一种醋酸钙不动杆菌及其在降解十溴联苯醚中的应用 技术领域 ：
本 发 明 属 于 微 生 物 应 用 领 域， 具 体 涉 及 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobacter calcoaceticusDB-3) 及其在降解十溴联苯醚中的应用。 背景技术 ：
十溴联苯醚 (BDE2209 或 DeBDE) 是市场上需求量最大的一类多溴联苯醚， 作为一 种溴系阻燃剂 (brominated flame retardants， BFRs)， 广泛用作耐冲击性聚苯乙烯、 聚酯、 聚酰胺、 纺织品和电子产品的添加剂。 近年来， 十溴联苯醚的需求不断的增加， 据统计， 1999 年全世界对 BDE2209 的需求量占对多溴联苯醚总需求量的 81％， 2001 年为 83％。到 2001 5 年为止， 我国阻燃剂总产量约为 1.5×10 t， 而 BDE2209 的销售量已达 1.35×104t。全球自 然环境中十溴联苯醚含量呈显著增长态势。 溴代阻燃剂具有难溶于水， 长距离迁移能力， 难 以生物降解等理化特点。 多溴联苯醚同时具有明显的生物蓄积特性， 生理上表现出致癌性、 神经毒性、 内分泌干扰毒性、 免疫功能紊乱致使性等危害。十溴联苯醚排放到环境中后， 经 光解、 高温分解、 生物及微生物降解等过程， 会转化为多溴二苯并二噁英、 多溴二苯并呋喃 以及低溴代的联苯醚， 这些降解物更容易进入生物体， 也引起更强的毒性作用。 环境中存在 的十溴联苯醚已逐渐成为一种生态安全威胁。 因此， 必须发掘可以高效、 安全降解十溴联苯 醚的方法。
生物降解是利用自然界存在的微生物分解物质， 对环境不会造成负面影响。目前 报道的具有十溴联苯醚降解能力的菌株， 包括有 White rot fungi， Rhodococcus jostii RHA1 和 Burkholderia xenovorans LB400 等， 但是它们降解速率很低， 功能不强。因此， 发 掘可以高效、 安全降解十溴联苯醚的功能菌株具有重要的意义。
到目前为止， 没有报道不动杆菌属 (Acinetobacter) 的菌株具有降解十溴联苯醚 的能力。 发明内容 ：
本 发 明 的 目 的 是 提 供 一 种 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobacter calcoaceticus DB-3) 及 其 在 降 解 十 溴 联 苯 醚 中 的 应 用， 该 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobacter calcoaceticus DB-3) 能够高效、 安全降解十溴联苯醚， 不会产生多溴二苯并二噁英、 多溴 二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污染物。
本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 是从广东汕头贵屿河床底泥分离、 纯化得到的 ：
该菌的理化参数如下 ：
1、 菌体的形态特性 ：
a. 采 用 常 规 的 细 菌 生 理 生 化 鉴 定 方 法 和 电 子 显 微 镜 观 察， Acinetobacter calcoaceticusDB-3 菌株为革兰氏阴性， 球杆状， 菌体大小为 1 ～ 1.5μm×1.5 ～ 2.5μm 微 米， 无芽孢。b. 在 LB 固体培养基平板上培养 24h 后， 菌落形态为圆形， 光滑不透明， 菌落直径为 1.5-2.0 毫米。
2、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 主要的理化特性 ：
Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株的生长温度 20-40℃， pH 范围 6-9， 好氧 生长， 氧化酶阴性， 接触酶阳性。
3、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 主要的遗传特征 ：
对 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 的 16S rRNA 测 序， BLAST 比 对 发 现， 本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 的 16S rRNA 基因序列与 Acinetobacter calcoaceticus 已有模式菌株具有较高的相似性， 其中与 Acinetobacter johnsonii DSM 6963 的序列相似性为 84％。
综合上述的生理生化特性、 16S rRNA 基因序列结果， 本发明的 Acinetobacter calcoaceticusDB-3 应 归 属 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobacter calcoaceticus)， 命名为 Acinetobacter calcoaceticusDB-3。
