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1、10申请公布号CN104178568A43申请公布日20141203CN104178568A21申请号201410360025222申请日20140725C12Q1/6820060171申请人清华大学地址100084北京市海淀区北京市100084信箱82分箱清华大学专利办公室72发明人周小红向宇王若瑜施汉昌74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法57摘要本发明公开了一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法。本发明提供的方法包括如下步骤1将功能磁珠与待测样本共孵育；功能磁珠。
2、是将A和B杂交得到的；A表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠；B连接有链霉亲和素和标记物的探针；2完成步骤1后，进行磁分离，收集上清液；3在与标记物相应的激发波长激发下，采用表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片检测步骤2得到的上清液，根据信号值判断待测样本中是否含有靶标物质。本发明的方法具有成本低廉、简单、快速的优点，并保持了适配体靶标分子广泛、特异性好且灵敏度高的优点，可稳定使用300次以上。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表1页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表1页附图3页10申请公布号CN104178568ACN10。
3、4178568A1/1页21一种检测待测样本中是否含有靶标物质的方法，包括如下步骤1将功能磁珠与所述待测样本共孵育；所述功能磁珠是将A和B杂交得到的；所述A为表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠；所述B为连接有链霉亲和素和标记物的探针；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子；2完成步骤1后，进行磁分离，收集上清液；3在与标记物相应的的激发波长激发下，采用表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片检测步骤2得到的上清液，根据信号值判断待测样本中是否含有靶标物质。2如权利要求1所述的方法，其特征在于所述表面修饰有脱硫生物素的固相芯片的制备方法包括如下步骤1取固相芯片，使其表面羟基化；。
4、2完成步骤1后，取固相芯片，使其表面修饰APTS；3完成步骤2后，取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素。3如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述固相芯片为光纤。4如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述靶标物质为赭曲霉素A。5如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述磁珠为羧基磁珠。6如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述核酸适配体如序列表的序列1所示，所述探针如序列表的序列2所示。7一种检测待测样本中是否含有靶标物质的试剂盒，包括功能磁珠和表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片；所述功能磁珠是将A和B杂交得到的；所述A为表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠；。
