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1、(10)申请公布号 CN 103424449 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103424449 A *CN103424449A* (21)申请号 201310329165.9 (22)申请日 2013.07.30 G01N 27/327(2006.01) G01N 27/26(2006.01) (71)申请人 浙江理工大学 地址 310018 浙江省杭州市下沙高教园区 2 号大街 5 号 (72)发明人 刘吉洋 晏菲 叶志凯 唐嫣婷 奚凤娜 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 (54) 发明名称 二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米管。
2、 - 酶复合膜修 饰三维石墨烯复合材料及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳 米管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯复合材料及其制 备方法， 包括如下步骤 ： 将二茂铁接枝壳聚糖， 碳 纳米管和酶溶解于醋酸缓冲液中， 以三维石墨烯 为阴极， 进行电沉积将二茂铁接枝壳聚糖， 碳纳米 管和酶形成的复合膜沉积在三维石墨烯表面， 即 得。本发明的复合材料可将三维石墨烯作为无支 载的基础电极， 以二茂铁作为电化学活性组分， 构 筑基于三维石墨烯的酶生物传感器， 成功克服了 传统的酶生物传感器需要添加溶液相电子转移介 体或小分子媒介体易从电极表面流失的缺点。 (51)Int.C。
3、l. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103424449 A CN 103424449 A *CN103424449A* 1/1 页 2 1. 一种二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯复合材料的制备方 法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 将二茂铁接枝壳聚糖， 碳纳米管和酶溶解于醋酸缓冲液中， 将三维石墨烯为作为阴极， 进行电沉积， 二茂铁接枝壳聚糖、 碳纳米管和酶形成复合膜并沉积在三维石墨烯表面， 即得 二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳。
4、米管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯复合材料。 2. 根据权利要求 1 所述制备方法， 其特征在于， 所述电沉积为 ： 将二茂铁接枝壳聚糖溶于醋酸缓冲液， 再加入碳纳米管， 超声分散， 最后加入酶， 再次 超声分散后将三维石墨烯作为阴极， -1.0 -3.0V 条件下电沉积 1.0-20min。 3. 根据权利要求 2 所述制备方法， 其特征在于， 所述二茂铁接枝壳聚糖、 碳纳米管和酶 的质量比为 0.1-10 ： 0.02-2 ： 0.01-10， 所述二茂铁接枝壳聚糖溶于醋酸缓冲液后的浓度为 0.1-10mg/mL。 4. 根 据 权 利 要 求 2 所 述 制 备 方 法， 其 特 征 在 。
5、于， 所 述 醋 酸 缓 冲 液 的 浓 度 为 0.02-0.2mol/L， pH 值为 4.8 5.2。 5. 根据权利要求 1 所述制备方法， 其特征在于， 所述二茂铁接枝壳聚糖由如下方法制 备 ： （1） 将二茂铁甲醛溶于甲醇溶液中， 得到浓度为 0.1-5mg/mL 的二茂铁甲醛溶液 ； 将壳 聚糖溶于浓度为 0.5-5.0% 的乙酸或盐酸溶液中， 得到质量百分数为 0.1-4% 的壳聚糖溶 液 ； （2） 将所述壳聚糖溶液加入二茂铁甲醛溶液中， 搅拌反应 1.5 2.5h， 然后加入硼氢化 钠， 继续搅拌反应2028h后加入氢氧化钠溶液至黄色沉淀完全， 将所得黄色沉淀洗涤、 干 燥。