本发明人通过实验证实本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 具有十溴 联苯醚脱溴能力， 对十溴联苯醚具有较强的降解能力。 本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株对十溴联苯醚具有较强的降 解能力， 能对十溴联苯醚脱溴， 而产生游离的溴离子。 因此十溴联苯醚经过该菌生物降解处 理后不会产生多溴二苯并二噁英、 多溴二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污 染物。所以可以将该菌株用于环境中治理十溴联苯醚污染， 从而为化工污泥或废水中十溴 联苯醚的处理提供一种低成本、 高效率不发生二次污染的十溴联苯醚降解菌。
本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 于 2009 年 11 月 27 日， 保藏于中 国典型培养物保藏中心 (CCTCC， 地址 ： 中国武汉市武汉大学 )， 其保藏编号为 CCTCC NO ： M 209287。
具体实施方式 ：
一、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株的分离和鉴定
1、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株的分离 ：
培养基 ：
基础盐培养基： 每 升 培 养 基 中 含 有 KH2PO42.93g， Na2HPO48.87g， NH4Cl1.0g， NaCl0.5g， MgSO45g， CaCl2·2H2O0.15g， 微量元素盐溶液 2mL， 余量为水。
微量元素盐溶液： 每 升 微 量 元 素 盐 溶 液 中 含 有 Na2MoO430mg， ZnCl250mg， CuCl2·2H2O10mg， H3BO331mg， MnCl2·5H2O 30mg， NiCl2·6H2O 20mg， CoCl2·6H2O 36mg， 余量 为水。
本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株是从广东汕头贵屿河床底泥 经过分离、 纯化而得。
其分离纯化方法如下 ：
取 1g 河床底泥放在 100ml 添加有十溴联苯醚 2.0mg/L， 乳酸钠 1.0g/L， 酵母抽提 物 0.1g/L 的基础盐培养基中富集培养。富集培养过程通过离子色谱监测培养液中溴离 子的浓度变化指示富集效果， 富集培养是先在 30℃， 避光静置培养 14 天， 监测出明显的溴离子释放， 然后转接到含有十溴联苯醚 2.0mg/L， 乳酸钠 2.0g/L， 酵母抽提物 0.05g/L 的 基础盐培养基里继续在 30℃， 避光静置培养 14 天。然后从上步富集培养的培养液里取混 合菌群液涂布到添加含有乳酸钠 2.0g/L 固体基础盐培养基 ( 含有 20g/L 琼脂 ) 于 30 ℃ 温箱中进行培养， 从中挑取优势单菌落进行脱溴降解筛选， 纯化， 最后获得 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株。2、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株特征 ：
(1) 菌体的形态特性 ：
a. 采 用 常 规 的 细 菌 生 理 生 化 鉴 定 方 法 和 电 子 显 微 镜 观 察， Acinetobacter calcoaceticusDB-3 菌株为革兰氏阴性， 球杆状， 菌体大小为 1 ～ 1.5μm×1.5 ～ 2.5μm 微 米， 无芽孢。
b. 在 LB 固体培养基平板上培养 24h 后， 菌落形态为圆形， 光滑不透明， 菌落直径为 1.5-2.0 毫米。
(2)Acinetobacter calcoaceticus DB-3 主要的理化特性 ：
Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株的生长温度 20-40℃， pH 范围 6-9， 好氧 生长， 氧化酶阴性， 接触酶阳性。
(3)Acinetobacter calcoaceticus DB-3 主要的遗传特征 ：
具体方法参考分子克隆实验指南 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001) 中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 分子分类地位 ：
