借助对信号的组合使用进行的多重数字分析.pdf

公开了用于通过信号的组合使用在较大数量的靶上执行多重数字分析的系统，包括方法、装置和合成物。

权利要求书
1.  一种执行多重数字扩增分析的方法，所述方法包括：
扩增在分块中的多于R个靶；
产生表示在R个不同的波长区域中从所述分块检测的光的R个信号，其中R≥2；以及
基于所述R个信号计算在所述分块中的每个靶的平均水平，其中所计算的水平考虑到在相同的单独分块中的不同靶的同时存在，如果有的话。

2.  如权利要求1所述的方法，其中每个靶的扩增单独地通过与任何其它靶不同的信号或信号的组合来报告。

3.  如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述信号中的每个报告所述靶中的至少两个靶的不同组合的扩增。

4.  如权利要求3所述的方法，其中所述分块是液滴，所述方法还包括针对每个信号确定呈现所述至少两个靶中的任一个的扩增的液滴的数量的步骤，且其中所述计算步骤基于针对所述R个信号中的每个确定的所述数量。

5.  如权利要求1所述的方法，其中所述计算步骤包括找到对一组联立方程的解的步骤。

6.  如权利要求5所述的方法，其中存在T个靶，并且其中找到解的步骤包括找到对T个联立方程的解的步骤。

7.  如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述解通过数值分析来获得。

8.  如权利要求1所述的方法，其中存在三个靶，并且其中表示光的所述信号从与在扩增期间结合到相应的靶的扩增子的探针相关的两个荧光团检测到。

9.  如权利要求8所述的方法，其中所述两个荧光团是VIC和FAM。

10.  如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述分块包含所述三个靶中的第一个靶的第一探针、所述三个靶中的第二个靶的第二探针，以及所述三个靶中的第三个靶的第三探针，并且其中所述第一探针只用VIC标记，所述第二探针只用FAM标记，且所述第三探针用VIC和FAM二者标记。

11.  如权利要求10所述的方法，其中所述第三探针包括不用VIC标记的FAM标记探针和不用FAM标记的VIC标记探针。

12.  如权利要求1所述的方法，其中所述平均水平是浓度。

13.  如权利要求1所述的方法，其中计算平均水平的步骤包括确定每种类型的靶的扩增阳性分块的总数量的步骤和确定分块的总数量的步骤。

14.  如权利要求1所述的方法，还包括在分块中分布所述多于R个靶的拷贝使得一些分块包含给定靶的多于一个拷贝的步骤。

15.  如权利要求1所述的方法，其中存在至少四个靶。

16.  一种执行多重数字扩增分析的方法，所述方法包括：
扩增在液滴中的多于R个靶；
产生表示在R个不同的波长区域中从所述液滴检测的光的R个信号，其中R≥2；以及
通过找到对一组联立方程的解来计算所述多于R个靶中的每个靶的平均水平。

17.  如权利要求16所述的方法，其中每个靶的扩增单独地通过与任何其它靶不同的信号或信号的组合来报告。

18.  如权利要求16所述的方法，其中所述信号中的每个报告所述靶中的至少两个靶的不同组合的扩增。

19.  如权利要求18所述的方法，还包括确定对每个信号所报告的所述至少两个靶中的任一个为扩增阳性的液滴的总数量的步骤，且其中所述计算步骤基于对所述R个信号中的每个确定的所述总数量。

20.  如权利要求16所述的方法，其中存在T个靶，并且其中所述计 算步骤包括找到对T个联立方程的解的步骤。

21.  如权利要求16所述的方法，其中所述解通过数值分析来获得。

22.  如权利要求16所述的方法，其中所述水平考虑到在相同的单独液滴中的不同靶的同时存在。

23.  一种执行多重数字扩增分析的方法，所述方法包括：
扩增在液滴中的多于R个靶；
产生表示在R个不同的波长区域中从所述液滴检测的光的R个信号，其中R≥2，且所述信号中的每个报告所述靶中的至少两个靶的不同组合的扩增；以及
基于所述R个信号来计算在所述液滴中每个靶的平均水平，而不对每个信号确定所述至少两个靶中的哪一个在这种信号的单独扩增阳性液滴中扩增。

