用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂及使用方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103424400 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103424400 A *CN103424400A* (21)申请号 201310313768.X (22)申请日 2013.07.24 G01N 21/76(2006.01) (71)申请人 汪弋 地址 201203 上海市浦东新区张江蔡伦路 720 号 1 号楼 219 室 (72)发明人 汪弋 (74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 31211 代理人 高月红 (54) 发明名称 用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂及使用方法 和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种用于凝胶电泳蛋白质。

2、显色 的试剂及使用方法和应用， 该试剂包括 ： 第一组 分， 是将带异硫氰酸基团的化合物溶解于保护异 硫氰酸基团的溶剂中所形成的溶液 ； 第二组分， 是不含伯氨基的碱性上样缓冲液 ； 使用方法包 括 ： 将第一组分与第二组分混合形成处理液 , 处 理液与待测蛋白质样品混合， 或将第二组分与待 测蛋白质样品混合后再加入第一组分， 加热， 形成 有色蛋白质样品液。本发明的试剂可用于凝胶电 泳中。本发明的试剂具有简单易用、 效果可靠、 试 剂使用量少且易于生产加工、 可实时观察、 适用范 围广阔、 没有污染、 省时省力， 可用于凝胶电泳蛋 白质的预先显色等优势， 而且蛋白质电泳图谱没 有发生可以观察。

3、到得变化。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103424400 A CN 103424400 A *CN103424400A* 1/2 页 2 1. 一种用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂， 其特征在于， 其组分包括 ： 第一组分和第二 组分 ； 其中， 第一组分是将带异硫氰酸基团的化合物溶解于保护异硫氰酸基团的溶剂中所形 成的溶液 ； 第二组分是不含伯氨基的碱性上样缓冲液。 2. 如权利要求 1 所述的试剂， 其特征在于 ： 所述带异。

4、硫氰酸基团的化合物， 包括 ： 异硫 氰酸荧光素和四甲基异硫氰酸罗丹明 ； 所述保护异硫氰酸基团的溶剂， 包括 ： N,N- 二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。 3. 如 权 利要求 1 所述的试剂， 其特征在于 ： 所述第一组分的浓度为 0.08 0.12g/100mL ； 所述第二组分， 为 pH8 10 的不含伯氨基的碱性上样缓冲液。 4. 如权利要求 3 所述的试剂， 其特征在于 ： 所述第一组分的浓度为 0.1g/100mL ； 所述第二组分为 pH8 10 的缓冲体系浓度在 100mM 以上的不含伯氨基的碱性上样缓 冲液。 5.如权利要求4所述的试剂， 其特征在于 ： 所述第二组分包括 ：。

5、 pH810的硼酸-氢氧 化钠缓冲液或 pH7.5 8.5 的磷酸盐缓冲液 ； 其中， pH8 10 的硼酸 - 氢氧化钠缓冲液的配方如下 ： 将20ml1M pH810硼酸-氢氧化钠缓冲液、 2ml-巯基乙醇、 4g SDS、 0.1g EDTA、 20ml 甘油混匀， 并定容至 100ml ； 或将 20ml1M pH8 10 硼酸 - 氢氧化钠缓冲液、 2g 二硫苏糖醇、 4g SDS、 0.1g EDTA、 20ml 甘油混匀， 并定容至 100ml ； pH7.5 8.5 的磷酸盐缓冲液的配方如下 ： 将 20ml1M pH7.5 8.5 磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液、 2ml-。

6、 巯基乙醇、 4g SDS、 0.1gEDTA、 20ml 甘油混匀， 用 3M 氢氧化钠溶液将 pH 调回 7.5 8.5， 并定容至 100ml ； 或将 20ml1M pH7.5 8.5 磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液、 2g 二硫苏糖醇、 4g SDS、 0.1g EDTA、 20ml 甘油混匀， 用 3M 氢氧化钠溶液将 pH 调回 7.5 8.5， 并定容至 100ml。 6. 一种如权利要求 1 所述的试剂在凝胶电泳蛋白质显色中的使用方法， 其特征在于， 包括 ： I、 方法 A， 其步骤包括 ： （1） 将第一组分与第二组分按比例进行混合， 形成处理液 ； （2） 将步骤 （。

