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1、(10)申请公布号 CN 103353521 A (43)申请公布日 2013.10.16 CN 103353521 A *CN103353521A* (21)申请号 201310219363.X (22)申请日 2013.06.04 G01N 33/53(2006.01) G01N 33/531(2006.01) (71)申请人 华中师范大学 地址 430079 湖北省武汉市洪山区珞瑜路 152 号 (72)发明人 杜丹 (74)专利代理机构 湖北武汉永嘉专利代理有限 公司 42102 代理人 张安国 乔宇 (54) 发明名称 直读便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 含 量的方法 (57)。
2、 摘要 一种用直读便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 含量的方法， 采用包埋葡萄糖分子的载体脂 质体、 金属空心球、 多孔碳球、 多孔硅球或聚合物 球作为复合标记物， 通过夹心免疫反应或者 DNA 反应引入到传感器表面， 将生物标志物或者 DNA 检测转化为检测最终产物葡萄糖， 根据夹心免疫 分析原理， 待测生物标志物及 DNA 的含量与被包 埋的葡萄糖含量成正比， 通过血糖仪检测葡萄糖 的浓度即得到生物标志物及 DNA 的含量。本发 明将血糖仪发展成为了一种便携式、 万能型的生 物标志物及 DNA 测定仪， 构建了基于血糖仪检测 技术的生物标志物及 DNA 分析新方法， 可用于各 种生物标。
3、志物、 DNA 的实时、 在线、 简便、 灵敏的测 定。所用仪器设备简单， 分析成本低。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103353521 A CN 103353521 A *CN103353521A* 1/2 页 2 1. 用直读便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 含量的方法， 其特征在于 ： 采用包埋葡 萄糖分子的载体脂质体、 金属空心球、 多孔碳球、 多孔硅球或聚合物球作为复合标记物， 通 过夹心免疫反应或者 DNA 反。
4、应引入到传感器表面， 将生物标志物或者 DNA 检测转化为检测 最终产物葡萄糖， 根据夹心免疫分析原理， 待测生物标志物及 DNA 的含量与被包埋的葡萄 糖含量成正比， 通过血糖仪检测葡萄糖的浓度即得到生物标志物及 DNA 的含量。 2. 根据权利要求 1 所述的用直读便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 含量的方法， 其 特征在于 ： 测定磷化 p53 蛋白 p5315步骤如下 ： （1）免疫反应 ： 在 9 个 0.5mL 塑料离心管中分别加入 100L 磁性纳米复合物 Fe3O4-p5315Ab1， 然后在上述 9 个离心管中分别加入 100L 浓度为 0.2ng/mL， 0.5ng/m。
5、L， 1ng/mL， 2ng/mL， 5ng/mL， 10ng/mL， 20ng/mL， 50ng/mL， 100ng/mL 的 p5315，孵 化 50 分 钟 后， 磁性分离 ； 用磷酸缓冲溶液洗涤 2 次以上后， 再分别加入 100L 脂质体复合标记物 p5315Ab2-liposome， 孵化 40 分钟， 磁性分离 ； （2） 测定 ： 向离心管中加入 10L10mg/mLTritonX-100， 使葡萄糖分子从被俘获的脂质 体的内腔中释放出来 ； 然后磁分离移走免疫复合物， 取 20L 上层清液滴在血糖仪的试纸 条上， 直接读出血糖仪的示数， 即为转化成样品中 p5315的含量。 。