5、所述B为连接有链霉亲和素和标记物的探针；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子。8一种检测待测样本中是否含有靶标物质的试剂盒，包括“表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片”、“表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠”和“连接有链霉亲和素和标记物的探针”；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子。9如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于所述固相芯片为光纤；所述磁珠为羧基磁珠。10如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述靶标物质为赭曲霉素A；所述核酸适配体如序列表的序列1所示，所述探针如序列表的序列2所示。权利要求书CN104178568A1/8页3一种基于核酸适。
6、配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法技术领域0001本发明涉及一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法。背景技术0002以核酸适配体为生物识别材料的传感分析方法在最近二十多年得到了飞速发展。核酸适配体是一段能够特异性识别目标污染物的RNA或单链DNA片段。早在上个世纪九十年代，NATURE和SCIENCE期刊几乎同时首次报道了核酸适配体材料及其筛选技术。经过二十几年的发展，目前已经报道的核酸适配体材料已经可以检测环境中的上百种物质。0003以核酸适配体为生物识别元件的传感分析方法包括可分为均相和非均相或异相适配体传感分析两种方法。目前，均相法的核酸适配体传。
7、感技术仍然是主流。比如，UNIVERSITYOFILLINOISATURBANACHAMPAIGN大学LUYI课题组利用在核酸适配体探针上固定荧光基团和猝灭基团，基于靶标物质识别后产生的DNA构象变化实现荧光信号的增强或减弱，从而建立起靶标物浓度与荧光信号的定量关系。均相反应速度快，检测过程简单，然而试剂消耗量大、检测成本高。固相法通常以固定单链DNA探针为主，基于DNA探针对杂交链和靶标物亲和能力的差异实现检测。为实现多次使用，需要将杂交后的DNA链或靶标物洗脱。已经报道的洗脱方法包括酸洗/碱洗、加热、高盐洗脱、EDTA螯合、表面活性剂洗脱等。缺点是稳定可重复使用的次数非常有限，通常在515。
8、次之间。究其原因是DNA的三级构象非常脆弱，在各种洗脱条件下，很难恢复到初始状态。这样低的稳定重复使用次数也极大限制了固相DNA技术的发展和适用范围。发明内容0004本发明的目的是提供一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法。0005本发明提供了一种检测待测样本中是否含有靶标物质的方法，包括如下步骤00061将功能磁珠与所述待测样本共孵育；所述功能磁珠是将A和B杂交得到的；所述A为表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠；所述B为连接有链霉亲和素和标记物的探针；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子；00072完成步骤1后，进行磁分离，收集上清液；0008。
9、3在与标记物相应的的激发波长激发下，采用表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片检测步骤2得到的上清液，根据信号值判断待测样本中是否含有靶标物质。0009所述表面修饰有脱硫生物素的固相芯片的制备方法包括如下步骤0010取固相芯片，使其表面羟基化；0011完成步骤后，取固相芯片，使其表面修饰APTS；0012完成步骤后，取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素。说明书CN104178568A2/8页40013“取固相芯片，使其表面羟基化”的方法具体如下将固相芯片浸入PIRAHA溶液98浓H2SO4H2O231，体积比并120反应1H；完成步骤后，取出固相芯片，用超纯水清洗直到PH值为中性，在室温下用氮气。
10、吹干，然后置于70真空干燥箱中保存1H。0014“取固相芯片，使其表面修饰APTS”的方法具体如下取固相芯片，置于APTS溶液中反应1H；完成步骤后，取出固相芯片，用无水甲苯冲洗，在室温下用氮气吹干，然后置于200烘烤1H。APTS溶液溶质为APTS，溶剂为无水甲苯，溶质的浓度为2体积比。0015“取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素”的方法具体如下取固相芯片，置于戊二醛溶液中室温反应1H，然后用乙醇冲洗，然后置于乙二胺溶液中室温反应15H，然后置于NABH4溶液中室温反应15MIN；取25MG脱硫生物素、50MGEDC和50MGNHS，用1000LDMF溶解，室温反应3H，然后加入200LPH。