7、1） 形成的处理液与待测蛋白质样品按比例进行混合后， 70 100加热， 形成有色蛋白质样品液， 实现对蛋白质的显色 ； 或 II、 方法 B， 其步骤包括 ： 将第二组分与待测蛋白质样品按比例进行混合后， 再加入第一组分， 70 100加热， 形成有色蛋白质样品液， 从而实现对蛋白质的显色。 7. 如权利要求 6 所述的使用方法， 其特征在于 ： 所述方法 A 或方法 B 中， 第一组分中含 异硫氰酸荧光素时， 第一组分与第二组分以体积比为 0.5 1:1 的比例进行混合 ； 第一组 分中含四甲基异硫氰酸罗丹明时， 第一组分与第二组分以体积比为35:50的比例进行混 合 ； 方法 A 的步骤。

8、 （2） 中， 处理液与待测蛋白质样品以体积比为 530 1000 ： 500 的比例进 权 利 要 求 书 CN 103424400 A 2 2/2 页 3 行混合 ； 方法 B 中， 第二组分与待测蛋白质样品以体积比为 1 ： 1 的比例进行混合 ； 方法 A 或方法 B 中， 加热的时间为 3 10 分钟。 8. 如权利要求 7 所述的使用方法， 其特征在于 ： 所述第一组分中含四甲基异硫氰酸罗 丹明时， 在 1ml pH8 10 硼酸 - 氢氧化钠缓冲液中加入 60l0.1g/100mL 四甲基异硫氰酸 罗丹明的二甲亚砜溶液 ； 第一组分中含异硫氰酸荧光素时， 在1ml pH7.58.。

9、5磷酸盐缓冲 液中加入 1ml0.1g/100mL 异硫氰酸荧光素的 N,N- 二甲基甲酰胺溶液。 9. 一种如权利要求 1 所述的试剂的应用， 其特征在于 ： 所述用于凝胶电泳蛋白质显色 的试剂在凝胶电泳中的应用， 其步骤包括 ： 将如权利要求 6 所述的有色蛋白质样品液直接加入至凝胶加样孔中， 连通电源， 进 行电泳 ； 电泳完成后， 取出凝胶， 直接用肉眼观察蛋白质电泳条带的电泳结果， 或将凝胶放入 凝胶成像仪中进行观察。 10. 如权利要求 9 所述的应用， 其特征在于 ： 所述步骤中， 取出的凝胶还进行传统的 蛋白质凝胶染色法或取出的凝胶还用于后续的免疫印迹杂交 ； 其中， 传统的蛋。

10、白质凝胶染色法包括 ： 考马斯亮蓝染色法。 权 利 要 求 书 CN 103424400 A 3 1/6 页 4 用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂及使用方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种蛋白质显色试剂及方法， 特别是涉及一种用于凝胶电泳蛋白质显 色的试剂及使用方法和应用。 背景技术 0002 蛋白质的凝胶电泳是生命科学研究中最常用的实验方法之一。 在蛋白质的凝胶电 泳实验中， 必须使用染色剂使蛋白质染上醒目的颜色， 便于观察结果。现在常用的染色方 法如考马斯亮蓝染色法、 银染法等， 需要在蛋白质的凝胶电泳结束之后对凝胶进行固定、 染 色、 脱色等繁琐处理才能观察， 耗时长， 不可能快速。

11、知晓实验结果， 也不便于在实验过程中 观察结果。且固定、 染色、 脱色需要大量试剂 （尤其是有机溶剂） 浸泡凝胶， 使用量很大， 增加 了对环境的污染。对于以上情况， 现有的改进方法有 ： 1) 使用微波炉加热以加快反应速度 ； 2)调整染色液配方以提高染色效率等。 但是以上的方法都没有从本质上改变凝胶电泳实验 中蛋白质染色步骤繁琐、 污染严重等问题， 而且染色仍然必须在电泳结束后才能进行。 0003 故而， 需要一种同时具备可靠性、 可推广性、 快速简便、 无污染性的凝胶电泳蛋白 质显色方法。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂及使用方 法和应用。