24.  如权利要求23所述的方法，还包括确定对每个信号所报告的所述至少两个靶的任一个为扩增阳性的液滴的总数量的步骤，且其中所述计算步骤基于针对R个信号中的每个确定的所述总数量。

25.  如权利要求23所述的方法，其中所述计算步骤包括找到对一组联立方程的解的步骤。

26.  一种合成物，包括：
包含探针的液滴，所述探针包括寡核苷酸、第一荧光团、第二荧光团和能量转移部分，其中所述能量转移部分是所述第一荧光团和所述第二荧光团中的一个或两个的猝灭剂和/或能量转移伙伴。

27.  如权利要求26所述的合成物，其中所述第一荧光团、所述第二荧光团和所述能量转移部分每个共价地连接到所述寡核苷酸。

28.  如权利要求26所述的合成物，还包括包含所述探针并布置在载体流体内的多个液滴。

29.  如权利要求26所述的合成物，其中所述液滴包含模板分子和能够扩增所述模板分子的至少一个区域的扩增试剂，并且其中所述探针能够 结合到通过所述模板分子的所述区域的扩增产生的扩增子。

30.  如权利要求26所述的合成物，其中所述探针是第一探针，且其中所述液滴还包括第二探针，所述第二探针包括所述第一荧光团或所述第二荧光团，但不同时包括所述第一荧光团和所述第二荧光团。

31.  如权利要求26所述的合成物，其中所述能量转移部分是连接在所述寡核苷酸的5′-端处的核苷酸的猝灭剂。

32.  如权利要求26所述的合成物，其中所述第一荧光团、所述第二荧光团和所述能量转移部分中的每个连接到所述寡核苷酸的不同的核苷酸。

33.  如权利要求32所述的合成物，其中一对所述第一荧光团、所述第二荧光团和所述能量转移部分连接到所述寡核苷酸的相同核苷酸。

34.  如权利要求26所述的合成物，其中所述第一荧光团、所述第二荧光团和所述能量转移部分中的至少一个经由所述第一荧光团、所述第二荧光团和所述能量转移部分中的另一个连接到所述寡核苷酸的核苷酸。

35.  如权利要求26所述的合成物，其中荧光团或猝灭剂连接到所述寡核苷酸的所述5′-端，并且其中荧光团或猝灭剂连接到所述寡核苷酸的3′-端，并且其中荧光团或猝灭剂连接到所述5′-端和所述3′-端中间的核苷酸。

36.  如权利要求26所述的合成物，其中所述第一荧光团、所述第二荧光团和所述能量转移部分中的一个或多个连接到布置在所述寡核苷酸的所述5′-端和所述3′-端中间的一个或多个内部核苷酸。