采用 DNA 小量提取方法提取 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 细菌总 DNA， 采 用 16S rRNA 通用引物 27F 和 1522r 扩增其 16S rRNA 基因， 将 PCR 产物直接测序， 其序列如 SEQ ID NO.1 所示， 将获得的 16S rRNA 基因序列输入 GenBank， 通过 BLAST 程序对数据库 中的所有序列进行比较分析， 结果发现本发明 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 的 16S rRNA 基因序列与 Acinetobacter calcoaceticus 已有模式菌株具有较高的相似性， 其中与 Acinetobacter johnsoniiDSM 6963 的序列相似性为 84％。
综合上述的生理生化特性、 16S rRNA 基因序列结果， 本发明的 Acinetobacter calcoaceticusDB-3 应 归 属 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobacter calcoaceticus)， 命名为 Acinetobacter calcoaceticusDB-3。
本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 于 2009 年 11 月 27 日， 保藏于中 国典型培养物保藏中心 (CCTCC， 地址 ： 中国武汉市武汉大学 )， 其保藏编号为 CCTCC NO ： M 209287。
实施例一 ：
Acinetobacter calcoaceticus DB-3 对浓度为 10mg/L 的十溴联苯醚的脱溴降解 试验 ：
降解基础培养基配方 ： 每 升 培 养 基 中 含 有 蛋 白 胨 1g， 酵 母 抽 提 物 0.5g， KH2PO42.93g， Na2HPO48.87g， NH4Cl 1.0g， NaCl 0.5g， MgSO45g， CaCl2·2H2O 0.15g， 余量为水。
1、 配制含十溴联苯醚 10mg/L 的降解实验培养基 ：
在 100ml 三角瓶中添加 300mg/L 用二氯甲烷溶解的十溴联苯醚储存液 1ml， 避光待 二氯甲烷挥发， 然后在三角瓶中添加 30ml 降解基础培养基， 摇匀后得到 30ml 降解实验培养 基。即降解实验培养基的配方 ： 每升培养基中含有十溴联苯醚 10mg， 蛋白胨 1g， 酵母 抽 提 物 0.5g， KH2PO42.93g， Na2HPO48.87g， NH4Cl 1.0g， NaCl 0.5g， MgSO45g， CaCl2·2H2O 0.15g， 余量为水。
2、 将本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 纯菌划 LB 板培养， 然后从固 体 LB 平板上挑取单菌落接种到 30ml 降解实验培养基中， 30℃， 150 转 / 分避光培养， 培养 48h 后， 取培养液， 利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度， 实验做三个平行样品。
3、 溴离子测定标准曲线的绘制及测定 ：
用 18.2mΩ 的 mini-Q 无菌水分别配制 0.00、 100、 250、 500、 750、 1000μg/L 溴化 钠标准梯度溶液， 用戴安 ICS-1500 型离子色谱进行色谱分析， 分析柱 AS19， 分析样品量 50μL， 分析时间 30min， 具体数据如表 1 所示 ：
表1
溴化钠标准溶液浓度 测定溴离子浓度
0.00 0.000100 98.68250 252.45500 499.82750 747.761000 1001.291500 1498.65由此得出标准曲线方程 ： y ＝ 0.0027x-0.0027。R2 ＝ 1.0， x 为溴离子浓度 ( 单位 μg/L)， y 为溴离子积峰面积 (μS*min)。
4、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 对十溴联苯醚脱溴降解的测定 ：
从 三 个 平 行 样 品 中 分 别 取 2mL 经 过 48h 上 述 培 养 的 培 养 液， 用 0.22μm 的 无 菌滤膜过滤， 过滤液经过 C18 固相萃取小柱纯化， 收集纯化液， 取 0.5mL 稀释到 6mL 后 进行戴安离子色谱分析， 上样分析量为 500μL。按上述标准曲线方程计算， 可得 48h 后 Acinetobactercalcoaceticus DB-3 培养液中溴离子浓度分别为 300.0μg/L， 227.0μg/L， 257.4μg/L， 平均值为 261.5μg/L。
实施例二 ：
Acinetobacter calcoaceticus DB-3 对浓度为 10mg/L 的十溴联苯醚的脱溴降解 试验 ：
1、 配制含十溴联苯醚 10mg/L 的降解实验培养基 ：
本实施例的降解实验培养基与实施例一的降解实验培养基相同。
2、 将本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 纯菌划 LB 板培养， 然后从固 体 LB 平板挑取单菌落接种至 30ml 降解实验培养基中， 于 30℃， 150 转 / 分避光培养， 培养 60h 后， 取培养液， 利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度， 实验做三个平行样品。