11、87、1M的NAHCO3NA2CO3缓冲液并混匀，得到混合液；完成步骤后，取出固相芯片，加入步骤得到的混合液中，室温反应12小时；完成步骤后，取出固相芯片，用乙醇冲洗，然后置于含2MG/MLBSA的PBS缓冲液中，室温反应1H。戊二醛溶液溶质为戊二醛，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为25。乙二胺溶液溶质为乙二胺，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为10。NABH4溶液溶质为NABH4，溶剂为乙醇，溶质的浓度为10MG/ML。0016所述“连接有链霉亲和素和标记物的探针”的制备方法具体如下合成探针，在5末端进行巯基修饰，在3末端进行标记物修饰，命名为SHDNA标记物；在10L1MMSHDNA标记。
12、物中加入067LTCEP溶液，避光室温反应1H，以活化巯基；取AMICON3K，加入完成步骤后得到的整个反应体系，再加入200LBUFFERA1，然后12000RPM离心10MIN，用BUFFERA2洗涤AMICON3K，收集分子量大于3K的组分溶液形式；取133L20MG/ML链霉亲和素水溶液，加入033MGSULFOSMCC，漩涡震荡5MIN，然后室温反应1H，12000RPM离心5MIN，取上清液；取AMICON10K，加入步骤得到的上清液，再加入200LBUFFERA1，12000RPM离心10MIN，用BUFFERA2洗涤AMICON10K，收集分子量大于10K的组分溶液形式；将步骤。
13、得到的溶液加入步骤得到的溶液中，避光室温反应48H；取AMICON10K，加入完成步骤后得到的整个反应体系，再加入200LBUFFERA1，12000RPM离心10MIN，用BUFFERA2洗涤AMICON10K，收集分子量大于10K的组分溶液形式，即为含有连接有链霉亲和素和标记物的探针溶液。TCEP溶液溶质为TCEP，溶剂超纯水，溶质的浓度为30MM。BUFFERA1含01MNACL和01M磷酸钠的水溶液，PH73。BUFFERA2含01MNACL、01M磷酸钠和005体积比TWEEN20的水溶液，PH73。0017所述“表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠”的制备方法包括如下步骤将。
14、384MGEDC溶于2MLPH70、01M的甲基咪唑缓冲液，然后加入065NMOL所述核酸适配体，充分混合，得到混合液；将步骤得到的混合液加入约20MG磁珠中，室温摇匀反应24小时，然后磁分离并收集磁珠，用2毫升预杂交缓冲液对磁珠表面未反应的羧基进行封闭，得到表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠。预杂交缓冲液溶剂为PH74、01M的TRIS缓冲液，含0005MEDTA、05体积比N月桂酰肌氨酸和1G/100MLBSA。0018所述功能磁珠的制备方法具体包括如下步骤取约20MG表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠，用2ML杂交缓冲液悬浮，在60水浴中温浴1H；取10L说明书CN1。
15、04178568A3/8页5含有连接有链霉亲和素和标记物的探针溶液，溶于2ML杂交缓冲液中，在60水浴中温浴1H；将步骤得到的磁珠悬浮液和步骤得到的溶液混合，室温摇匀反应25H，得到功能磁珠悬浮液。杂交缓冲液含10MMTRIS、120MMNACL、5MMKCL、20MMCACL2的水溶液，PH85。0019所述标记物具体可为荧光标记物，更具体可为CY55。所述与标记物相应的的激发波长具体可为650NM。0020所述步骤3具体是在全光纤倏逝波生物传感器中进行的。全光纤倏逝波生物传感器的操作规程如下打开激光器，激发波长为650NM；以PBS缓冲液冲洗表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片直至基线平。