6、3. 根据权利要求 2 所述的用直读便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 的方法， 其特征 在于步骤 （1） 中所用的 Fe3O4-p5315Ab1的制备方法 ： 1） 、 200L5.0mg/mL羧基化的磁性纳米颗粒Fe3O4-COOH， 分散在1.0mL含有400mM1-乙 基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐酸盐和 100mMN- 羟基琥珀酰亚胺的 pH5.2 磺基 脂肪酸甲酯钠盐缓冲溶液中， 活化 30min 后磁分离， 并用磷酸缓冲溶液多次洗涤除去过量 的 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐酸盐和 N- 羟基琥珀酰亚胺 ； 2） 、 将Fe3O4。
7、-COOH分散在1.0mL20g/mLp5315Ab1中反应12h， 磁分离后用磷酸缓冲溶液 洗涤 3 次， 将所得到的磁性纳米复合物 Fe3O4-p5315Ab1分散在含有 1% 牛血清蛋白的磷酸缓 冲溶液中， 保存于 4 C 备用即可。 4. 根据权利要求 2 所述的用直读的便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 的方法， 其特 征在于步骤 （1） 中所用的 p5315Ab2-liposome 复合标记物的制备方法 ： 第一步， 制备包埋葡萄糖的生物素标记脂质体 ： 称取 124mg 氢化大豆卵磷脂、 25mg 胆固 醇、 6mg二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素加入到50mL圆底烧瓶中， 二。
8、硬脂酰乙醇胺-聚 乙二醇-生物素摩尔比159:64:2， 溶于15mL混合溶剂， 混合溶剂是氯仿、 异丙醚和甲醇混合 物， 氯仿 ： 异丙醚 ： 甲醇体积比 =6:6:1， 在 45 C 氮气保护下超声， 直到混合物分散均匀， 接 着将5mL5mg/mL45C的葡萄糖溶液加入上述混合物中探头超声5分钟， 使其形成颗粒均匀 分散的乳浊液 ； 然后在45C减压旋转蒸发以除去有机溶剂， 得到类凝胶状的分散液 ； 所得 到的脂质体溶液在 45 C 水浴孵化 30min 后， 维持在 45 C 条件下反复过厚度为 0.4m 聚碳酸酯膜 10 次， 得到粒径均匀分布的包埋葡萄糖的脂质体， 将反应液通过 S。
9、ephadexG-50 柱以除去未包封的葡萄糖及残留的有机物， 然后在室温下透析 12h， 即得到包埋葡萄糖的生 物素标记脂质体 ； 第二步， 合成 p5315Ab2-liposome 复合标记物 ： p5315Ab2-liposome 通过生物素和亲和 素之间的相互作用来合成， 用按第一步合成的包埋葡萄糖的生物素标记脂质体和商品化的 p5315Ab2-biotin 合成， 具体操作如下 ： 100L0.06mgmL-1亲和素与 100L 生物素标记脂质 权 利 要 求 书 CN 103353521 A 2 2/2 页 3 体室温混合震荡 2h， 待其反应完全后向混合物中加入 100L7.5g。
10、/mLp5315Ab2-biotin 室 温反应 2h， 接着将所得到的免疫复合物 p5315Ab2- 生物素 - 亲和素 - 生物素标记脂质体， 简 写为 ： p5315Ab2-liposome， 超滤离心以除去未结合的抗体， 然后将其分散在含有 1% 牛血清 蛋白的磷酸缓冲溶液中， 保存于 4 C 冰箱备用即可。 5. 根据权利要求 4 所述的用直读的便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 的方法， 其特 征在于 ： 所述的 p5315Ab2-liposome 复合标记物的制备方法第二步中， 所述的超滤离心是以 12,000rpm 离心 10 分钟后， 弃去上层清液。 权 利 要 求 书 C。