12、。 本发明中的采用该试剂的显色方法有别于传统凝胶电泳中蛋白质染色方式的蛋 白质显色方法， 而且本发明的显色方法弥补了几种传统染色方式的不足， 而且在电泳环境 下很稳定。 0005 为解决上述技术问题， 本发明的用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂 （快速显色剂） ， 其组分包括 ： 第一组分和第二组分 ； 0006 其中， 第一组分是将带异硫氰酸基团 （NCS） 的化合物溶解于保护异硫氰酸基团 （NCS） 的溶剂中所形成的溶液， 即带异硫氰酸基团 （NCS） 的化合物溶液 ； 0007 第二组分是不含伯氨基 （NH2基团） 的碱性上样缓冲液。 0008 所述带异硫氰酸基团 （NCS） 的化合物， 是带。

13、异硫氰酸基团 （NCS） 的色素或者 荧光素， 包括 ： 异硫氰酸荧光素 （FITC） 和四甲基异硫氰酸罗丹明 （Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate， TRITC） 等。 0009 所述保护异硫氰酸基团 （NCS） 的溶剂， 包括 ： N,N- 二甲基甲酰胺 （DMF） 和二甲基 亚砜 （DMSO） 等。 0010 所述第一组分的浓度推荐为 0.08 0.12g/100mL（如 0.1g/100mL） 或者饱和浓度 以下的其他浓度， 视色素或荧光素的种类不同而不同。 0011 所述第二组分， 可采用常规的不含伯氨基 （NH2基团） 的碱性缓冲液即可， 如可 。

14、采用 pH8 10 的不含伯氨基 （NH2基团） 的碱性上样缓冲液 （缓冲体系浓度优选为 100mM 以上） ， 如包括 ： pH8 10 的硼酸 - 氢氧化钠缓冲液 （缓冲体系浓度优选为 100mM 以上） 或 说 明 书 CN 103424400 A 4 2/6 页 5 pH7.5 8.5 的磷酸盐缓冲液 （缓冲体系浓度优选为 100mM 以上） 及其他缓冲液。 0012 其中， pH8 10 的硼酸 - 氢氧化钠缓冲液的配方 （100ml） 如下 ： 0013 将 20ml1M pH8 10 硼酸 - 氢氧化钠缓冲液 （即 Na2B4O7-NaOH） 、 2ml- 巯基乙醇、 4g SD。

15、S（十二烷基磺酸钠） 、 0.1g EDTA（乙二胺四乙酸） 、 20ml 甘油混匀， 并定容至 100ml 或 将 20ml1M pH8 10 硼酸 - 氢氧化钠缓冲液、 2g 二硫苏糖醇、 4g SDS、 0.1g EDTA、 20ml 甘油 混匀， 并定容至 100ml。 0014 pH7.5 8.5 的磷酸盐缓冲液的配方 （100ml） 如下 ： 0015 将 20ml1M pH7.5 8.5 磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液、 2ml- 巯基乙醇、 4g SDS、 0.1gEDTA（乙二胺四乙酸） 、 20ml 甘油混匀， 用 3M 氢氧化钠溶液将 pH 调回 7.5 8.5， 并定。

16、容至100ml或将20ml1M pH810磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、 2g二硫苏糖醇、 4g SDS、 0.1g EDTA、 20ml甘油混匀， 用3M氢氧化钠溶液将pH调回7.58.5， 并定容至100ml。 0016 另外， 本发明还公开了用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂 （快速显色剂） 在凝胶电泳 蛋白质显色中的使用方法， 包括 ： 0017 I、 方法 A， 其步骤包括 ： 0018 （1） 将第一组分与第二组分按比例进行混合， 形成处理液 ； 0019 其中， 不同的带异硫氰酸基团的化合物 （即带异硫氰酸基团的色素或荧光素） 所需 要的混合比例不同， 如可根据待测蛋白样品浓度进行调整。