6、后得所述二茂铁接枝壳聚糖。 6. 根据权利要求 5 所述制备方法， 其特征在于， 所述硼氢化钠与二茂铁甲醛的质量比 为 2:1 5:1。 7. 根据权利要求 5 所述制备方法， 其特征在于， 所述氢氧化钠溶液的质量百分浓度为 0.1%-10%。 8. 根据权利要求 1 所述制备方法， 其特征在于， 所述酶为葡萄糖氧化酶、 过氧化物酶、 乳酸氧化酶、 胆固醇氧化酶、 酪胺酸氧化酶、 醇氧化酶、 醇脱氢酶、 漆酶、 胆碱脂酶、 胆碱氧化 酶、 胆红素氧化酶、 脂肪酶和多酚氧化酶中的至少一种。 9. 根据权利要求 1 所述制备方法， 其特征在于， 所述碳纳米管为单壁碳纳米管或多壁 碳纳米管。 10.。
7、 一种如权利要求 1 9 任一所述制备方法制备得得到的二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳 米管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯复合材料。 权 利 要 求 书 CN 103424449 A 2 1/7 页 3 二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯 复合材料及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于复合材料技术领域， 尤其涉及一种电沉积二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米 管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯材料的制备方法及由该方法得到的复合材料。 背景技术 0002 石墨烯 (graphene) 是一种新型碳材料， 它具有由单层碳原子紧密堆积而成的二 维蜂窝状晶体结构。 石墨烯因其独特的物理与化学。
8、性质， 目前已引起研究者们的广泛关注。 除二维石墨烯材料外， 2004 年科学家采用兼具平面和曲面结构特点的泡沫金属作为生长基 体， 利用 CVD 方法制备出具有三维连通网络结构的泡沫状石墨烯体材料。该法制得的三维 石墨烯材料以无缝连接的方式构成一个全连通的整体， 具有优异的电荷传导能力、 巨大的 比表面积、 孔隙率和极低密度， 在超电容、 氢储存材料、 二次电池和新型催化等领域具有潜 在应用价值。进一步拓展三维石墨烯材料在传感与分析中的应用， 三维石墨烯的改性及其 与功能性材料的复合至关重要。 0003 三维石墨烯具有丰富的孔结构特征， 其比表面积高， 孔壁孔腔高度联通， 为基体材 料提供可。
9、复合填充的空间。例如， 公开号为 CN102875805A 的中国发明专利申请公开了一种 三维石墨烯 - 聚多巴胺 - 金纳米粒子复合材料及其制备方法， 该方法包括以下步骤 ： (1) 将 多巴胺溶于 pH7 9 的缓冲液中， 制得多巴胺溶液 ； (2) 将三维石墨烯浸入多巴胺溶液中对 三维石墨烯进行改性修饰， 制得聚多巴胺修饰三维石墨烯 ； (3) 将聚多巴胺修饰三维石墨 烯加入到四氯金酸溶液中， 反应完全后， 制得三维石墨烯 - 聚多巴胺 - 金纳米粒子复合材 料。该方法修饰后的三维石墨烯 - 聚多巴胺 - 金纳米粒子复合材料兼具石墨烯、 聚多巴胺、 金纳米粒子的优点， 导电率高、 生物相。
10、容性好、 易于衍生化， 可用于制备识别互补 DNA 链的 DNA 电化学传感器。 0004 碳纳米管主要由呈六边形排列的碳原子构成数层到数十层的同轴圆 管。单层石 墨烯片构成的称为单壁碳纳米管， 两层及以上的称为多壁碳纳米管。其中每个碳原子主要 通过 sp2杂化与周围三个碳原子发生完全键合， 管的两端各有一个有富勒烯球体分子形成 的帽子。 碳纳米管因其比表面积高、 独一无二的结构以及化学稳定性好等优点， 常作为电极 构筑基材修饰在电极表面， 大大提高酶的固定量， 增强电极的分析性能。 0005 二茂铁是一种具有夹心型结构和芳香性的高度富电子体系， 具有稳定性好， 反应 活性高， 较易进行结构修。
11、饰等特殊的化学性质， 尤其是将二茂铁引入各种结构的分子中而 得到的衍生物， 由于其具有独特的电化学和光学特性， 已被广泛应用于化学修饰电极。 二茂 铁及衍生物修饰电极的特征是膜中有氧化还原中心， 在电位扫描过程中能发生氧化或还原 反应， 还能对反应物活化或促进电子的转移速率， 因此可作为优良的电子媒介体被广泛应 用于第二代生物传感器中。 0006 壳聚糖是天然类多糖甲壳素经部分脱乙酰化后得到的直链大分子生物多糖， 化学 名为聚 (1， 4)-2- 氨基 -2- 脱氧 -D- 葡聚糖。壳聚糖来源丰富， 是环境可再生资源， 具有 说 明 书 CN 103424449 A 3 2/7 页 4 良好的。