11、N 103353521 A 3 1/5 页 4 直读便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 含量的方法 技术领域 0001 本发明涉及采用直读便携式血糖仪测定生物标志物及脱氧核糖核酸 (DNA) 含量 的方法。具体涉及包埋葡萄糖分子的复合纳米载体的制备方法， 将生物标志物或者 DNA 检 测转化为检测最终产物葡萄糖， 以及采用血糖仪检测技术用于测定各种生物标志物、 DNA 含 量的分析方法。 背景技术 0002 生物标志物是生物体受到严重损害之前， 在不同生物学水平上因受环境污染物影 响而异常化的信号指标。 它可以对严重毒性伤害提供早期警报， 可用于疾病诊断、 判断疾病 分期或者用来评价新药或新。
12、疗法在目标人群中的安全性及有效性， 其含量高低是客观评价 个体健康状况的一个重要指标。与疾病相关的生物标志物大多是由一些癌症抗原、 细胞角 蛋白、 酶或某些癌基因组成， 发展简便、 灵敏的检测技术对于疾病及癌症的早期诊断与治疗 具有至关重要的作用。 目前， 基于这类生物标志物的检测方法主要包括 ： 免疫法、 色谱法、 荧 光法、 电化学方法等。其中免疫法以其高特异性得到广泛使用。免疫法是利用抗原抗体特 异性结合反应检测各种物质 （药物、 激素、 蛋白质、 微生物等） 的分析方法， 由于高等动物都 有免疫功能 , 在细菌、 病毒和有害物等病原入侵时 , 能产生抵御外来物的抗体 , 因此抗体 是专。
13、为抗原产生的 , 所以免疫法的专一性及亲和力极强 , 检测方法十分灵敏。但是免疫法 通常需要昂贵的检测仪器， 操作步骤繁琐， 不利于家庭化。 0003 自从上世纪 70 年代袖珍血糖仪发明后， 病人便可在家自测血糖， 快速得出结果， 从而决定治疗方案， 这被认为是糖尿病治疗史上的一个里程碑。血糖仪作为一种小型的测 定血糖含量的工具， 具有采血量少 （仅需 2 微升） ， 显示结果快， 结果准确， 操作简便， 价格便 宜等诸多优点， 自问世以来便得到糖尿病患者的广泛应用， 但在其他疾病的检测上却鲜有 类似的仪器。 0004 本发明创造性的将生物标志物含量测定转换为检测葡萄糖的浓度， 并采用直读便。
14、 携式血糖仪即可快速测定。该技术将血糖仪发展成为了一种便携式、 万能型的生物标志物 及 DNA 测定仪， 这在生物医学、 临床诊断等领域具有潜在的应用前景。 发明内容 0005 本发明的目的是将生物标志物或者 DNA 测定转化为检测最终产物葡萄糖的浓度， 并基于血糖仪检测器， 为各种生物标志物提供一种简单、 快捷、 低成本、 高灵敏的测定方法。 采用直读便携式血糖检测仪测定生物标志物及 DNA 含量， 将血糖仪发展成为一种万能型、 便携 式的生物标志物及 DNA 测定仪。 0006 本发明的技术方案 ： 用直读便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 含量的方法， 其 特征在于 ： 采用包埋葡萄糖。
15、分子的载体， 例如 ： 脂质体、 金属空心球、 多孔碳球、 多孔硅球或 聚合物球作为复合标记物， 通过夹心免疫反应或者 DNA 反应将其引入到传感器表面， 将生 物标志物或者 DNA 测定转化为检测最终产物葡萄糖， 根据夹心免疫分析原理， 待测生物标 说 明 书 CN 103353521 A 4 2/5 页 5 志物及 DNA 的含量与被包埋的葡萄糖含量成正比， 通过血糖仪检测葡萄糖的浓度即得到生 物标志物及 DNA 的含量。 0007 本发明以磷化蛋白 p5315测定为例进行说明。 0008 1、 Fe3O4-p5315Ab1的制备方法 ： 0009 1） 、 200L5.0mg/mL 羧 。
16、基 化 的 磁 性 纳 米 颗 粒 Fe3O4-COOH 分 散 在 1.0mL 含 有 400mM1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐酸盐 （EDC） 和 100mM N- 羟基琥珀酰 亚胺 （NHS） 的 pH5.2 磺基脂肪酸甲酯钠盐缓冲溶液 （MES） 中活化 30min 后磁分离， 并用磷酸 缓冲溶液 （PBS） 多次洗涤除去过量的 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐酸盐 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 ； 0010 2） 、 将 Fe3O4-COOH 分散在 1.0mL20g/mL p5315Ab1中反应过夜 （12h） ， 磁分离后用 磷酸。
