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1、10申请公布号CN104120123A43申请公布日20141029CN104120123A21申请号201410314791522申请日20140703C12N15/11200601C12Q1/6820060171申请人中国农业科学院北京畜牧兽医研究所地址100193北京市海淀区农大南路72发明人杜立新魏彩虹张莉赵福平陈华74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君54发明名称与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用57摘要本发明提供一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用，其位于绵羊CLPG基因如SEQIDNO1所示序列的232BP处，此处碱基为T的绵羊具有双肌臀。
2、性状，此处碱基为C的绵羊无双肌臀性状。采用聚合酶链式反应PCR和测序技术筛选到与绵羊双肌臀性状状相关的SNP标记，并通过限制片段多态性RFLP方法来检测待测绵羊的基因型，根据基因型进行双肌臀性状绵羊优势品种的选育，从而加快绵羊的育种进程。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表1页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表1页附图2页10申请公布号CN104120123ACN104120123A1/1页21一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记，其特征在于，其位于绵羊CLPG基因如SEQIDNO1所示序列的232BP处，此处碱基为T的绵羊具有双肌臀。
3、性状，此处碱基为C的绵羊无双肌臀性状。2用于检测权利要求1所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记的引物，其特征在于，包括正向引物F5TGAAAACGTGAACCCAGAAGC3和反向引物R5GGCAGGAGAGACGGTTAAT3。3权利要求1所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在鉴定具有双肌臀性状的优势绵羊品种中的应用，其包括步骤1提取待测绵羊的基因组DNA；2以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物F和R，通过PCR反应扩增出大小为493BP的绵羊CLPG基因片段；3检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中232BP处的碱基为T，则待测绵羊属于具有双肌臀性状的优势绵羊品种。4根据。
4、权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2中PCR反应使用的扩增体系以25L计为40NG/L模板DNA2L，10MOL引物F和R各1L，25MMOLDNTPS2L，5U/LTAQDNA聚合酶05L，10PCR反应缓冲液25L，余量为DDH2O。5根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2中PCR反应使用的扩增程序为945分钟；9440秒，5530秒，7250秒，33个循环；7210分钟。6根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为用内切酶HHA对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果为两条带，则待测绵羊属于普通品种，。
5、且基因型为纯和CC型；检测结果仅为一条带，则待测绵羊属于携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT型；检测结果为三条带，则待测绵羊属于具有双肌臀性状的优势品种，且基因型为杂合CT型。7含有权利要求2所述引物的用于检测绵羊双肌臀性状的试剂盒。8根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNTPS、TAQDNA聚合酶、MG2、PCR反应缓冲液中的一种或多种。9根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。10权利要求1所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在绵羊分子标记辅助育种中的应用。权利要求书CN104120123A1/5页3与绵羊双肌臀性状相关的。
6、SNP标记及其应用技术领域0001本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用。背景技术0002自20世纪80年代末以来，中国已成为世界上绵羊、山羊饲养量、出栏量、羊肉产量最多的国家。随着国民消费理念的变化和对羊肉营养价值的认识，羊肉的市场需求量日益增加。然而，我国肉羊生产落后于世界先进水平，肉羊育种技术集成创新力度不足，育种的技术水平和效率低下，致使拥有自主知识产权的优质肉羊品种匮乏，现有良种贡献率低，市场竞争力差。0003CALLIPYGE基因是近年来备受关注的动物“双肌臀”性状的候选基因，简写为CLPGCOCKETTNE,JACKSONS。
7、P,SHAYTL,ETALCHROMOSOMALLOCALIZATIONOFTHECALLIPYGEGENEINSHEEPOVISARIESUSINGBOVINEDNAMARKERSAPROCNATLACADSCIUSAC,1994,9130193023。具有CLPG表型的绵羊最初于1983年发现于美国，此种绵羊肌肉特别发达，背最长肌大且通常突出于棘突之上，以致在背中线形成一凹槽结构，后腿肌肉厚实。发明内容0004本发明的目的是提供一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用。0005为了实现本发明目的，本发明提供一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记，其位于绵羊CLPG基因如SEQIDNO1所。
