)中以石油醚-乙酸乙酯5:1到3:1(体积比)梯度洗脱下的组分进行硅胶和葡聚糖凝胶柱层析，收集洗脱液浓缩后得目标化合物A；
或将步骤3)中以3:1到2:1(体积比)梯度洗脱下的组分进行硅胶和葡聚糖凝胶柱层析，收集洗脱液浓缩后得目标化合物B。
所述步骤4)硅胶柱层析时用4:1的石油醚-丙酮或2:1的石油醚-乙酸乙酯进行等度洗脱，所得洗脱液再经葡聚糖凝胶柱层析，经甲醇等度洗脱，收集的洗脱液根据Rf值来判断、收集Rf为0.45-0.5(石油醚-乙酸乙酯＝3:1为展开剂)的组分，即为纯化后的目标化合物A；所述步骤4)硅胶柱层析时用2:1的石油醚-丙酮或1:1的石油醚-乙酸乙酯进行等度洗脱，所得洗脱液再经葡聚糖凝胶柱层析，经甲醇等度洗脱，收集的洗脱液根据Rf值来判断、收集Rf为0.45-0.5(石油醚-乙酸乙酯＝2:1为展开剂)的组分，即为纯化后的目标化合物B。
步骤1)中的有机溶液提取液可为浓度在50-100％(体积比)的乙醇或甲醇。
步骤4)中硅胶层析所用的洗脱液可为洗脱剂为石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；葡聚糖凝胶柱层析所用的洗脱液可为甲醇或氯仿-甲醇。
化合物的应用：所述化合物A或B可作为食品与化妆品添加剂延缓或防止食用油脂、含油食品及油脂类化妆品因自由基诱导引起的氧化变质。
本发明具有以下优点：
本发明涉及的化合物为新的含有酰胺或砜类取代基团的溴代酚类化合物，属于小分子天然有机化合物，容易制备获得；本发明涉及的溴酚类化合物具有显著的DPPH自由(α，α-dipheny1-β-picrylhydrazyl，即，二苯代苦味酰自由基)活性，可作为食品添加剂延缓或防止食用油脂和含油食品与化妆品因自由基诱导引起的氧化变质。
本发明涉及的海洋红藻松节藻(Rhodomela confervoides)属于红藻门、松节藻科、松节藻属海藻，主要分布于中国、日本、韩国等沿海地区，一般生长在潮间带的岩石上。本发明通过海洋红藻松节藻经提取、分离获得的溴酚类天然化合物，经实验表明，这类化合物具有显著的DPPH自由基清除活性，在相同的浓度条件下其作用强度明显高于化学合成品BHT，可广泛应用于食用油脂或含油食品中，替代化学合成抗氧化剂、自由基清除剂，防止或延缓由自由基引起的氧化反应的发生，从而延长保质期，提高产品质量。
具体实施方式：
下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1
溴酚类化合物的制备方法：
新鲜采集的松节藻经海水清洗，除去表面附着的沙砾及杂藻，阴凉处凉干备用。取凉干后的样品33.5Kg，粉碎后用15升95％的乙醇在室温下提取三次，每次三天，合并乙醇提取液，在温度40℃左右减压浓缩、回收乙醇，获得乙醇粗提物。在粗提物中加入过量的蒸馏水使之混悬于水中，依次用适量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次，分别浓缩后获得相应的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物。将乙酸乙酯提取物(300克)进行硅胶柱(500克，200-300目)层析，用石油醚-乙酸乙酯以100:0、90:1、85:1，70:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1到0:100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测，合并相同或类似部分，薄层层析(TLC)检测时用三氯化铁作为显色剂，获得30个组分(1-30)。将组分20(4.5克)，即以石油醚-乙酸乙酯5:1梯度洗脱下的组分进行硅胶柱层析用4:1的石油醚-丙酮进行等度洗脱，所得洗脱液再经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析用100％浓度的甲醇洗脱，收集的洗脱液根据Rf值来判断、收集Rf为0.45-0.47(石油醚-乙酸乙酯＝3:1为展开剂)的组分，洗脱液经减压浓缩获得纯化合物A12.3毫克。