说明书借助对信号的组合使用进行的多重数字分析
优先权申请的交叉引用
本申请基于并依照35U.S.C.§119（e）要求于2011年3月18日提交的美国临时专利申请序列号61/454,373的利益，该专利申请为了所有目的通过引用被全部并入本文。
交叉引用
本申请为了所有目的通过引用全部合并下述材料：2006年5月9日发布的美国专利号7,041,481；2010年7月8日出版的美国专利公开号2010/0173394A1；2011年9月29日出版的PCT专利申请公开号WO2011/120006A1；2011年9月29日出版的PCT专利申请公开号WO2011/120024A1；2011年11月1日提交的美国专利申请序列号13/287,120；2011年7月12日提交的美国临时专利申请序列号61/507,082；2011年7月20日提交的美国临时专利申请序列号61/510,013；以及Joseph R.Lakowicz的“PRINCIPLESOFFLUORESCENCESPECTROSCOPY”（1999年，第二版）。
介绍
数字分析通常依赖于检测样本中的分析物的单独拷贝的存在或活动的能力。在示例性数字分析中，样品被分成通常具有相等体积的一组分块，每一个分块包含平均约小于分析物的一个拷贝。如果分析物的拷贝随机地分布在分块中，则一些分块将不会包含拷贝，其它分块仅包含一个拷贝，以及如果分块的数目足够大，又一些其它应该包含两个拷贝、三个拷贝以及甚至更多数量的拷贝。基于分块中的分析物的给定平均浓度，在分块中 发现确切地0、1、2、3或更多个拷贝的概率由泊松分布描述。相反，分块中的分析物的平均浓度可以根据在分块中找到给定数量的拷贝的概率来估计。
可以在数字分析中测量没有发现拷贝的概率和发现一个或多个拷贝的概率的估计。每个分块可以被测试以确定该分块是否是包含分析物的至少一个拷贝的阳性分块，或者是不包含分析物的拷贝的阴性分块。在分块中发现没有拷贝的概率可以由阴性的所测试的分块的分数（“阴性分数”）近似，而找到至少一个拷贝的概率可以由阳性的所测试的分块的分数（“阳性分数”）近似。阳性分数或阴性分数然后可以在泊松方程中使用以确定分块中的分析物的浓度。
数字分析常常依赖于分块中的核酸靶的扩增以实现分析物的单个拷贝的探测。扩增可以通过聚合酶链式反应（PCR）来进行，以实现数字PCR分析。扩增的靶可以是分析物本身或在形成分块之前或之后产生的分析物的替代物。靶的扩增可以用反应中包括的荧光探针来被光学地检测。特别是，探针可以包括染料，其提供指示靶是否被扩增的荧光信号。
数字PCR分析可以被多重化以允许检测在每个分块内的两个或更多的不同靶。靶的扩增可以通过利用以不同染料标记的靶特异性探针来区分，这产生在不同的检测通道中，即，在发射（和/或激发）的不同波长或波长区域（“颜色”）处检测的荧光。如果用于数字PCR分析的检测器可区别地测量由R种不同的染料发射的荧光，那么分析能够有效地测量R个不同的靶。然而，具有多个检测通道的检测多种颜色的仪器比具有较少的检测通道的那些仪器更昂贵。此外，增加可区分的染料的数目是昂贵的，并且超过某一数量会变得不切实际。另一方面，许多应用——尤其是其中样品是有限的——可极大地受益于更高程度的多重化。
需要一种新方法来提高数字分析的多重水平。
概述
本公开提供一种用于通过信号的组合使用来在较大数量的靶上执行 多重数字分析的系统，包括方法、装置和合成物。
附图简述
图1是根据本公开的方面的执行数字分析的示例性方法的流程图。
图2是根据本公开的方面的用于执行图1的数字分析的示例性系统的示意图。
图3是根据本公开的方面的一对靶和相应的探针的示意图，探针能够在数字扩增分析中通过所发射的光来报告靶扩增的存在或不存在，所发射的光可被检测以产生每个靶的专用信号。
图4是根据本公开的方面的相应的专用信号的一对示例性曲线，专用信号可以在液滴中执行的数字扩增分析中通过检测从图3的探针发射的光而生成，每个信号从在相同的时间间隔上从含有液滴的流体流检测的光产生。