17、， 以蛋白摩尔数略低于所加含有 异硫氰酸基团 （NCS） 的色素或荧光素为最宜， 也可以自行摸索 ； 0020 （2） 将步骤 （1） 形成的处理液与待测蛋白质样品按比例进行混合后， 70 100加 热， 形成有色蛋白质样品液， 从而实现对蛋白质的显色。本步骤中， 由于在上样缓冲液中反 应， 所以显色与蛋白质电泳前样品处理同步完成 ； 0021 或 II、 方法 B， 其步骤包括 ： 0022 将第二组分与待测蛋白质样品按比例进行混合后， 再加入第一组分， 70 100 加热， 形成有色蛋白质样品液， 从而实现对蛋白质的显色。 0023 所述方法 A 或方法 B 中， 第一组分中含异硫氰酸荧光。

18、素 （FITC）时， 第一组分与 第二组分以体积比为 0.5 1:1 的比例进行混合 ； 第一组分中含四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC） 时， 第一组分与第二组分以体积比为 3 5:50 的比例进行混合 ； 0024 优选地， 第一组分中含四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC）时， 在 1ml pH8 10 硼 酸 - 氢氧化钠缓冲液中加入 60l TRITC 的 DMSO（二甲亚砜） 溶液 （TRITC 的浓度优选为 0.1g/100mL） ； 第一组分中含异硫氰酸荧光素 （FITC） 时， 在 1ml pH7.5 8.5 磷酸盐缓冲液 中加入 1ml FITC 的 DMF 溶液 （FITC。

19、 的浓度优选为 0.1g/100mL） 。 0025 所述方法 A 的步骤 （2） 中， 优选地， 处理液与待测蛋白质样品以体积比为 530 1000 ： 500 的比例进行混合。 0026 所述方法B中， 优选地， 第二组分与待测蛋白质样品以体积比为1 ： 1的比例进行混 合。其中， 本发明中， 待测蛋白质样品的浓度可根据需要进行适当调整， 如可处理的最大蛋 白浓度理论上的物质量浓度大约是 0.06mM， 实测的质量浓度大约是 15mg/ml。当蛋白样品 浓度大于最高检测浓度后， 荧光亮度差异仍然能体现出不同条带间的浓度差异， 但是荧光 在不同泳道间显示的浓度差异会减弱。 0027 所述方法。

20、 A 或方法 B 中， 加热的时间可为 3 10 分钟， 但如果最终混合液体积较 说 明 书 CN 103424400 A 5 3/6 页 6 大或者混合液中蛋白浓度较高， 可以适量增加 70 100加热时间。 0028 再者， 本发明还公开了用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂 （快速显色剂） 的应用， 即 用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂在凝胶电泳中的应用， 其步骤包括 ： 0029 将上述步骤 （2） 形成的有色蛋白质样品液直接加入至凝胶加样孔中， 连通电源， 进行电泳 ； 0030 本步骤中， 与蛋白结合的色素或荧光素不会在电泳过程中脱落 ； 0031 电泳完成后， 取出凝胶， 直接用肉眼观察蛋白。

21、质电泳条带的电泳结果 （如凝胶上 具有荧光色的蛋白质电泳条带） ， 或将凝胶放入凝胶成像仪中进行观察。 0032 所述步骤中， 取出的凝胶还可进行传统的蛋白质凝胶染色法， 其中， 传统的蛋白 质凝胶染色法包括 ： 考马斯亮蓝染色法 ； 如考马斯亮蓝染色法等进行进一步染色， 即直接 将上述凝胶在电泳结束后进行传统考马斯亮蓝染色， 而且染色效果与未使用本显色方法的 样品完全相同。 0033 另外， 所述步骤中， 取出的凝胶还可用于后续的免疫印迹杂交等实验。 0034 本发明中， 采用化学方法， 使异硫氰酸基团 （NCS） 在碱性条件下和蛋白质上的伯 胺基团反应形成硫脲键， 使含有异硫氰酸基团 （N。