经波谱分析，其结构鉴定为4-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯甲胺基)-4-羰基丁酸甲酯，英文名为methyl4-(2，3-dibromo-4，5-dihydroxybenzylamino)-4-oxobutanoate，即通式A中R₁为Br、R₂为OH、R₃为CH₃的化合物。
将组分25(3.9克)，即以石油醚-乙酸乙酯3:1梯度洗脱下的组分进行硅胶柱层析时用2:1的石油醚-丙酮进行等度洗脱，所得洗脱液再经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析用100％浓度的甲醇洗脱，收集的洗脱液根据Rf值来判断、收集Rf为0.45-0.47(石油醚-乙酸乙酯＝2:1为展开剂)的组分，洗脱液经减压浓缩获得纯化合物B20.1毫克。
经波谱分析，化合物B的结构确定为3，4-二溴-5-(二甲基砜)苯基-1，2-二醇，英文名为3，4-dibromo-5-(methylsulfonylmethyl)benzene-1，2-diol，即式B中R₁为Br，R₂为OH，R₃为CH₃基时所代表的化合物。化合物A、B的结构式如下所示。

化合物A和B具有以下理化和波谱特性：
化合物A，黄色油体；紫外光谱λmax(MeOH)(log ε)218(4.40)，293(3.92)nm；红外光谱(KBr)ν max 3609，1759，1693，1520，1090，678cm^-1；核磁共振氢谱(¹H NMR，acetone-d₆，500MHz)δ 2.56(2H，m，H-2)，2.59(2H，m，H-3)，6.97(1H，s，H-6′)，4.36(2H，br.sH-7′)，3.61(s，OCH3)；核磁共振碳谱(¹³C NMR，acetone-d₆，125MHz)δ 173.6(s，C-1)，31.1(t，C-2)，29.7(t，C-3)，171.8(s，C-4)，132.1(s，C-1′)，115.3(s，C-2′)，113.8(s，C-3′)，144.3(s，C-4′)，145.6(s，C-5′)，116.0(d，C-6′)，45.0(t，C-7′)，51.7(q，OCH3)；低分辩ESI质谱m/z 436(15)，434(30)，432(15)[M+Na]⁺，139(16)，86(66)，72(90)；高分辨ESI质谱m/z 431.9027[M+Na]⁺(calcd for C₁₂H₁₃⁷⁹Br₂NO₅Na，431.9058)。化合物B，无色粉末；紫外光谱λmax(MeOH)(log ε)221(5.24)，296(3.59)nm；红外(KBr)ν max 3428，2939，2854，1627，1581，1478，1436，1360，1309，1236，1167，1069，1031，913，841，781，757，729，667，629cm^-1；核磁共振氢谱(¹H NMR，acetone-d₆，500MHz)δ 9.24(1H，br.s，OH-1)，8.69(1H，br.s，OH-2)，7.14(1H，s，H-6)，4.55(2H，s，H-7)，2.90(3H，s，H-8)；核磁共振碳谱(¹³C NMR，acetone-d₆，125MHz)δ 146.1(qC，C-1)，145.6(qC，C-2)，114.1(qC，C-3)，118.3(qC，C-4)，122.4(qC，C-5)，118.9(CH，C-6)，61.7(CH₂，C-7)，40.6(CH₃，C-8)；低分辩EI质谱m/z 362(3)，360(5)，358(2)[M]⁺；283(50)，281(97)，279(55)[M-CH₃SO₂]⁺；203(6)，201(8)，[M-CH₃SO₂-Br]⁺；173(6)，133(15)，131(17)；高分辨ESI质谱m/z 380.8410[M+Na]⁺(calcd for C₈H₈⁷⁹Br₂O₄SNa⁺，380.8407).