17、缓冲溶液 （PBS） 洗涤3次， 将所得到的磁性纳米复合物Fe3O4-p5315Ab1分散在含有1%牛 血清蛋白 （BSA） 的磷酸缓冲溶液 （PBS） 中， 保存于 4备用 ； 0011 2、 p5315Ab2-liposome 复合标记物的制备 0012 具体步骤为 ： 0013 第一步， 制备包埋葡萄糖的生物素标记脂质体 ： 称取 124mg 氢化大豆卵磷脂 (HSPC)、 25mg 胆固醇、 6mg 二硬脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 - 生物素 (DSPE-PEG-biotin) 加入到 50mL 圆底烧瓶中， 二硬脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 - 生物素摩尔比 159:64:2， 溶于 15。
18、mL 混合溶 剂， 混合溶剂是氯仿、 异丙醚和甲醇混合物， 混合物中氯仿 ： 异丙醚 ： 甲醇体积比 =6:6:1， 在 45氮气保护下超声， 直到混合物分散均匀， 接着将 5mL5mg/mL45的葡萄糖溶液加入上述 混合物中探头超声 5 分钟， 使其形成颗粒均匀分散的乳浊液 ； 然后在 45减压旋转蒸发以 除去有机溶剂， 得到类凝胶状的分散液 ； 所得到的脂质体溶液在 45水浴孵化 30min 后， 维 持在 45条件下反复过厚度为 0.4m 聚碳酸酯膜 10 次， 得到粒径均匀分布的包埋葡萄糖 的脂质体， 将反应液通过Sephadex G-50柱以除去未包封的葡萄糖及残留的有机物， 然后在。
19、 室温下透析 12h， 即得到包埋葡萄糖的生物素标记脂质体 ； 0014 第 二 步， 合 成 p5315Ab2-liposome 复 合 标 记 物 ： p5315Ab2-liposome 通 过 生 物 素 （biotin）和亲和素 （avidin）之间的相互作用来合成， 包埋葡萄糖的生物素标记 脂质体 (biotin-liposome) 按第一步合成， 商品化的 p5315Ab2也是生物素标记的， 即 p5315Ab2-biotin， 具 体 操 作 如 下 ： 100L0.06mg mL-1亲 和 素 （avidin）与 100L 生 物素标记脂质体室温混合震荡 2h， 待其反应完全后。
20、向混合物中加入 100L7.5g/mL p5315Ab2-biotin 室温反应 2h， 接着将所得到的免疫复合物 p5315Ab2- 生物素 - 亲和素 - 生 物素标记脂质体 （p5315Ab2-biotin-avidin-biotin-liposome， 简写为 ： p5315Ab2-liposome) 超滤离心以除去未结合的抗体， 然后将其分散在含有 1% 牛血清蛋白 （BSA） 的磷酸缓冲溶液 （PBS） 中， 保存于 4冰箱备用。 0015 3、 检测方法 0016 用直读便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 的方法测定磷化 p53 蛋白 （p5315） 步 骤如下 ： 0017 。
21、（1）免疫反应 ： 在 9 个 0.5mL 塑料离心管中分别加入 100L 磁性纳米复合物 Fe3O4-p5315Ab1， 然后在上述9个离心管中分别加入100L浓度为0.2ng/mL， 0.5ng/mL， 1ng/ mL， 2ng/mL， 5ng/mL， 10ng/mL， 20ng/mL， 50ng/mL， 100ng/mL 的 p5315， 孵化 50 分钟后， 磁性分 说 明 书 CN 103353521 A 5 3/5 页 6 离 ； 用磷酸缓冲溶液洗涤3次， 再分别加入100L脂质体复合标记物p5315Ab2-liposome， 孵 化 40 分钟， 磁性分离 ； 0018 （2） 。