22、CS） 的色素或者荧光素与蛋白质共价结 合， 形成稳定的结合物质， 从而使色素或者荧光素连接到蛋白上， 实现对蛋白质的染色 （参 照图 1、 图 2） 。另外， 本发明染色的亮度与蛋白质物质的量成正比。 0035 使用本发明染色的蛋白质， 染色过程简单， 染色时间短且与样品制备同步进行， 在 凝胶电泳过程中色素或荧光素不会脱落， 可以直接在自然光下观察， 也可以在凝胶成像仪 的暗箱中使用紫外光源观察。其中， 在蛋白质的凝胶电泳过程中， 可以透过电泳槽和玻璃 板直接观察电泳状况， 如可以观察到结合至蛋白质上的带异硫氰酸基团 （NCS） 的色素或 者荧光素的颜色或者荧光呈蛋白质电泳条带状 （如绿色。

23、荧光色的蛋白质电泳条带的泳动过 程） ， 将电泳槽放置于单光源暗室中条带更明显。电泳结束后也可以立即观察并且不影响凝 胶电泳结束后， 还可进一步使用传统染色 （如考马斯亮蓝染色） 对蛋白质染色。 0036 本发明中， 由于采用用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂进行蛋白质显色， 完全免去 传统染色方法中的固定、 染色 - 脱色的繁琐过程。本发明的试剂具有简单易用、 效果可靠、 试剂使用量少且易于生产加工、 可实时观察、 适用范围广阔、 没有污染、 省时省力， 可用于凝 胶电泳蛋白质的预先显色等优势， 而且蛋白质电泳图谱没有发生可以观察到得变化。 附图说明 0037 下面结合附图与具体实施方式对本发明作。

24、进一步详细的说明 ： 0038 图 1 是为使用本发明快速染色反应过程的化学式 ： FITC 在碱性条件下， 其异硫氰 酸基团 （NCS） 和蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键。 0039 图 2 是为使用本发明快速染色反应过程的化学式 ： TRITC 在碱性条件下， 其异硫氰 酸基团 （NCS） 和蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键。 0040 图 3 是使用本发明快速染色并进行电泳的蛋白质凝胶电泳完成后的该凝胶上的 蛋白质电泳条带图。其中， 泳道 2、 3、 4 为对于同一蛋白质样品使用本发明中 TRITC 显色的 泳道 ； 泳道 1 作为对照， 是未使用本发明中 TRITC 显色的泳道。该图。

25、为电泳后使用凝胶成像 仪在紫外光源下实拍的照片， 荧光亮度与蛋白质物质的量成正比。 说 明 书 CN 103424400 A 6 4/6 页 7 0041 图 4 是使用本发明快速染色后进一步用传统染色法染色的蛋白质凝胶的蛋白质 电泳条带图 （即对凝胶进一步用传统染色法染后使用凝胶成像仪在透射白光光源下实拍的 照片） 。其中， 泳道 2、 3、 4 为对于同一蛋白质样品使用本发明中 TRITC 显色的泳道 ； 泳道 1 作为对照， 是未使用本发明中 FITC 显色的泳道。统一浓度使用传统凝胶考马斯亮蓝染色法 再次染色、 脱色， 染色深度与蛋白质质量成正比。 0042 图 5 是使用本发明快速染。

26、色并进行电泳的蛋白质凝胶电泳完成后的该凝胶上的 蛋白质电泳条带图。其中， 泳道 2、 3、 4、 5 为对于同一蛋白质样品使用本发明中 FITC 显色的 泳道 ； 泳道 1 作为对照， 是未使用本发明中 FITC 显色的泳道。荧光亮度与蛋白质物质的量 成正比。该图为电泳后使用凝胶成像仪在透射紫外光源下实拍的照片。 0043 图 6 是使用本发明快速染色后进一步用传统染色法染色的蛋白质凝胶的蛋白质 电泳条带图 （即对凝胶进一步用传统染色法染后使用凝胶成像仪在透射白光光源下实拍的 照片） 。其中， 泳道 2、 3、 4、 5 为对于同一蛋白质样品使用本发明中 FITC 显色的泳道 ； 泳道 1 作。