3、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 降解率的测定 ：
从三个平行样品中分别取 2mL 经过 60h 上述培养的培养液， 用 0.22μm 的无菌滤 膜过滤， 过滤液经过 C18 固相萃取小柱纯化， 收集纯化液， 取 0.5mL 稀释到 6mL 后进行戴 安离子色谱分析， 上样分析量为 500μL。根据实施例一的标准曲线方程计算， 可得 60h 后 Acinetobactercalcoaceticus DB-3 培养液中溴离子浓度分别为 498.3μg/L， 420.0μg/L， 389.7μg/L， 平均值为 436.0μg/L。
实施例三 ：Acinetobacter calcoaceticus DB-3 对浓度为 10mg/L 的十溴联苯醚的脱溴降解试验 ： 1、 配制含十溴联苯醚 10mg/L 的降解实验培养基 ：
本实施例的降解实验培养基与实施例一的降解实验培养基相同。
2、 将本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 纯菌划 LB 板常规培养， 然后 从固体 LB 平板上挑取单菌接种至 30ml 降解实验培养基中， 30℃， 150 转 / 分避光培养 72h 后， 取培养液， 利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度， 实验做三个平行样品。
3、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 降解率的测定 ：
从 三 个 平 行 样 品 中 分 别 取 2mL 经 过 72h 上 述 培 养 的 培 养 液， 用 0.22μm 的 无 菌滤膜过滤， 过滤液经过 C18 固相萃取小柱纯化， 收集纯化液， 取 0.5mL 稀释到 6mL 后 进行戴安离子色谱分析， 上样分析量为 500μL。按实施例一的标准曲线方程计算， 可 得 72hAcinetobactercalcoaceticus DB-3 培 养 液 中 溴 离 子 浓 度 分 别 为 701.7μg/L， 550.4μg/L， 653.5μg/L， 平均值为 635.2μg/L。
本 发 明 属 于 微 生 物 应 用 领 域， 具 体 涉 及 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobacter calcoaceticusDB-3) 及其在降解十溴联苯醚中的应用。 背景技术 ：
十溴联苯醚 (BDE2209 或 DeBDE) 是市场上需求量最大的一类多溴联苯醚， 作为一 种溴系阻燃剂 (brominated flame retardants， BFRs)， 广泛用作耐冲击性聚苯乙烯、 聚酯、 聚酰胺、 纺织品和电子产品的添加剂。 近年来， 十溴联苯醚的需求不断的增加， 据统计， 1999 年全世界对 BDE2209 的需求量占对多溴联苯醚总需求量的 81％， 2001 年为 83％。到 2001 5 年为止， 我国阻燃剂总产量约为 1.5×10 t， 而 BDE2209 的销售量已达 1.35×104t。全球自 然环境中十溴联苯醚含量呈显著增长态势。 溴代阻燃剂具有难溶于水， 长距离迁移能力， 难 以生物降解等理化特点。 多溴联苯醚同时具有明显的生物蓄积特性， 生理上表现出致癌性、 神经毒性、 内分泌干扰毒性、 免疫功能紊乱致使性等危害。十溴联苯醚排放到环境中后， 经 光解、 高温分解、 生物及微生物降解等过程， 会转化为多溴二苯并二噁英、 多溴二苯并呋喃 以及低溴代的联苯醚， 这些降解物更容易进入生物体， 也引起更强的毒性作用。 环境中存在 的十溴联苯醚已逐渐成为一种生态安全威胁。 因此， 必须发掘可以高效、 安全降解十溴联苯 醚的方法。
生物降解是利用自然界存在的微生物分解物质， 对环境不会造成负面影响。目前 报道的具有十溴联苯醚降解能力的菌株， 包括有 White rot fungi， Rhodococcus jostii RHA1 和 Burkholderia xenovorans LB400 等， 但是它们降解速率很低， 功能不强。因此， 发 掘可以高效、 安全降解十溴联苯醚的功能菌株具有重要的意义。
到目前为止， 没有报道不动杆菌属 (Acinetobacter) 的菌株具有降解十溴联苯醚 的能力。 发明内容 ：
本 发 明 的 目 的 是 提 供 一 种 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobacter calcoaceticus DB-3) 及 其 在 降 解 十 溴 联 苯 醚 中 的 应 用， 该 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobacter calcoaceticus DB-3) 能够高效、 安全降解十溴联苯醚， 不会产生多溴二苯并二噁英、 多溴 二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污染物。