16、稳；基线平稳后，取待测溶液，开启蠕动泵进样25S，之后停止蠕动泵，使待测溶液在反应池内反应120S；再次开启蠕动泵，通入洗脱液05G/100MLSDS水溶液,调PH至1990秒；最后通入PBS缓冲液，至基线平稳。0021所述磁珠具体可为羧基磁珠。0022所述固相芯片具体可为光纤。0023所述靶标物质为赭曲霉素A。0024所述核酸适配体具体如序列表的序列1所示。所述探针具体如序列表的序列2所示。0025本发明还保护一种检测待测样本中是否含有靶标物质的试剂盒，包括功能磁珠和表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片；所述功能磁珠是将A和B杂交得到的；所述A为表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠。
17、；所述B为连接有链霉亲和素和标记物的探针；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子。0026本发明还保护一种检测待测样本中是否含有靶标物质的试剂盒，包括“表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片”、“表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠”和“连接有链霉亲和素和标记物的探针”；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子。0027所述表面修饰有脱硫生物素的固相芯片的制备方法包括如下步骤0028取固相芯片，使其表面羟基化；0029完成步骤后，取固相芯片，使其表面修饰APTS；0030完成步骤后，取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素。0031“取固相芯片，使其表面羟基化”的方法具体如。
18、下将固相芯片浸入PIRAHA溶液98浓H2SO4H2O231，体积比并120反应1H；完成步骤后，取出固相芯片，用超纯水清洗直到PH值为中性，在室温下用氮气吹干，然后置于70真空干燥箱中保存1H。0032“取固相芯片，使其表面修饰APTS”的方法具体如下取固相芯片，置于APTS溶液中反应1H；完成步骤后，取出固相芯片，用无水甲苯冲洗，在室温下用氮气吹干，然后置于200烘烤1H。APTS溶液溶质为APTS，溶剂为无水甲苯，溶质的浓度为2体积比。0033“取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素”的方法具体如下取固相芯片，置于戊二醛溶液中室温反应1H，然后用乙醇冲洗，然后置于乙二胺溶液中室温反应15H，。
19、然后置于NABH4溶液中室温反应15MIN；取25MG脱硫生物素、50MGEDC和50MGNHS，用1000LDMF溶解，室温反应3H，然后加入200LPH87、1M的NAHCO3NA2CO3缓冲液并混匀，得到混说明书CN104178568A4/8页6合液；完成步骤后，取出固相芯片，加入步骤得到的混合液中，室温反应12小时；完成步骤后，取出固相芯片，用乙醇冲洗，然后置于含2MG/MLBSA的PBS缓冲液中，室温反应1H。戊二醛溶液溶质为戊二醛，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为25。乙二胺溶液溶质为乙二胺，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为10。NABH4溶液溶质为NABH4，溶剂为乙醇，溶质。
20、的浓度为10MG/ML。0034所述“连接有链霉亲和素和标记物的探针”的制备方法具体如下合成探针，在5末端进行巯基修饰，在3末端进行标记物修饰，命名为SHDNA标记物；在10L1MMSHDNA标记物中加入067LTCEP溶液，避光室温反应1H，以活化巯基；取AMICON3K，加入完成步骤后得到的整个反应体系，再加入200LBUFFERA1，然后12000RPM离心10MIN，用BUFFERA2洗涤AMICON3K，收集分子量大于3K的组分溶液形式；取133L20MG/ML链霉亲和素水溶液，加入033MGSULFOSMCC，漩涡震荡5MIN，然后室温反应1H，12000RPM离心5MIN，取上清。