27、为对照， 是未使用本发明中 FITC 显色的泳道。统一浓度使用传统凝胶考马斯亮蓝染色法 再次染色、 脱色， 染色深度与蛋白质质量成正比。 具体实施方式 0044 以下采用的试剂如未特别说明， 均为商业化产品。 0045 实施例 1 0046 ( 一 ) 溶液配方 0047 1、 溶液 A（不含伯氨基的碱性上样缓冲液， 即 pH9.0 的硼酸 - 氢氧化钠缓冲液） ： 0048 20ml1M 硼酸 - 氢氧化钠缓冲液 （即 Na2B4O7-NaOH） pH9.5 0049 4g SDS 0050 2g DTT（二硫苏糖醇） 0051 0.1g EDTA（乙二胺四乙酸） 0052 20ml 甘油 。

28、0053 加单蒸水定容至 100ml， 最终 pH9.0。 0054 2、 溶液 B（TRITC 溶液） ： 0055 将 TRITC 溶解于 DMSO（二甲亚砜） 中， 配制成浓度为 1mg/ml 的溶液。 0056 3、 考马斯亮蓝染色液 （对照用） ： 0057 670ml 单蒸水 0058 250ml 乙醇 0059 1.25g 考马斯亮蓝 G-250 0060 搅拌溶解后， 加冰醋酸 80ml。 0061 4、 脱色液 （对照用） 0062 670ml 单蒸水 0063 250ml 乙醇 0064 80ml 冰醋酸 0065 （二） 反应方法 0066 将溶液 A 与待电泳检测的蛋白。

29、质样品以体积比为 1 ： 1 进行混合， 每毫升混合液加 说 明 书 CN 103424400 A 7 5/6 页 8 入 30l 溶液 B， 70 100金属浴加热 10min 后， 在 SDS-PAGE 凝胶中上样进行电泳。其 中， TRITC 预染的蛋白质样品的平均每条带大约 0.2 微克， 上样时总蛋白浓度大约 0.12mg/ ml。另外， 电泳的电压、 电流、 温度、 时间、 pH 可根据待电泳检测的蛋白质本身的需求进行确 定。 0067 电泳结束后， 直接将凝胶放置在凝胶成像仪的暗箱中， 使用透射紫外光源观察电 泳结果， 可以观察到红色荧光的蛋白条带 （如图3所示） ， 并且荧光亮。

30、度与蛋白质物质的量成 正比。 0068 另外， 取出上述电泳结束后的 SDS-PAGE 凝胶， 用传统的蛋白质凝胶染色法 （即考 马斯亮蓝染色法） ， 进行进一步染色， 再进行电泳。具体步骤为 ： 将电泳后的 SDS-PAGE 凝胶 放入盛有100ml考马斯亮蓝染色液的容器中， 用微波炉中火加热5分钟后， 在摇床上反应10 分钟 ； 倒去考马斯亮蓝染色液， 用蒸馏水漂洗凝胶和容器后， 加入脱色液， 用微波炉中火加 热 5 分钟后， 在摇床上反应 15 分钟 ； 倒去脱色液， 用蒸馏水漂洗凝胶和容器后， 再次加入脱 色液， 用微波炉中火加热 5 分钟后， 在摇床上反应 15 分钟 ； 倒去脱色液。

31、， 用蒸馏水漂洗凝胶 和容器后， 将凝胶放置在凝胶成像仪的暗箱中， 使用透射白光光源观察电泳结果， 可以观察 到蓝紫色的蛋白条带 （图 4 所示） ， 染色深度与蛋白质质量成正比。 0069 比较图 3 与图 4 可以发现 ： 使用本发明的用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂对蛋白 本身的电泳结果没有任何影响， 其显示的结果与不使用用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂而 使用考马斯亮蓝染色所显示的电泳结果没有差别， 且使用用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂 显色后， 还能够正常地继续使用考马斯亮蓝染色。 0070 实施例 2 0071 ( 一 ) 溶液配方 0072 1、 溶液 A（不含伯氨基的碱性上样缓冲液， 即。