8、示序列的232BP处，此处碱基为T的绵羊具有双肌臀性状，此处碱基为C的绵羊无双肌臀性状。0006本发明还提供用于检测所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记的引物，包括正向引物F5TGAAAACGTGAACCCAGAAGC3和反向引物R5GGCAGGAGAGACGGTTAAT3。0007本发明还提供所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在鉴定具有双肌臀性状的优势绵羊品种中的应用，其包括步骤00081提取待测绵羊的基因组DNA；00092以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，通过PCR反应扩增出绵羊CLPG基因493BP片段；00103检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中232BP处的。
9、碱基为T，则待测绵羊属于具有双肌臀性状的优势绵羊品种。0011步骤2中PCR反应使用的扩增体系以25L计为40NG/L模板DNA2L，10MOL引物F和R各1L，25MMOLDNTPS2L，5U/LTAQDNA聚合酶05L，10PCR反应缓冲液25L，余量为DDH2O。0012步骤2中PCR反应使用的扩增程序为945分钟；9440秒，5530秒，7250秒，33个循环；7210分钟。说明书CN104120123A2/5页40013步骤3中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为用内切酶HHA对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果为两条带232BP和261BP。
10、，则待测绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果仅为一条带493BP，则待测绵羊属于具有携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT型；检测结果为三条带493BP、232BP和261BP，则待测绵羊属于具有双肌臀性状的优势品种，且基因型为杂合CT型。0014本发明还提供含有上述引物F和R的用于检测绵羊双肌臀性状的试剂盒。0015优选地，所述试剂盒还包括DNTPS、TAQDNA聚合酶、MG2、PCR反应缓冲液等中的一种或多种。0016更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。0017本发明进一步提供所述与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记在绵羊分子标记辅助育种中的应用。0018本发明提供了。
11、一种与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记及其应用，既采用聚合酶链式反应PCR和测序技术筛选到与绵羊双肌臀性状状相关的SNP标记，并通过限制片段多态性RFLP方法来检测待测绵羊的基因型，根据基因型进行双肌臀性状绵羊优势品种的选育，从而加快绵羊的育种进程。0019本发明具有以下优点0020一本发明提供的分子遗传标记不受绵羊的年龄、性别等限制，可用于绵羊的早期选育，甚至在绵羊刚出生时就可准确地进行筛选，可大大加快绵羊的育种进程；0021二可快速准确地对绵羊CLPG基因进行SNP位点检测，可以快速检测每个绵羊个体在SNP位点的遗传变异情况，可快捷获得该引物对绵羊多态性图谱，所得结果可直观地检测出绵羊每个个。
12、体的基因型，以期找到与该SNP位点连锁的性状，为后续与传统方法结合进行育种工作奠定基础；0022三进行SNP基因检测实现了低成本、高精度、高通量的闭管操作，大大降低了实验过程中由污染可能导致的误差。附图说明0023图1为本发明实施例2中对F1代绵羊样本进行PCR检测结果。0024图2为本发明实施例2中PCRRLFP酶切检测结果。0025图3为本发明实施例2中对20个绵羊样本CLPG基因扩增产物测序的结果。具体实施方式0026以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如SAMBROOK等分子克隆实验手册SAMBROOKJRUSSELLDW,MOL。
13、ECULARCLONINGALABORATORYMANUAL,2001，或按照制造厂商说明书建议的条件。0027实施例1与绵羊双肌臀性状相关的SNP标记的获得002811澳洲白绵羊血液DNA提取0029本实施例中使用的澳洲白绵羊血样为加入抗凝剂于20保存的绵羊全血，解冻后用购自天根生化科技北京有限公司的血液DNA提取试剂盒从血液中提取基因组DNA，说明书CN104120123A3/5页5具体步骤如下00301血样置冰上融化，取300L至一高压灭菌后的离心管中，按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书操作。00312加裂解液CL900L，颠倒或振荡混匀，室温静置5MIN，期间再多次颠倒混匀。1000。
14、0RPM离心1MIN，吸去上清液体，保留白色沉淀。若裂解不彻底，即重复操作一次。00323加缓冲液GS200L，彻底振荡至混匀。00334加PROTEINASEK20L溶液并混匀。00345加缓冲液GB200L，颠倒数次充分混匀，在56水浴锅中放置10MIN，期间应多次颠倒混匀，直至溶液颜色彻底清亮。00356加无水乙醇200L，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。00367将上一步所得溶液与絮状沉淀全部加入到一个吸附柱中，离心机12000RPM离心30SEC，吸去废液，将吸附柱重新放回收集管中。00378向吸附柱中加入缓冲液GD500L已用无水乙醇配比，12000RPM离心30SEC，吸去。