22、测定 ： 向离心管中加入 10L10mg/mL Triton X-100( 曲拉通 X-100， 化学名称 为聚乙二醇辛基苯基醚， 又名 ： OP-10 乳化剂， 属于非离子型表面活性剂， 分子量为 646.86， 外观白色） ， 使葡萄糖分子从被俘获的脂质体的内腔中释放出来 ； 然后磁分离移走免疫复合 物， 取 20L 上层清液滴在血糖仪的试纸条上， 直接读出血糖仪的示数， 即为转化成样品中 p5315的含量。 0019 本发明有益效果 ： 0020 1、 ） 应用范围极广。本发明将血糖仪发展成为了一种便携式、 万能型的生物标志 物及DNA含量测定仪， 构建了基于血糖仪检测技术的生物标志物及。
23、DNA分析新方法， 该方法 将所需检测的抗原含量转化为脂质体包埋的葡萄糖浓度， 只需将载体上负载的抗体对应更 换， 便可用于其它生物标志物的检测。对于 DNA 检测也是同样道理。因此， 该技术将血糖仪 发展成为了一种便携式、 万能型的生物标志物、 DNA 测定仪。这是生物标志物及 DNA 实时、 在线、 简便、 灵敏检测的一个重大突破。同时， 还可将该反应基底更换为试纸条、 96 孔板等 （即 ： 将一抗负载到试纸条、 96 孔板上） ， 应用范围进一步扩大。 0021 2、 信号放大。 以脂质体作为载体， 其内腔可包埋数万个葡萄糖分子， 与常规免疫方 法相比， 该载体极大的提高了检测灵敏度。。
24、 除了脂质体之外， 金属空心球、 多孔碳球、 多孔硅 球、 聚合物球等都可以作为载体包埋葡萄糖分子。 0022 3、 操作简单， 快捷、 成本低。Fe3O4特有的磁性功能使得整个分离过程简单、 高效， 最终收集的葡萄糖分子可以直接用小型、 数显的血糖仪实现快速测定， 所用仪器设备简单， 分析成本低。 附图说明 0023 图 1 直读便携式血糖仪测定生物标志物及 DNA 含量的检测原理图 ； 0024 图 2 磷化 p53 蛋白 (p5315) 的检测原理图 ； 0025 图3p5315浓度与血糖仪显示数的标准曲线 （结果显示血糖仪的示数与p5315浓度成 正比） ； 0026 图中 ： p53。
25、15的浓度分别为 ： 0.2， 0.5， 1， 2， 5， 10， 20， 50， 100ng/mL。 具体实施方式 0027 实施例 1 0028 用直读便携式血糖仪测定磷化 p53 蛋白 （p5315） 步骤如下 ： 0029 （1）免疫反应 ： 在 9 个 0.5mL 塑料离心管中分别加入 100L 磁性纳米复合 物 Fe3O4-p5315Ab1， 然后在上述 9 个离心管中分别加入 100L 浓度为 0.2ng/mL， 0.5ng/ mL， 1ng/mL， 2ng/mL， 5ng/mL， 10ng/mL， 20ng/mL， 50ng/mL， 100ng/mL 的 p5315， 孵 化 。
26、50 分 钟 后， 磁性分离 ； 用磷酸缓冲溶液洗涤 2 次以上后， 再分别加入 100L 脂质体复合标记物 p5315Ab2-liposome， 孵化 40 分钟， 磁性分离 ； 0030 （2） 测定 ： 向离心管中加入 10L10mg/mL Triton X-100， 使葡萄糖分子从被俘获 的脂质体的内腔中释放出来 ； 然后磁分离移走免疫复合物， 取 20L 上层清液滴在血糖仪 说 明 书 CN 103353521 A 6 4/5 页 7 的试纸条上， 直接读出血糖仪的示数， 即为转化成样品中 p5315的含量。 0031 实施例 2 0032 实施例 1 中所用的 Fe3O4-p531。