12、生物相容性。将壳聚糖用于酶固定化的研究非常活跃。壳聚糖分子中大量的活性氨 基可在酸性环境下质子化， 使壳聚糖溶于酸性溶液。当溶液 pH 值高于壳聚糖的 pKa 时， 氨 基去质子化后， 壳聚糖变为不溶状态。在壳聚糖溶液中插入电极， 接通电源时， 溶液中的氢 离子在阴极被还原成氢气。与此同时， 阴极表面 pH 值逐渐增加， 并在溶液中形成一定的 pH 梯度。由于壳聚糖的溶解性与溶液酸度有关， 当电极附近溶液 pH 值高于壳聚糖 pKa 时， 壳 聚糖变为不溶状态并沉积在阴极表面。此法制备壳聚糖膜条件温和， 膜厚度可控。 发明内容 0007 本发明提供了一种二茂铁接枝壳聚糖-碳纳米管-酶复合膜修饰。
13、三维石墨烯复合 材料及其制备方法， 复合材料可将三维石墨烯作为无支载的基础电极， 以二茂铁作为电化 学活性组分， 构筑基于三维石墨烯的酶生物传感器， 成功克服了传统的酶生物传感器需要 添加溶液相电子转移介体或小分子媒介体易从电极表面流失的缺点。 0008 一种二茂铁接枝壳聚糖-碳纳米管-酶复合膜修饰三维石墨烯复合材料的制备方 法， 包括如下步骤 ： 0009 将二茂铁接枝壳聚糖， 碳纳米管和酶溶解于醋酸缓冲液中， 以三维石墨烯为阴极， 进行电沉积， 二茂铁接枝壳聚糖， 碳纳米管和酶形成复合膜并沉积在三维石墨烯表面， 即得 二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯复合材料。 0。
14、010 将二茂铁接枝壳聚糖与电子传递促进剂碳纳米管以及酶相结合， 即在二茂铁接枝 壳聚糖溶液中加入碳纳米管和酶， 可在三维石墨烯表面电沉积得到二茂铁接枝壳聚糖 - 碳 纳米管 - 酶复合膜， 制得复合材料。该复合材料可将三维石墨烯作为无支载的基础电极， 以 二茂铁作为电化学活性组分， 构筑基于三维石墨烯的酶生物传感器， 在电化学传感检测等 领域有潜在应用价值。 0011 所述电沉积过程为 ： 0012 将二茂铁接枝壳聚糖溶于醋酸缓冲液， 再加入碳纳米管， 超声分散， 最后加入酶， 再次超声分散后将三维石墨烯作为阴极， -1.0 -3.0V 条件下电沉积 1.0-20min。 0013 所述电沉。
15、积过程在室温下进行。 0014 二茂铁接枝壳聚糖、 碳纳米管和酶的用量会影响复合膜的沉积量和性能， 作为优 选， 所述二茂铁接枝壳聚糖、 碳纳米管和酶的质量比为 0.1-10 ： 0.02-2 ： 0.01-10， 所述二茂 铁接枝壳聚糖溶于醋酸缓冲液后的浓度为 0.1-10mg/mL。 0015 所述醋酸缓冲液的浓度为 0.02-0.2mol/L， pH 值为 4.8 5.2。 0016 所述二茂铁接枝壳聚糖由如下方法制备 ： 0017 （1） 将二茂铁甲醛溶于甲醇溶液中， 得到浓度为 0.1-5mg/mL 的二茂铁甲醛溶液 ； 将壳聚糖溶于浓度为 0.5-5.0% 的乙酸或盐酸溶液中， 得。
16、到质量百分数为 0.1-4% 的壳聚糖 溶液 ； 0018 （2） 将所述壳聚糖溶液加入二茂铁甲醛溶液中， 搅拌反应 1.5 2.5h， 然后加入硼 氢化钠， 继续搅拌反应 20 28h 后加入氢氧化钠溶液至黄色沉淀完全， 将所得黄色沉淀洗 涤、 干燥后得所述二茂铁接枝壳聚糖。 0019 所述硼氢化钠与二茂铁甲醛的质量比为 2:1 5:1。 0020 所述氢氧化钠溶液的质量百分浓度为 0.1%-10%。 说 明 书 CN 103424449 A 4 3/7 页 5 0021 所述洗涤用蒸馏水和甲醇交替离心洗涤。 0022 所述酶为葡萄糖氧化酶、 过氧化物酶、 乳酸氧化酶、 胆固醇氧化酶、 酪胺。
17、酸氧化 酶、 醇氧化酶、 醇脱氢酶、 漆酶、 胆碱脂酶、 胆碱氧化酶、 胆红素氧化酶、 脂肪酶和多酚氧化酶 中的至少一种。 0023 本发明还提供了一种如所述制备方法制备得得到的二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米 管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯复合材料。 0024 该复合膜修饰三维石墨烯材料可将三维石墨烯作为无支载的基础电极， 以二茂铁 作为电化学活性组分， 以酶为活性酶， 在电化学传感检测等领域具有潜在的应用价值。 如以 葡萄糖氧化酶为例， 二茂铁可作为电子媒介体， 葡萄糖氧化酶作为活性酶电催化氧化葡萄 糖。 0025 检测机理如下 ： 0026 葡萄糖氧化酶 ( 氧化态 )+ 葡萄糖葡萄糖酸内酯。