图5是根据本公开的方面的图3的靶对的拷贝如何分布在液滴中的示意图，在图4中，光基于图4的相应专用信号的强度从液滴被探测到。
图6是根据本公开的方面的三个靶和相应的示例性探针的示意图，探针能够在数字扩增分析中通过所发射的光报告靶扩增的存在或不存在，所发射的光可以被检测以生成一对复合信号。
图7是根据本公开的方面的一对复合信号的一对示例性曲线，复合信号可以在液滴中执行的数字扩增分析中通过检测来自图6的三个探针的荧光发射而生成，所发射的光从含有液滴的流体流在相同的时间间隔上在两个不同的波长区域中被检测。
图8是根据本公开的方面的图6的三个靶的拷贝如何分布在液滴中的示意图，光基于图7的相应复合信号的强度在图7中从液滴被探测到。
图9A是根据本公开的方面的图6的第三靶和能够经由所发射的光报告第三靶扩增的存在或不存在的另一示例性探针配置的示意图，该探针配置可以在数字扩增分析中结合图6的第一和第二靶探针使用以只产生代表 三个靶的扩增的一对复合信号。
图9B是根据本公开的方面的图6的第三靶和对第三靶特定的另一示例性探针配置的示意图，该探针配置可以在数字扩增分析中结合图6的第一靶和第二靶探针来使用以只产生代表三个靶的一对复合信号。
图10是根据本公开的方面的图6的第三靶和能够经由所发射的光报告第三靶扩增的存在或不存在的又一示例性探针配置的示意图，该探针配置可以在数字扩增分析中结合图6的第一和第二靶探针使用以只产生代表三个靶的扩增的一对复合信号。
图11是根据本公开的方面的三个靶和相应示例性引物的示意图，引物能够在数字扩增分析中只使用两个探针来报告三个靶的扩增。
图12是根据本公开的方面的图6的第三靶和能够在数字扩增分析中仅使用两个探针来报告三个靶的扩增的另一示例性探针和引物配置的示意图。
图13是根据本公开的方面的图6的三个靶以及能够在数字扩增分析中使用两个探针来报告三个靶的扩增的仅有两个探针的又一示例性配置的示意图。
图14是根据本公开的方面的包含一对未链接的靶T1和T2的片段群体的示意图。
图15是根据本公开的方面的如在图14中获取的片段群体的示意图，但这对靶在相同的单独片段上总是彼此链接。
图16是根据本公开的方面的如在图14中获取的片段群体的示意图，但这对靶在群体中仅部分地相互链接。
图17是根据本公开的方面的用在数字扩增分析中的一组示例性多标记探针的示意性表示。
图18是根据本公开的方面的模板分子的示意图，该模板分子在多标记探针分子存在的情况下在靶扩增期间通过DNA聚合酶复制，并通过聚合酶描绘探针降解以从探针分子的荧光团分离猝灭剂。
图19是根据本公开的方面的液滴强度的示例性二维直方图，其示出在使用单标记和双标记探针的组合执行的三个靶的多重数字扩增分析中可获得的簇，每一个探针被标有FAM、VIC或FAM和VIC。
图20是根据本公开的方面的液滴强度的另一示例性二维直方图，示出了可以在图19的分析中获得的簇，靶-3-阳性液滴的簇和靶-1+2阳性液滴的簇之间以部分分辨率区分。
图21是根据本公开的方面的液滴强度的示例性二维强度直方图，其示出可在仅使用多标记FAM、VIC探针执行的数字扩增分析中得到的簇。
图22是根据本公开的方面的液滴强度的另一示例性二维强度直方图，其示出如在图21中执行的数字扩增分析中得到的簇，但是除了多标记FAM、VIC探针以外，分析还可以使用单标记FAM或VIC探针对来补充。
详细描述
本公开提供一种用于通过信号的组合使用在更大数量的靶上执行多重数字分析的系统，包括方法、装置和合成物。该方法可以被描述为基于颜色的多重化方法。
提供了执行多重数字扩增分析的方法，例如PCR分析。在这个方法中，在分块中扩增超过R个靶。可以产生R个信号。信号可以代表在来自分块的R个不同的波长区域中检测到的光，其中R≥2。在分块中的每个靶的平均水平可以基于R个信号来计算，所计算的水平考虑到在相同的单独分块中的不同靶的同时存在，如果有的话。
提供执行多重数字扩增分析的另一种方法。在该方法中，超过R个靶可以在液滴中被扩增。可以产生R个信号，信号表示在来自液滴的R个不同的波长区域内检测到的光，其中R≥2。超过R个靶中的每个的平均水平可以通过找到对一组联立方程的解来计算。