27、5Ab1的制备 0033 1） 、 200L5.0mg/mL 羧基化的磁性纳米颗粒 Fe3O4-COOH， 分散在 1.0mL 含有 400mM1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐酸盐和 100mM N- 羟基琥珀酰亚胺的 pH5.2 磺基脂肪酸甲酯钠盐缓冲溶液中， 活化 30min 后磁分离， 并用磷酸缓冲溶液多次洗涤 除去过量的 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐酸盐和 N- 羟基琥珀酰亚胺 ； 0034 2） 、 将 Fe3O4-COOH 分散在 1.0mL20g/mL p5315Ab1中反应 12h， 磁分离后用磷酸缓 冲溶液洗涤 3 次，。
28、 将所得到的磁性纳米复合物 Fe3O4-p5315Ab1分散在含有 1% 牛族血清蛋白 的磷酸缓冲溶液中， 保存于 4备用即可。 0035 实施例 3 0036 实施例 1 中所用的 p5315Ab2-liposome 复合标记物的制备 0037 第一步， 制备包埋葡萄糖的生物素标记脂质体 ： 称取 124mg 氢化大豆卵磷脂、 25mg 胆 固醇、 6mg 二硬脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 - 生物素加入到 50mL 圆底烧瓶中， 二硬脂酰乙醇 胺-聚乙二醇-生物素摩尔比159:64:2， 溶于15mL混合溶剂， 混合溶剂是氯仿、 异丙醚和甲 醇混合物， 氯仿 ： 异丙醚 ： 甲醇体积比 =6:。
29、6:1， 在 45氮气保护下超声， 直到混合物分散均 匀， 接着将 5mL5mg/mL45的葡萄糖溶液加入上述混合物中探头超声 5 分钟， 使其形成颗粒 均匀分散的乳浊液 ； 然后在 45减压旋转蒸发以除去有机溶剂， 得到类凝胶状的分散液 ； 所得到的脂质体溶液在 45水浴孵化 30min 后， 维持在 45条件下反复过厚度为 0.4m 聚碳酸酯膜 10 次， 得到粒径均匀分布的包埋葡萄糖的脂质体， 将反应液通过 Sephadex G-50 柱以除去未包封的葡萄糖及残留的有机物， 然后在室温下透析 12h， 即得到包埋葡萄 糖的生物素标记脂质体 ； 0038 第二步， 合成 p5315Ab2-。
30、liposome 复合标记物 ： p5315Ab2-liposome 通过生物素和 亲和素之间的相互作用来合成， 包埋葡萄糖的生物素标记脂质体按第一步合成， 商品化 的 p5315Ab2也是生物素标记的， 即 p5315Ab2-biotin， 具体操作如下 ： 100L0.06mg mL-1 亲和素与 100L 生物素标记脂质体室温混合震荡 2h， 待其反应完全后向混合物中加入 100L7.5g/mLp5315Ab2-biotin 室温反应 2h， 接着将所得到的免疫复合物 p5315Ab2- 生物 素 - 亲和素 - 生物素标记脂质体， 简写为 ： p5315Ab2-liposome， 超滤。
31、离心以除去未结合的抗 体， 然后将其分散在含有 1% 牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液中， 保存于 4冰箱备用即可。 0039 表 1 包埋葡萄糖的脂质体的表征 0040 结果显示 ： 脂质体的平均粒径约为 176nm， 每个脂质体中可以包埋 4105个葡萄 糖分子。表 2 该方法检测结果与 ELISA 的对比 0041 结果显示 ： 该方法检测结果与传统的 ELISA 检测具有很好的一致性。其相对误差 范围小于 5%， 说明该方法检测是可信的。 0042 表 1 包埋葡萄糖的脂质体的表征 0043 说 明 书 CN 103353521 A 7 5/5 页 8 0044 表 2 本发明方法检测结果与 ELISA 的对比 0045 说 明 书 CN 103353521 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103353521 A 9 2/2 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 103353521 A 10 。