18、 + 葡萄糖氧化酶 ( 还原态 ) 0027 葡萄糖氧化酶 ( 还原态 )+ 二茂铁 ( 氧化态 ) 葡萄糖氧化酶 ( 氧化态 )+ 二茂铁 ( 还原态 ) 0028 二茂铁 ( 还原态 )-2e 二茂铁 ( 氧化态 ) 0029 即葡萄糖氧化酶 ( 氧化态 ) 与葡萄糖作用生成葡萄糖氧化酶 ( 还原态 ) 和葡萄糖 酸内脂， 葡萄糖氧化酶(还原态)与二茂铁(氧化态)作用生成葡萄糖氧化酶(氧化态)和 二茂铁 ( 还原态 )， 然后二茂铁 ( 还原态 ) 在电极表面氧化生成二茂铁 ( 氧化态 )。因此， 二茂铁接枝壳聚糖-碳纳米管-葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨烯材料可直接应用于无 试剂型检测葡。
19、萄糖。 0030 相对于现有技术， 本发明的有益效果为 ： 0031 (1)CVD 法制备的三维大孔石墨烯材料集成了独特的三维网状形貌特征和石墨烯 独特的物理化学性质， 不仅具有极低的密度、 极高的孔隙率和高比表面积， 还具有石墨烯优 异的电学、 热学、 力学性能， 拓展了石墨烯在超级电容器、 电池材料和分析传感中的应用空 间。尤为值得关注的是， 三维石墨烯材料可作为无支载的电极使用。然而， 三维石墨烯材料 由于表面疏水， 无可衍生化的官能团很难进行实际应用， 本发明在三维石墨烯表面电沉积 二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米管 - 酶复合膜构建功能性复合材料， 拓展了三维石墨烯材料在 生物传感与分析。
20、中的应用。 0032 (2) 壳聚糖具有良好的生物相容性、 成膜性和化学、 机械稳定性等特点， 分子内含 有大量的功能性基团氨基和羟基， 将电子媒介体二茂铁接枝到壳聚糖上， 合成二茂铁接枝 壳聚糖高分子氧化还原复合物， 不仅赋予壳 聚糖氧化还原电活性， 还大大改善了二茂铁的 生物相容性， 然而壳聚糖导电性能差， 引入具有独特金属或半导体导电性、 良好的吸附能力 的碳纳米管增强壳聚糖膜的导电性。因此， 本发明制备的复合材料为酶的固定提供了良好 的微环境， 有利于酶在电极表面的稳定负载， 且有效地建立了酶与电极之间的电子传递。 0033 (3)本发明制备的二茂铁接枝壳聚糖-碳纳米管-酶复合膜修饰三。
21、维石墨烯材料， 通过一步电沉积法成功实现， 制备方法简单、 成膜性能好、 过程可控。电化学沉积是一种工 艺成本低、 设备投资少、 原理利用率高及易于实现自动化的方法， 该方法受电极尺寸和形状 限制小、 没有溶胶凝胶法繁杂的后续过程。 通过控制沉积电位， 调节壳聚糖沉积液中添加的 生物功能分子和电子介导材料， 还可以制备厚度、 成分、 界面密度可调的多层膜， 获得独特 说 明 书 CN 103424449 A 5 4/7 页 6 性能的纳米生物功能界面。 0034 (4) 本发明制备的二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯材料 可直接应用于无试剂型电化学检测中， 将酶与电子传。
22、递媒介体 - 二茂铁共同固定在三维石 墨烯电极表面， 通过二茂铁介导的酶与电极间的电子传递实现生物传感， 成功克服了传统 的酶生物传感器需要添加溶液相电子转移介体或小分子媒介体易从电极表面流失的缺点。 附图说明 0035 图 1 为本发明的制备过程示意图。 0036 图 2 为本发明实施例 1 中三维石墨烯的扫描电镜图。 0037 图 3 为本发明实施例 1 中三维石墨烯 - 二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄 糖氧化酶复合材料的扫描电镜图。 0038 图 4 为本发明实例 1 中二茂铁接枝壳聚糖 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨 烯 (a) 和二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 。