21、液；取AMICON10K，加入步骤得到的上清液，再加入200LBUFFERA1，12000RPM离心10MIN，用BUFFERA2洗涤AMICON10K，收集分子量大于10K的组分溶液形式；将步骤得到的溶液加入步骤得到的溶液中，避光室温反应48H；取AMICON10K，加入完成步骤后得到的整个反应体系，再加入200LBUFFERA1，12000RPM离心10MIN，用BUFFERA2洗涤AMICON10K，收集分子量大于10K的组分溶液形式，即为含有连接有链霉亲和素和标记物的探针溶液。TCEP溶液溶质为TCEP，溶剂超纯水，溶质的浓度为30MM。BUFFERA1含01MNACL和01M磷酸钠的。
22、水溶液，PH73。BUFFERA2含01MNACL、01M磷酸钠和005体积比TWEEN20的水溶液，PH73。0035所述“表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠”的制备方法包括如下步骤将384MGEDC溶于2MLPH70、01M的甲基咪唑缓冲液，然后加入065NMOL所述核酸适配体，充分混合，得到混合液；将步骤得到的混合液加入约20MG磁珠中，室温摇匀反应24小时，然后磁分离并收集磁珠，用2毫升预杂交缓冲液对磁珠表面未反应的羧基进行封闭，得到表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠。预杂交缓冲液溶剂为PH74、01M的TRIS缓冲液，含0005MEDTA、05体积比N月桂酰肌氨酸。
23、和1G/100MLBSA。0036所述功能磁珠的制备方法具体包括如下步骤取约20MG表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠，用2ML杂交缓冲液悬浮，在60水浴中温浴1H；取10L含有连接有链霉亲和素和标记物的探针溶液，溶于2ML杂交缓冲液中，在60水浴中温浴1H；将步骤得到的磁珠悬浮液和步骤得到的溶液混合，室温摇匀反应25H，得到功能磁珠悬浮液。杂交缓冲液含10MMTRIS、120MMNACL、5MMKCL、20MMCACL2的水溶液，PH85。0037所述标记物具体可为荧光标记物，更具体可为CY55。所述与标记物相应的的激发波长具体可为650NM。0038所述磁珠具体可为羧基磁珠。00。
24、39所述固相芯片具体可为光纤。0040所述靶标物质为赭曲霉素A。0041所述核酸适配体具体如序列表的序列1所示。所述探针具体如序列表的序列2所示。说明书CN104178568A5/8页70042本发明的目的在于提出一种高稳定高重复使用的核酸适配体探针荧光传感分析方法。本发明的主要特征在于以核酸适配体为生物识别探针，固相传感，激光诱导荧光，高稳定重复使用次数。具体而言见图1将核酸适配体固定在磁珠表面，并且杂交上一段互补链，这段互补DNA链缀合了链霉亲和素和荧光标记物。同时，在固相芯片界面修饰脱硫生物素。当系统中存在目标污染物时，互补链被竞争下来，并且与在固相界面修饰的脱硫生物素结合，荧光物质被激。
25、发，获得的信号与系统中存在目标污染物成定量关系，从而达到检测的目的。本发明方法测定目标污染物浓度具有成本低廉、简单、快速的优点，并保持了适配体靶标分子广泛、特异性好且灵敏度高的优点，可稳定使用300次以上。附图说明0043图1为本发明提供的方法的原理示意图。0044图2为实施例1的步骤一的流程示意图。0045图3为实施例1的步骤二的流程示意图。0046图4为实施例1的步骤三的流程示意图。0047图5为实施例2的结果。0048图6为实施例3的结果。具体实施方式0049以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料。
26、，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为PH74、10MM的PBS缓冲液。脱硫生物素SIGMA，货号为D1411。链霉亲和素THERMO，货号为PROD21135。赭曲霉素APRIBOLAB，货号为IAC0403。APTS的全称为“3氨基丙基三乙氧基硅烷”。TCEP的中文全称为“三2羧乙基膦”，英文全称为“TRIS2CARBOXYETHYLPHOSPHINE”。SULFOSMCC的中文全称为“4N马来酰亚胺甲基环己烷1羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐”。0050DNA分子甲为特异性结合赭。