实施例2
新鲜采集的松节藻经海水清洗，除去表面附着的沙砾及杂藻，阴凉处凉干备用。取凉干后的样品，粉碎后用15升95％的乙醇在室温下提取三次，每次三天，合并乙醇提取液，在温度40℃左右减压浓缩、回收乙醇，获得乙醇粗提物。在粗提物中加入过量的蒸馏水使之混悬于水中，依次用适量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次，分别浓缩后获得相应的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物。将乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以100:0、90:1、85:1，70:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1到0:100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测，合并相同或类似部分，薄层层析(TLC)检测时用三氯化铁作为显色剂，以石油醚-乙酸乙酯3:1梯度洗脱下的组分进行硅胶柱层析用2:1的石油醚-乙酸乙酯进行等度洗脱，所得洗脱液再经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析用100％浓度的甲醇洗脱，收集的洗脱液根据Rf值来判断、收集Rf为0.47-0.49的组分，洗脱液经减压浓缩获得纯化合物A。经波谱分析，即通式A中R₁为OCH₃、R₂为H、R₃为C₂H₅的化合物。
将以石油醚-乙酸乙酯1:1梯度洗脱下的组分进行硅胶柱层析时用1:1的石油醚-乙酸乙酯进行等度洗脱，所得洗脱液再经葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析，葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析用100％浓度的甲醇洗脱，收集的洗脱液根据Rf值来判断、收集Rf为0.47-0.49(石油醚-乙酸乙酯＝2:1为展开剂)的组分，洗脱液经减压浓缩获得纯化合物B。经波谱分析，即式B中R₁为OH，R₂为OCH₃，R₃为C₂H₅基时所代表的化合物。
实施例3
新鲜采集的松节藻经海水清洗，除去表面附着的沙砾及杂藻，阴凉处凉干备用。取凉干后的样品，粉碎后用15升95％的乙醇在室温下提取三次，每次三天，合并乙醇提取液，在温度40℃左右减压浓缩、回收乙醇，获得乙醇粗提物。在粗提物中加入过量的蒸馏水使之混悬于水中，依次用适量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次，分别浓缩后获得相应的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物。将乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以100:0、90:1、85:1，70:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1到0:100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测，合并相同或类似部分，薄层层析(TLC)检测时用三氯化铁作为显色剂，以石油醚-乙酸乙酯4:1梯度洗脱下的组分进行硅胶柱层析用2:1的石油醚-乙酸乙酯进行等度洗脱，所得洗脱液再经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析用100％浓度的甲醇洗脱，收集的洗脱液根据Rf值来判断、收集Rf为0.49-0.5的组分，洗脱液经减压浓缩获得纯化合物A。经波谱分析，即通式A中R₁为H、R₂为OCH₃、R₃为CH₃的化合物。
将以石油醚-乙酸乙酯1:1梯度洗脱下的组分进行硅胶柱层析时用2:1的石油醚-丙酮进行等度洗脱，所得洗脱液再经葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析，葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析用100％浓度的甲醇洗脱，收集的洗脱液根据Rf值来判断、收集Rf为0.47-0.49(石油醚-乙酸乙酯＝2:1为展开剂)的组分，洗脱液经减压浓缩获得纯化合物B。经波谱分析，即式B中R₁为OCH₃，R₂为H，R₃为C₂H₅基时所代表的化合物。
实施例4
DPPH自由基清除活性实验：
DPPH是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517nm附近有强吸收，加入抗氧化剂后，一部分自由基被清除，使吸收减弱，可借此来评价其抗氧化活性、自由基清除活性的强弱。这种方法操作简便，重现性好。
实验方法：
在2mL实施例1中所得样品中加入2mL DPPH(甲醇溶液，0.16mmo l/L)混合均匀后，室温暗处放置50min后，于517nm处测定其吸光度A_sample。
在2mL实施例1中所得样品中加入2mL甲醇溶液于517nm处测定其吸光度A_{sample blank}。
2mLDPPH中加入2mL甲醇氯仿混合溶剂于517nm处测定其吸光度A_control。
2mL甲醇中加入2mL甲醇氯仿混合溶剂于517nm处测定其吸光度A_blank。
自由基清除率的计算：
清除率％＝100-(A_sample-A_{sample blank})×100/(A_control-A_blank)。
将实施例1得到的样品在2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL不同浓度下分别测试，每个浓度平行测定三次，取平均值即为样品清除率，并计算IC₅₀值。所有测试均以BHT为标准品作为阳性对照。
实验结果：
参见表1，数据表明上述获得的溴酚酰胺和溴酚砜类化合物具有显著的DPPH清除活性，在低浓度下溴酚类化合物的活性与BHT相当，在中浓度和高浓度时活性显著高于BHT。另外，实验表明，BHT的IC₅₀为82.1μM，而溴酚酰胺和溴酚砜类化合物的IC₅₀分别为5.7和9.5μM，仅分别为阳性对照BHT的十四分之一和九分子一，表明溴酚酰胺和溴酚砜类化合物的自由基清除活性显著高于阳性对照BHT。
表1

实施例5
溴酚类化合物在食用油脂抗氧化中的应用：
取食用油脂1千克，按照0.02％的重量比加入上述实施例1中得到的溴酚类化合物中，混合均匀，制得抗自由基氧化的食用油脂。与不含溴酚类化合物的食用油脂相比，含溴酚类化合物的食用油脂其保存期是前者的2倍以上。
本发明所涉及的溴酚类化合物可应用于任何食用油脂中，以防止或延缓自由基引起的氧化变质，延长保质期。