23、- 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨烯 (b) 在 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (pH 为 7.0) 中的循环伏安图。扫数为 100mV/s。 0039 图 5 为本发明实施例 1 中三维石墨烯 (a) 和二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米 管 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨烯 (b) 在 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (pH 为 7.0) 中的 循环伏安图。扫数为 100mV/s。 0040 图 6 为本发明实施例 1 中二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧 化酶复 合膜修饰三维石墨烯材料在不同扫数下循环伏安图。电化学支持液为 0.05mol/L 磷酸缓冲 液 (pH 为 。
24、7.0)。扫数分别为 40、 60、 80、 100、 120、 140、 160、 180、 200mV/s。内插图为峰电流 与扫数平方根的线性关系。 0041 图 7 为本发明实施例 1 中二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧化酶复合 膜修饰三维石墨烯材料进行 50 段扫描的循环伏安图。电化学支持液为 0.05mol/L 磷酸缓 冲液 (pH 为 7.0)。扫数为 100mV/s。 0042 图 8 为本发明实施例 1 中二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧化酶复合 膜修饰三维石墨烯材料在 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (pH 为 7.0) 中 (a)， 0.05。
25、mol/L 磷酸缓冲 液 (pH 为 7.0)+25mmol/L 葡萄糖 (b)、 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (pH 为 6.0)+40mmol/L 葡萄糖 (c) 中的循环伏安图。扫数为 100mV/s。 具体实施方式 0043 电沉积二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯材料的制备方 法， 包括以下步骤 ： 0044 （1） 制备二茂铁接枝壳聚糖复合物 ： 二茂铁接枝壳聚糖的制备步骤和条件为 ： 0045 将壳聚糖溶于乙酸或盐酸溶液中磁力搅拌 30min 后冷却至室温， 再将二茂铁甲醛 溶于甲醇溶液中， 然后向二茂铁甲醛溶液中逐滴加入壳聚糖溶液， 磁力搅拌 2h 。
26、后加入硼氢 化钠， 再磁力搅拌 24h 后， 加入氢氧化钠至黄色沉淀完全。将所得沉淀用蒸馏水、 甲醇交替 离心洗涤， 60减压干燥后得到二茂铁接枝壳聚糖固体。 0046 其中， 二茂铁甲醛溶液浓度为 0.1-5mg/mL， 壳聚糖溶液质量浓度为 0.1%-4%， 由壳 聚糖溶于 0.5%-5.0% 的乙酸或盐酸溶液制得， 硼氢化钠的质量为 50-250mg， 氢氧化钠溶液 说 明 书 CN 103424449 A 6 5/7 页 7 的浓度为 0.1%-10%。二茂铁接枝壳聚糖溶液的浓度为 0.1-10mg/mL， 由二茂铁接枝壳聚糖 溶于 0.02-0.2mol/L 的醋酸缓冲液制得， 醋酸。
27、缓冲液的 pH 为 5.0。 0047 （2） 将二茂铁接枝壳聚糖、 碳纳米管、 酶混匀后， 通过电沉积法将其沉积到三维石 墨烯表面， 制得二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯材料。 0048 电沉积二茂铁接枝壳聚糖-碳纳米管-酶复合膜修饰三维石墨烯材料的制备步骤 和条件为 ： 0049 将二茂铁接枝壳聚糖溶于醋酸缓冲液， 加入碳纳米管和酶后， 超声 10min 后得到 二茂铁接枝壳聚糖-碳纳米管-酶复合溶液 ； 以三维石墨烯作为阴极， 电沉积得到二茂铁接 枝壳聚糖 - 碳纳米管 - 酶复合膜修饰三维石墨烯材料。 0050 碳纳米管为单壁碳纳米管或多壁碳纳米管， 浓度为 。
28、0.02-2mg/mL。 0051 酶为葡萄糖氧化酶、 过氧化物酶、 乳酸氧化酶、 胆固醇氧化酶、 酪胺酸氧化酶、 醇氧 化酶、 醇脱氢酶、 漆酶、 胆碱脂酶、 胆碱氧化酶、 胆红素氧化酶、 脂肪酶、 多酚氧化酶等中的一 种或多种， 浓度为 0.01-10mg/mL。 0052 电沉积电位范围为 -1.0 -3.0V， 沉积时间为 1.0-20min。 0053 二茂铁接枝壳聚糖-碳纳米管-酶复合膜修饰三维石墨烯材料的制备反应示意图 如图 1 所示。 0054 首先， 利用二茂铁甲醛上的醛基与壳聚糖上的氨基发生 Schiff 碱反应通过 NaBH4 还原合成二茂铁接枝壳聚糖 ； 然后， 将二茂。