27、曲霉素A的核酸适配体，其核苷酸序列序列表的序列1为5NH2A6GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA3。DNA分子乙为与DNA分子甲部分互补的单链DNA分子，其核苷酸序列序列表的序列2为5AAAAAAAAAAAATGTCCGATGCTC3。0051用于本实施例的倏逝波检测仪器全光纤倏逝波生物传感器见专利ZL2006100894974CN1873450A。0052实施例1、试剂盒的制备0053一、表面修饰有脱硫生物素的光纤的制备0054流程示意图见图2。00551、取光纤，使其表面羟基化。0056具体方法1将光纤570/600/900,购于南京春辉科技实业有限公。
28、司浸入PIRAHA溶液98浓H2SO4H2O231，体积比并120反应1H；2完成步骤1后，取说明书CN104178568A6/8页8出光纤，用超纯水清洗直到PH值为中性，在室温下用氮气吹干，然后置于70真空干燥箱中保存1H。00572、完成步骤1后，取光纤，使其表面修饰APTS。0058具体方法1完成步骤1后，取光纤，置于APTS溶液中反应1H；2完成步骤1后，取出光纤，用无水甲苯冲洗，在室温下用氮气吹干，然后置于200烘烤1H。APTS溶液溶质为APTS，溶剂为无水甲苯，溶质的浓度为2体积比。00593、完成步骤2后，取光纤，使其表面修饰脱硫生物素。0060具体方法1完成步骤2后，取光纤，。
29、置于戊二醛溶液中室温反应1H，然后用乙醇冲洗，然后置于乙二胺溶液中室温反应15H，然后置于NABH4溶液中室温反应15MIN；2取25MG脱硫生物素、50MGEDC和50MGNHS，用1000LDMF溶解，室温反应3H混合旋转，然后加入200LPH87、1M的NAHCO3NA2CO3缓冲液并混匀，得到混合液；3完成步骤1后，取出光纤，加入步骤2得到的混合液中，室温反应12小时；4完成步骤3后，取出光纤，用乙醇冲洗，然后置于含2MG/MLBSA的PBS缓冲液中，室温反应1H。0061戊二醛溶液溶质为戊二醛，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为25。0062乙二胺溶液溶质为乙二胺，溶剂为乙醇，溶质的。
30、体积百分比浓度为10。0063NABH4溶液溶质为NABH4，溶剂为乙醇，溶质的浓度为10MG/ML。0064二、制备连接有链霉亲和素和荧光标记物的探针0065流程示意图见图3。00661、合成DNA分子乙，在5末端进行巯基修饰，在3末端进行CY55修饰，命名为SHDNACY55。00672、在10L1MMSHDNACY55中加入067LTCEP溶液，避光室温反应1H，以活化巯基。TCEP溶液溶质为TCEP，溶剂超纯水，溶质的浓度为30MM。00683、取AMICON3KAMICON，货号为UFC5003961，加入完成步骤2后得到的整个反应体系，再加入200LBUFFERA1，然后12000。
31、RPM离心10MIN，用BUFFERA2洗涤AMICON3K，收集分子量大于3K的组分溶液形式。0069BUFFERA1含01MNACL和01M磷酸钠的水溶液，PH73。0070BUFFERA2含01MNACL、01M磷酸钠和005体积比TWEEN20的水溶液，PH73。00714、取133L20MG/ML链霉亲和素水溶液，加入033MGSULFOSMCC，漩涡震荡5MIN，然后室温反应1H，12000RPM离心5MIN，取上清液。00725、取AMICON10KAMICON，货号为UFC5010961，加入步骤4得到的上清液，再加入200LBUFFERA1，12000RPM离心10MIN，用。
32、BUFFERA2洗涤AMICON10K，收集分子量大于10K的组分溶液形式。00736、将步骤5得到的溶液加入步骤3得到的溶液中，避光室温反应48H。00747、取AMICON10K，加入完成步骤6后得到的整个反应体系，再加入200LBUFFERA1，12000RPM离心10MIN，用BUFFERA2洗涤AMICON10K，收集分子量大于10K的组分溶液形式，命名为STVPROBECY55溶液。以链霉亲和素计，STVPROBECY55溶液的浓度为200MG/ML。0075三、制备表面修饰核酸适配体的磁珠说明书CN104178568A7/8页90076流程示意图见图4。00771、取1ML羧基磁。
33、珠BANGSLABORATORIESINC，BIOMAGBP618；悬浮液形式，磁珠浓度为203MG/ML，磁分离并弃去上清，用DEPC水洗涤磁珠23次每次清洗后均经磁分离弃去上清液。00782、将384MGEDC溶于2MLPH70、01M的甲基咪唑缓冲液，然后加入065NMOLDNA分子甲，充分混合，得到混合液。00793、将步骤2得到的混合液加入步骤1得到的磁珠中，室温摇匀反应24小时，然后磁分离并收集磁珠，用2毫升预杂交缓冲液对磁珠表面未反应的羧基进行封闭室温孵育4H，得到磁珠核酸适配体缀合物混合液。0080预杂交缓冲液溶剂为PH74、01M的TRIS缓冲液，含0005MEDTA、05体。