15、弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。00389向吸附柱中加缓冲液PW600L已用无水乙醇配比，12000RPM离心30SEC，吸去废液，将吸附柱重新放回收集管中。003910重复步骤9。004011将吸附柱12000RPM空离2MIN，倒掉废液。打开吸附柱上盖，室温静置5分钟，彻底晾干，以防漂洗液残留物影响后续PCR或酶切反应。004112将吸附柱转入另一高压洁净的离心管中，向吸附膜中间部分悬空滴加80L洗脱液TB，室温放置5MIN，12000RPM离心2MIN。重复此操作一次，DNA即收集于离心管中。经1琼脂糖凝胶电泳检测、核酸蛋白浓度测定仪检测DNA纯度后，置于20冰箱保存。004212目的。
16、片段和SNP位点的获得以及PCRRFLP分型00431扩增含SNP位点的核苷酸片段0044根据GENBANK数据库提供的绵羊CLPG基因序列登录号AF5330091设计引物，正向引物F5TGAAAACGTGAACCCAGAAGC3和反向引物R5GGCAGGAGAGACGGTTAAT3，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，该SNP位点位于该PCR扩增片段的232BP处，该处碱基可以为C或T，当该处碱基为C时，可被HHA内切酶识别序列为CATG识别。0045其中，PCR反应使用的扩增体系以25L计为40NG/L模板DNA2L，10MOL引物F和R各1L，25MMOLDNTPS2L，5U/LTAQDN。
17、A聚合酶05L，10PCR反应缓冲液25L，余量为DDH2O。0046PCR反应使用的扩增程序为945分钟；9440秒，5530秒，7250秒，33个循环；7210分钟。00472针对第232位碱基的不同选择适当的内切酶进行PCRRFLP0048该PCR产物用HHA内切酶酶切，反应体系以25L计为20000U/ML酶HHA08L，酶切缓冲液3L，PCR扩增产物4L，DDH2O172L。37水浴锅中过夜酶切。用3琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用凝胶成像系统拍照，根据带型判断基因型。00493、基因型判定及关联分析0050根据PCRRFLP的结果判定该位点在检测群体中的基因型。若为检测结果为两说明书。
18、CN104120123A4/5页6条带232BP和261BP，则待测F1代绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果仅为一条带493BP，则待测F1代绵羊属于具有携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT型；检测结果为三条带493BP、232BP和261BP，则待测F1代绵羊属于具有双肌臀性状的优势品种，且基因型为杂合CT型。即，该位点可分为3种基因型TT493，CT493/232/261，CC232/261。0051实施例1绵羊不同基因型与双肌臀性状的关联分析及检测应用0052包括1、准备阶段；2、DNA检测；3、检测结果分析。具体步骤如下00531、准备阶段005411采集78。
19、只澳洲白绵羊和173只杜泊羊的F1代杂种绵羊血液样本，用购自天根生化科技北京有限公司的DNA提取试剂盒提取绵羊血液中的DNA。005512根据SNP标记位于绵羊CLPG基因上的位置，设计并合成引物，引物序列如下正向引物F5TGAAAACGTGAACCCAGAAGC3和反向引物R5GGCAGGAGAGACGGTTAAT3，扩增产物片段大小为498BP。00562、DNA检测005721PCR扩增0058采用普通PCR扩增方法，反应体系以25L计为40NG/L模板DNA2L，10MOL引物F和R各1L，25MMOLDNTPS2L，5U/LTAQDNA聚合酶05L，10PCR反应缓冲液25L，余量为。
20、DDH2O。0059反应程序94预变性5MIN；94变性40S，55复性30S，72延伸50S，33个循环；72延伸10MIN。产物用1琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统拍照，与DNAMARKER比较。006022PCRRLFP检测0061用购自BIOLABS公司的限制性内切酶HHA对PCR扩增产物进行酶切，酶切反应体系为25L，包括20000U/ML酶HHA08L，酶切缓冲液3L，PCR扩增产物4L，DDH2O172L。37水浴锅中过夜酶切。用3琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用凝胶成像系统拍照，根据带型判断基因型。00623、PCR产物及PCRRFLP酶切检测结果006331PCR产物检测00。
21、64对173个F1代绵羊样本进行PCR检测，成功获得493BPSEQIDNO1的扩增产物，如图1所示。006532PCRRLFP酶切检测0066用限制性内切酶HHA对PCR产物进行酶切。若为检测结果为两条带232BP和261BP，则待测F1代绵羊属于普通品种，且基因型为纯和CC型；检测结果仅为一条带493BP，则待测F1代绵羊属于具有携带双肌臀性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT型；检测结果为三条带493BP、232BP和261BP，则待测F1代绵羊属于具有双肌臀性状的优势品种，且基因型为杂合CT型。酶切结果如图2所示。0067选取20个绵羊样本CLPG基因扩增产物测序，结果如图3所示。00。
22、68对本实验中发现的突变位点为GCTGAGAGCTGCAGGAA的SNP位点进行验证。从纯种杜泊羊和澳洲白羊群中挑选10只含有CT突变CALLIPYGE基因T的父本,和说明书CN104120123A5/5页7不含突变的200只野生型等位基因C母本杜泊羊和澳洲白,杂交后获得F1代，杂合绵羊CT在6月龄时体重明显高于TT型和CC型。且6月龄背膘厚低于TT型和CC型表1。0069表1杂交试验结果验证00700071澳T澳C0072CT5890931002304103958054TT50602826803604904553039CC5070172230260480394980320073虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书CN104120123A1/1页80001序列表CN104120123A1/2页9图1图2说明书附图CN104120123A2/2页10图3说明书附图CN104120123A10。