29、铁接枝壳聚糖与碳纳米管、 酶混合均匀后， 一步 电沉积至三维石墨烯表面， 成功构建二茂铁接枝壳聚糖 - 碳纳米管 - 酶复合膜修饰三维石 墨烯复合材料。 0055 为使本领域技术人员进一步理解本发明， 下面结合实施例及附图进一步说明本发 明。实施例中物质均可通过商购获得。 0056 实施例 1 0057 (1) 二茂铁接枝壳聚糖的制备步骤和条件为 ： 0058 将二茂铁甲醛和壳聚糖分别溶于甲醇溶液和 0.5% 乙酸溶液中， 二茂铁甲醛浓度 为 3mg/mL， 壳聚糖溶液质量浓度为 0.5%。在二茂铁甲醛溶液中逐滴加入上述壳聚糖溶液， 磁力搅拌 2h 后， 以硼氢化钠与二茂铁甲醛的质量比为 3:。
30、1 加入硼氢化钠， 再磁力搅拌 24h。 加入 5% 氢氧化钠溶液至黄色沉淀完全。将所得沉淀用蒸馏水、 甲醇交替离心洗涤， 60减 压干燥后得到二茂铁接枝壳聚糖固体。 0059 (2) 电沉积二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石 墨烯材料的制备步骤和条件为 ： 0060 将二茂铁接枝壳聚糖溶于 0.2mol/L 醋酸缓冲液， 醋酸缓冲液的 pH 为 5.0， 二茂铁 接枝壳聚糖溶液浓度为 5mg/mL。加入 1mg/mL 单壁碳纳米管后， 超声 10min 后， 加入 4mg/mL 葡萄糖氧化酶， 再超声 10min。 将三维石墨烯作为阴极， 在 -1.5V 电。
31、位下电沉积 2min， 即得 到二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨烯材料。 0061 随后， 对经步骤 (1) (2) 制备的二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧 化酶复合膜修饰三维石墨烯材料进行电化学测试、 电镜扫描等操作， 得到的测试分析结果 如图 2 8 所示。 0062 图 2 所示的三维石墨烯的扫描电镜图， 表明三维石墨烯为一个全连通的整体， 富 说 明 书 CN 103424449 A 7 6/7 页 8 含大孔与介孔结构， 高倍数扫描电镜图表明了石墨烯结构。 0063 图 3 所示二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧化酶。
32、复合膜修饰三维石墨 烯材料的扫描电镜图， 表明沉积修饰层具有开放的三维结构。 0064 图 4 为二茂铁接枝壳聚糖 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨烯 (a) 和二茂铁接 枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨烯 (b) 在 0.05mol/L 磷酸缓 冲液 (pH 为 7.0) 中的循环伏安图， 表明二茂铁接枝壳聚糖 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维 石墨烯和二茂铁接枝壳聚糖-碳纳米管-葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨烯具有类似的 电化学信号， 氧化还原峰电位一致， 但加入单壁碳纳米管致电流增大， 这是由于单壁碳纳米 管作为 “导线” 增强了沉积膜的导电性。 0065 。
33、图 5 所示的循环伏安表征中， 三维石墨烯在 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (pH 为 7.0) 中 没有氧化还原峰， 但二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石 墨烯材料显示出很好的氧化还原峰， 表明二茂铁已经成功修饰在三维石墨烯表面。 0066 图 6 所示二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨 烯材料在不同扫数下的循环伏安图， 峰电流与扫数的平方根具有线性关系， 证明了二茂铁 在三维石墨烯上的修饰。 0067 图 7 所示二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨 烯材料在进行 50 段扫描的循环伏。