本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 是从广东汕头贵屿河床底泥分离、 纯化得到的 ：
该菌的理化参数如下 ：
1、 菌体的形态特性 ：
a. 采 用 常 规 的 细 菌 生 理 生 化 鉴 定 方 法 和 电 子 显 微 镜 观 察， Acinetobacter calcoaceticusDB-3 菌株为革兰氏阴性， 球杆状， 菌体大小为 1 ～ 1.5μm×1.5 ～ 2.5μm 微 米， 无芽孢。b. 在 LB 固体培养基平板上培养 24h 后， 菌落形态为圆形， 光滑不透明， 菌落直径为 1.5-2.0 毫米。
2、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 主要的理化特性 ：
Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株的生长温度 20-40℃， pH 范围 6-9， 好氧 生长， 氧化酶阴性， 接触酶阳性。
3、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 主要的遗传特征 ：
对 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 的 16S rRNA 测 序， BLAST 比 对 发 现， 本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 的 16S rRNA 基因序列与 Acinetobacter calcoaceticus 已有模式菌株具有较高的相似性， 其中与 Acinetobacter johnsonii DSM 6963 的序列相似性为 84％。
综合上述的生理生化特性、 16S rRNA 基因序列结果， 本发明的 Acinetobacter calcoaceticusDB-3 应 归 属 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobacter calcoaceticus)， 命名为 Acinetobacter calcoaceticusDB-3。
本发明人通过实验证实本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 具有十溴 联苯醚脱溴能力， 对十溴联苯醚具有较强的降解能力。 本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株对十溴联苯醚具有较强的降 解能力， 能对十溴联苯醚脱溴， 而产生游离的溴离子。 因此十溴联苯醚经过该菌生物降解处 理后不会产生多溴二苯并二噁英、 多溴二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污 染物。所以可以将该菌株用于环境中治理十溴联苯醚污染， 从而为化工污泥或废水中十溴 联苯醚的处理提供一种低成本、 高效率不发生二次污染的十溴联苯醚降解菌。
本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 于 2009 年 11 月 27 日， 保藏于中 国典型培养物保藏中心 (CCTCC， 地址 ： 中国武汉市武汉大学 )， 其保藏编号为 CCTCC NO ： M 209287。
具体实施方式 ：
一、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株的分离和鉴定
1、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株的分离 ：
培养基 ：
基础盐培养基： 每 升 培 养 基 中 含 有 KH2PO42.93g， Na2HPO48.87g， NH4Cl1.0g， NaCl0.5g， MgSO45g， CaCl2·2H2O0.15g， 微量元素盐溶液 2mL， 余量为水。
微量元素盐溶液： 每 升 微 量 元 素 盐 溶 液 中 含 有 Na2MoO430mg， ZnCl250mg， CuCl2·2H2O10mg， H3BO331mg， MnCl2·5H2O 30mg， NiCl2·6H2O 20mg， CoCl2·6H2O 36mg， 余量 为水。
本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株是从广东汕头贵屿河床底泥 经过分离、 纯化而得。
其分离纯化方法如下 ：