34、积比N月桂酰肌氨酸和1G/100MLBSA。0081四、磁珠核酸适配体缀合物与STVPROBECY55的杂交0082流程示意图见图4。00831、取2ML步骤三制备的磁珠核酸适配体缀合物混合液含约20MG磁珠，磁分离后弃去上清，用杂交缓冲液洗涤三次，然后用2ML杂交缓冲液悬浮，在60水浴中温浴1H。00842、取10L步骤二得到的STVPROBECY55溶液，溶于2ML杂交缓冲液中，在60水浴中温浴1H。00853、将步骤1得到的磁珠悬浮液和步骤2得到的溶液混合，室温摇匀反应25H，得到功能磁珠悬浮液。0086杂交缓冲液含10MMTRIS、120MMNACL、5MMKCL、20MMCACL2的。
35、水溶液，PH85。0087实施例2、检测赭曲霉素A0088采用DMF为溶剂，制备1MG/ML的赭曲霉素A储备液。00891、取实施例1的功能磁珠悬浮液含约20MG磁珠，用含2MG/MLBSA的PBS缓冲液清洗两遍，弃去上清液。00902、完成步骤1后，取磁珠，加入赭曲霉素A储备液，加入含2MG/MLBSA的PBS缓冲液，使反应体系的总体积为350L，混匀15MIN。赭曲霉素A储备液设置不同的加入量，使得反应体系的初始时刻赭曲霉素A的浓度为64NM、382NM、954NM、1587NM、2226NM、4453NM、6350NM、12696NM、31749NM或37100NM，每个浓度设置三个重复。
36、。00913、完成步骤2后，进行磁分离，收集上清液待测溶液。00924、全光纤倏逝波生物传感器的操作规程打开激发器，激发波长为650NM；以PBS缓冲液冲洗实施例1的步骤一制备的光纤直至基线平稳；基线平稳后，取步骤3得到的待测溶液，开启蠕动泵进样25S，之后停止蠕动泵，使待测溶液在反应池内反应120S；再次开启蠕动泵，通入洗脱液05G/100MLSDS水溶液,调PH至1990秒；最后通入PBS缓冲液，至基线平稳。0093在一个待测溶液的检测完成后，利用洗脱液和PH74、01M的PBS缓冲液交替冲洗实施例1的步骤一制备的光纤，使STVPROBECY55从实施例1的步骤一制备的光纤上脱落下来，然后。
37、进行下一个待测溶液的检测，通过这种检测方法能够将传统的DNA结合洗脱过程转化成蛋白质的洗脱过程，从而达到很高的稳定重复应用次数。0094结果见图5，对赭曲霉素A的检出限为12NM49NG/ML，线性范围为12NM32M。说明书CN104178568A8/8页100095实施例3、实施例1的步骤一制备的光纤的可重复利用次数0096采用DMF为溶剂，制备1MG/ML的赭曲霉素A储备液。00971、取实施例1的功能磁珠悬浮液含约20MG磁珠，用含2MG/MLBSA的PBS缓冲液清洗两遍，弃去上清液。00982、完成步骤1后，取磁珠，加入赭曲霉素A储备液，加入含2MG/MLBSA的PBS缓冲液，使反应。
38、体系的总体积为350L反应体系的初始时刻赭曲霉素A的浓度为3M，混匀15MIN。00993、完成步骤2后，进行磁分离，收集上清液待测溶液。01004、全光纤倏逝波生物传感器的操作规程打开激光器，激发波长为650NM；以PBS缓冲液冲洗实施例1的步骤一制备的光纤直至基线平稳；基线平稳后，取步骤3得到的待测溶液，开启蠕动泵进样25S，之后停止蠕动泵，使待测溶液在反应池内反应120S；再次开启蠕动泵，通入洗脱液05G/100MLSDS水溶液,调PH至1990秒；最后通入PBS缓冲液，至基线平稳。0101重复对步骤3得到的待测溶液进行检测。在一个待测溶液的检测完成后，利用洗脱液和PH74、01M的PBS缓冲液交替冲洗实施例1的步骤一制备的光纤，使STVPROBECY55从实施例1的步骤一制备的光纤上脱落下来，然后进行下一个待测溶液的检测，通过这种检测方法能够将传统的DNA结合洗脱过程转化成蛋白质的洗脱过程，从而达到很高的稳定重复应用次数。0102结果见图6。本发明中涉及的光纤可重复使用至少300次。说明书CN104178568A101/1页110001序列表CN104178568A111/3页12图1说明书附图CN104178568A122/3页13图2图3图4说明书附图CN104178568A133/3页14图5图6说明书附图CN104178568A14。