34、安图， 证明了复合膜修饰三维石墨烯的稳定性。 0068 图 8 所示二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 葡萄糖氧化酶复合膜修饰三维石墨 烯材料在磷酸缓冲液中， 以及加入葡萄糖后的循环伏安图， 可以看到加入葡萄糖后， 氧化峰 增大， 还原峰减小， 有效证明了基于葡萄糖氧化酶的催化性能、 二茂铁介导的电化学过程。 0069 以上结果分析结果证明了二茂铁接枝壳聚糖、 碳纳米管、 酶在三维石 墨烯上的有 效制备， 稳定性好并具有良好的电化学性能和电催化性能。 0070 实施例 2 0071 (1) 二茂铁接枝壳聚糖的制备步骤和条件为 ： 0072 将二茂铁甲醛和壳聚糖分别溶于甲醇溶液和 5% 乙酸。
35、溶液中， 二茂铁甲醛浓度为 5mg/mL， 壳聚糖溶液质量浓度为5%。 在二茂铁甲醛溶液中逐滴加入上述壳聚糖溶液， 磁力搅 拌 2h 后， 以硼氢化钠与二茂铁甲醛的质量比为 5:1 加入硼氢化钠， 再磁力搅拌 24h。加入 10% 氢氧化钠溶液至黄色沉淀完全。将所得沉淀用蒸馏水、 甲醇交替离心洗涤， 60减压干 燥后得到二茂铁接枝壳聚糖固体。 0073 (2) 电沉积二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 过氧化氢酶复合膜修饰三维石墨 烯材料的制备步骤和条件为 ： 0074 将二茂铁接枝壳聚糖溶于 0.2mol/L 醋酸缓冲液， 醋酸缓冲液的 pH 为 5.0， 二茂铁 接枝壳聚糖溶液浓度为 。
36、10mg/mL。加入 2mg/mL 单壁碳纳米管后， 超声 10min 后， 加入 10mg/ mL 过氧化氢酶， 再超声 10min。将三维石墨烯作为阴极， 在 -3.0V 电位下电沉积 1min， 即得 到二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 过氧化氢酶复合膜修饰三维石墨烯材料。 0075 经测试证明， 实施例 2 制备的二茂铁接枝壳聚糖 - 单壁碳纳米管 - 过氧化氢酶复 合膜修饰三维石墨烯材料同样具有良好的电化学活性、 电催化性能。 0076 实施例 3 0077 (1) 二茂铁接枝壳聚糖的制备步骤和条件为 ： 说 明 书 CN 103424449 A 8 7/7 页 9 0078 。
37、将二茂铁甲醛和壳聚糖分别溶于甲醇溶液和 0.5% 乙酸溶液中， 二茂铁甲醛浓度 为 0.1mg/mL， 壳聚糖溶液质量浓度为 0.5%。在二茂铁甲醛溶液中逐滴加入上述壳聚糖溶 液， 磁力搅拌 2h 后， 以硼氢化钠与二茂铁甲醛的质量比为 2:1 加入硼氢化钠， 再磁力搅拌 24h。加入 0.1% 氢氧化钠溶液至黄色沉淀完全。将所得沉淀用蒸馏水、 甲醇交替离心洗涤， 60减压干燥后得到二茂铁接枝壳聚糖固体。 0079 (2) 电沉积二茂铁接枝壳聚糖 - 多壁碳纳米管 - 辣根过氧化物酶复合膜修饰三维 石墨烯材料的制备步骤和条件为 ： 0080 将二茂铁接枝壳聚糖溶于0.02mol/L醋酸缓冲液，。
38、 醋酸缓冲液的pH为5.0， 二茂铁 接枝壳聚糖溶液浓度为 0.1mg/mL。加入 0.02mg/mL 多壁碳纳米管后， 超声 10min 后， 加入 0.01mg/mL 辣根过氧化物酶， 再超声 10min。将三维石墨烯作为阴极， 在 -1.0V 电位下电沉 积10min， 即得到二茂铁接枝壳聚糖-多壁碳纳米管-辣根过氧化物酶复合膜修饰三维石墨 烯材料。 0081 经测试证明， 实施例 3 制备的二茂铁接枝壳聚糖 - 多壁碳纳米管 - 辣根过氧化物 酶复合膜修饰三维石墨烯材料同样具有良好的电化学活性、 电催化性能。 说 明 书 CN 103424449 A 9 1/4 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103424449 A 10 2/4 页 11 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103424449 A 11 3/4 页 12 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103424449 A 12 4/4 页 13 图 8 说 明 书 附 图 CN 103424449 A 13 。