取 1g 河床底泥放在 100ml 添加有十溴联苯醚 2.0mg/L， 乳酸钠 1.0g/L， 酵母抽提 物 0.1g/L 的基础盐培养基中富集培养。富集培养过程通过离子色谱监测培养液中溴离 子的浓度变化指示富集效果， 富集培养是先在 30℃， 避光静置培养 14 天， 监测出明显的溴离子释放， 然后转接到含有十溴联苯醚 2.0mg/L， 乳酸钠 2.0g/L， 酵母抽提物 0.05g/L 的 基础盐培养基里继续在 30℃， 避光静置培养 14 天。然后从上步富集培养的培养液里取混 合菌群液涂布到添加含有乳酸钠 2.0g/L 固体基础盐培养基 ( 含有 20g/L 琼脂 ) 于 30 ℃ 温箱中进行培养， 从中挑取优势单菌落进行脱溴降解筛选， 纯化， 最后获得 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株。2、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株特征 ：
(1) 菌体的形态特性 ：
a. 采 用 常 规 的 细 菌 生 理 生 化 鉴 定 方 法 和 电 子 显 微 镜 观 察， Acinetobacter calcoaceticusDB-3 菌株为革兰氏阴性， 球杆状， 菌体大小为 1 ～ 1.5μm×1.5 ～ 2.5μm 微 米， 无芽孢。
b. 在 LB 固体培养基平板上培养 24h 后， 菌落形态为圆形， 光滑不透明， 菌落直径为 1.5-2.0 毫米。
(2)Acinetobacter calcoaceticus DB-3 主要的理化特性 ：
Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株的生长温度 20-40℃， pH 范围 6-9， 好氧 生长， 氧化酶阴性， 接触酶阳性。
(3)Acinetobacter calcoaceticus DB-3 主要的遗传特征 ：
具体方法参考分子克隆实验指南 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001) 中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 分子分类地位 ：
采用 DNA 小量提取方法提取 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 细菌总 DNA， 采 用 16S rRNA 通用引物 27F 和 1522r 扩增其 16S rRNA 基因， 将 PCR 产物直接测序， 其序列如 SEQ ID NO.1 所示， 将获得的 16S rRNA 基因序列输入 GenBank， 通过 BLAST 程序对数据库 中的所有序列进行比较分析， 结果发现本发明 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 的 16S rRNA 基因序列与 Acinetobacter calcoaceticus 已有模式菌株具有较高的相似性， 其中与 Acinetobacter johnsoniiDSM 6963 的序列相似性为 84％。
综合上述的生理生化特性、 16S rRNA 基因序列结果， 本发明的 Acinetobacter calcoaceticusDB-3 应 归 属 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobacter calcoaceticus)， 命名为 Acinetobacter calcoaceticusDB-3。
本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 于 2009 年 11 月 27 日， 保藏于中 国典型培养物保藏中心 (CCTCC， 地址 ： 中国武汉市武汉大学 )， 其保藏编号为 CCTCC NO ： M 209287。
实施例一 ：
Acinetobacter calcoaceticus DB-3 对浓度为 10mg/L 的十溴联苯醚的脱溴降解 试验 ：
降解基础培养基配方 ： 每 升 培 养 基 中 含 有 蛋 白 胨 1g， 酵 母 抽 提 物 0.5g， KH2PO42.93g， Na2HPO48.87g， NH4Cl 1.0g， NaCl 0.5g， MgSO45g， CaCl2·2H2O 0.15g， 余量为水。
1、 配制含十溴联苯醚 10mg/L 的降解实验培养基 ：
在 100ml 三角瓶中添加 300mg/L 用二氯甲烷溶解的十溴联苯醚储存液 1ml， 避光待 二氯甲烷挥发， 然后在三角瓶中添加 30ml 降解基础培养基， 摇匀后得到 30ml 降解实验培养 基。即降解实验培养基的配方 ： 每升培养基中含有十溴联苯醚 10mg， 蛋白胨 1g， 酵母 抽 提 物 0.5g， KH2PO42.93g， Na2HPO48.87g， NH4Cl 1.0g， NaCl 0.5g， MgSO45g， CaCl2·2H2O 0.15g， 余量为水。