32、 pH8 的磷酸盐缓冲液） ： 0073 20ml1M 磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液 （NaH2PO4-Na2HPO4） pH8.0 0074 4g SDS 0075 2ml 巯基乙醇 0076 0.1g EDTA 0077 20ml 甘油 0078 用 3M 氢氧化钠溶液将 pH 调回 8。 0079 加单蒸水定容至 100ml。 0080 2、 溶液 B（FITC 溶液） ： 0081 将 FITC 溶解于 DMF（N,N- 二甲基甲酰胺） 中， 配制成浓度为 1mg/ml 的溶液。 0082 3、 考马斯亮蓝染色液 （对照用） ： 0083 670ml 单蒸水 0084 250ml 。

33、乙醇 0085 1.25g 考马斯亮蓝 G-250 0086 搅拌溶解后加冰醋酸 80ml。 0087 4、 脱色液 （对照用） 0088 670ml 单蒸水 0089 250ml 乙醇 说 明 书 CN 103424400 A 8 6/6 页 9 0090 80ml 冰醋酸 0091 （二） 反应方法 ： 0092 将溶液 A 与待电泳检测的蛋白质样品以体积比为 1 ： 1 进行混合， 每毫升混合液加 入500l溶液B， 70100金属浴加热10min后， 在SDS-PAGE凝胶中上样进行电泳。 其中， FITC 预染样品的蛋白质样品的平均每条带大约 0.5 微克， 上样时总蛋白浓度大约 0。

34、.6mg/ ml。另外， 电泳的电压、 电流、 温度、 时间、 pH 可根据待电泳检测的蛋白质本身的需求进行确 定。 0093 电泳结束后直接将凝胶放置在凝胶成像仪中的暗箱中， 使用透射紫外光源观察结 果， 可看到有绿色荧光的蛋白条带 （图 5 所示） ， 并且荧光亮度与蛋白质物质的量成正比。 0094 另外， 取出上述电泳结束后的 SDS-PAGE 凝胶， 用传统的蛋白质凝胶染色法 （即考 马斯亮蓝染色法） ， 进行进一步染色， 再进行电泳。具体步骤为 ： 将电泳后的 SDS-PAGE 凝胶 放入盛有100ml考马斯亮蓝染色液的容器中， 用微波炉中火加热5分钟后， 在摇床上反应10 分钟 ；。

35、 倒去考马斯亮蓝染色液， 用蒸馏水漂洗凝胶和容器后， 加入脱色液， 用微波炉中火加 热 5 分钟后， 在摇床上反应 15 分钟 ； 倒去脱色液， 用蒸馏水漂洗凝胶和容器后， 再次加入脱 色液， 用微波炉中火加热 5 分钟后， 在摇床上反应 15 分钟 ； 倒去脱色液， 用蒸馏水漂洗凝胶 和容器后， 将凝胶放置在凝胶成像仪的暗箱中， 使用透射白光光源观察电泳结果， 可以观察 到蓝紫色的蛋白条带 （图 6 所示） ， 染色深度与蛋白质质量成正比。 0095 比较图 5 与图 6 可以发现 ： 使用本发明的用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂对蛋白 本身的电泳结果没有任何影响， 其显示的结果与不使用用于凝胶。

36、电泳蛋白质显色的试剂而 使用考马斯亮蓝染色所显示的电泳结果没有差别， 且使用用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂 显色后， 还能够正常地继续使用考马斯亮蓝染色。 0096 本发明中， 带异硫氰酸基团的荧光素 （FITC 或 TRITC 等） 或色素是在荧光素或色 素的基础上通过化学反应增加异硫氰酸基团 （NCS） 得到的， 在碱性环境下， 异硫氰酸基团 （NCS） 可以和蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键， 从而实现对蛋白质的染色。由于这 种荧光标记在电泳环境下很稳定， 所以可以在凝胶电泳前对蛋白质样品进行预染色， 而未 反应的荧光分子在电泳过程中能与溴酚蓝同速度甚至更快跑到凝胶底部或者胶外， 因此， 凝胶背景透明无色， 凝胶中的蛋白条带可以直接在紫外灯下观察， 免去了染色 - 脱色的繁 琐步骤， 同时， 也能在电泳过程中实时观察到蛋白质条带。 说 明 书 CN 103424400 A 9 1/3 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103424400 A 10 2/3 页 11 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103424400 A 11 3/3 页 12 图 6 说 明 书 附 图 CN 103424400 A 12 。