2、 将本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 纯菌划 LB 板培养， 然后从固 体 LB 平板上挑取单菌落接种到 30ml 降解实验培养基中， 30℃， 150 转 / 分避光培养， 培养 48h 后， 取培养液， 利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度， 实验做三个平行样品。
3、 溴离子测定标准曲线的绘制及测定 ：
用 18.2mΩ 的 mini-Q 无菌水分别配制 0.00、 100、 250、 500、 750、 1000μg/L 溴化 钠标准梯度溶液， 用戴安 ICS-1500 型离子色谱进行色谱分析， 分析柱 AS19， 分析样品量 50μL， 分析时间 30min， 具体数据如表 1 所示 ：
表1
溴化钠标准溶液浓度 测定溴离子浓度
0.00 0.000100 98.68250 252.45500 499.82750 747.761000 1001.291500 1498.65由此得出标准曲线方程 ： y ＝ 0.0027x-0.0027。R2 ＝ 1.0， x 为溴离子浓度 ( 单位 μg/L)， y 为溴离子积峰面积 (μS*min)。
4、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 对十溴联苯醚脱溴降解的测定 ：
从 三 个 平 行 样 品 中 分 别 取 2mL 经 过 48h 上 述 培 养 的 培 养 液， 用 0.22μm 的 无 菌滤膜过滤， 过滤液经过 C18 固相萃取小柱纯化， 收集纯化液， 取 0.5mL 稀释到 6mL 后 进行戴安离子色谱分析， 上样分析量为 500μL。按上述标准曲线方程计算， 可得 48h 后 Acinetobactercalcoaceticus DB-3 培养液中溴离子浓度分别为 300.0μg/L， 227.0μg/L， 257.4μg/L， 平均值为 261.5μg/L。
实施例二 ：
Acinetobacter calcoaceticus DB-3 对浓度为 10mg/L 的十溴联苯醚的脱溴降解 试验 ：
1、 配制含十溴联苯醚 10mg/L 的降解实验培养基 ：
本实施例的降解实验培养基与实施例一的降解实验培养基相同。
2、 将本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 纯菌划 LB 板培养， 然后从固 体 LB 平板挑取单菌落接种至 30ml 降解实验培养基中， 于 30℃， 150 转 / 分避光培养， 培养 60h 后， 取培养液， 利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度， 实验做三个平行样品。
3、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 降解率的测定 ：
从三个平行样品中分别取 2mL 经过 60h 上述培养的培养液， 用 0.22μm 的无菌滤 膜过滤， 过滤液经过 C18 固相萃取小柱纯化， 收集纯化液， 取 0.5mL 稀释到 6mL 后进行戴 安离子色谱分析， 上样分析量为 500μL。根据实施例一的标准曲线方程计算， 可得 60h 后 Acinetobactercalcoaceticus DB-3 培养液中溴离子浓度分别为 498.3μg/L， 420.0μg/L， 389.7μg/L， 平均值为 436.0μg/L。
实施例三 ：Acinetobacter calcoaceticus DB-3 对浓度为 10mg/L 的十溴联苯醚的脱溴降解试验 ： 1、 配制含十溴联苯醚 10mg/L 的降解实验培养基 ：
本实施例的降解实验培养基与实施例一的降解实验培养基相同。
2、 将本发明的 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 纯菌划 LB 板常规培养， 然后 从固体 LB 平板上挑取单菌接种至 30ml 降解实验培养基中， 30℃， 150 转 / 分避光培养 72h 后， 取培养液， 利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度， 实验做三个平行样品。
3、 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 降解率的测定 ：
从 三 个 平 行 样 品 中 分 别 取 2mL 经 过 72h 上 述 培 养 的 培 养 液， 用 0.22μm 的 无 菌滤膜过滤， 过滤液经过 C18 固相萃取小柱纯化， 收集纯化液， 取 0.5mL 稀释到 6mL 后 进行戴安离子色谱分析， 上样分析量为 500μL。按实施例一的标准曲线方程计算， 可 得 72hAcinetobactercalcoaceticus DB-3 培 养 液 中 溴 离 子 浓 度 分 别 为 701.7μg/L， 550.4μg/L， 653.5μg/L， 平均值为 635.2μg/L。
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