提供执行多重数字扩增分析的又一种方法。在该方法中，R个靶可以在液滴中被扩增。可以产生R个信号，其中R≥2，信号表示在来自液滴的R个不同的波长区域内检测到的光。每一信号可报告至少两个靶的不同 组合的扩增。液滴中的每个靶的平均水平可以基于R个信号来计算，而不针对每个信号确定所述至少两个靶中的哪一个对这样的信号在单独扩增阳性液滴中扩增。
提供一种合成物。合成物可以包括含有探针的液滴。探针可以包括寡核苷酸、第一荧光团、第二荧光团和能量转移部分。能量转移部分可以是第一和第二荧光团中的一个或两个的猝灭剂和/或能量转移伙伴。
本公开的另外的方面将在下面的章节中被介绍：（I）系统概述，和（II）实例。
I.系统概述
图1示出了执行数字分析的示例性方法40的流程图。可以以任何适当的顺序以及以任何合适的组合执行对方法40给出的步骤。此外，步骤可以与本公开的任何其它合适的步骤、方面和/特征组合和/或被本公开的任何其它合适的步骤、方面和/特征修改。
样品可以被制备用于分析，这在42被指示。样品的制备可包括样品的任何适当的操作例如收集、稀释、浓缩、纯化、冷冻干燥、冷冻、萃取、与一种或多种分析试剂的组合和至少一个初步反应的执行以使样品准备好分析中的一个或多个反应、或其任何组合等。样品的制备可以包括使得样品变得能胜任一个或多个反应例如一个或多个酶催化反应和/或结合反应的随后执行。
在一些实施方式中，样品的制备可以包括组合样品与试剂，用于扩增和用于报告扩增是否发生。这种试剂可以包括靶的引物（例如，每个靶的正向引物和反向引物）、用于检测靶的扩增的指示器（例如，探针）、dNTP和/或NTP、至少一种酶（例如，聚合酶、连接酶、逆转录酶或其组合，它们中的每一个可以是或可以不是热稳定的）的任何组合等。相应地，样品的制备可以使样品（或者其分块）变得能够扩增样品（或者其分块）中的一个或多个靶，如果存在的化。
样品可分成分块，这在44被指示。样品的分离可以涉及将样品的任何合适的部分或全部分布到分块。每个分块可以是和/或包括与其它分块的 流体体积隔离的流体体积。分块可以通过载体流体例如乳液的连续相、通过固相例如容器的至少一个壁或其组合等而彼此隔离。在一些实施方式中，分块可以是布置在连续相中的液滴，使得液滴和连续相共同形成乳液。
分块可以通过任何合适的程序以任何合适的方式形成，以及具有任何合适的特性。例如，分块可以使用具有液滴生成器的流体分配器例如吸管通过样品的搅动（例如，摇动、搅拌、超声处理等）等而形成。因此，分块可以连续地、并行地或批量地形成。分块可以具有一个或多个任何合适的体积。分块可以具有实质上均匀的体积，或者可以具有不同的体积。具有实质上相同的体积的示例性分块为单分散液滴。分块的示例性体积包括小于约100、10或1μL、小于约100、10或1nL、或小于约100、10、或1pL等的平均体积。
分块在形成时可以有在分块中执行一个或多个反应的能力。可选地，在分块形成之后，一种或多种试剂可以被添加到分块，以使它们变得有反应的能力。试剂可以通过任何适当的机构例如流体分配器、液滴的融合等被添加。在宏流体或微流体环境中，任何试剂可以与分块（或体相样品）组合。
可以在分块中执行一个或多个反应，这在46被指示。所执行的每个反应可仅在分块的子集例如小于分块的约1/2、1/4或1/10等中选择性地（和/或实质上）发生。反应可以涉及在反应中可以例如是模板和/或反应物（例如，基板）和/或结合伙伴的靶。反应可在包含靶的至少一个拷贝的分块中选择性地发生（或选择性地不发生）。
反应可以是或可以不是酶催化反应。在一些实例中，反应可以是扩增反应，例如聚合酶链式反应和/或连接酶链式反应。相应地，在分块中可以同时执行多个靶的多个扩增反应。
执行反应可包括使分块遭受促进反应的发生的一个或多个条件。条件可以包括在高于室温的温度下加热分块和/或孵育分块。在一些实例中，条件可包括使分块热循环以促进聚合酶链式反应和/或连接酶链式反应。
可以产生代表从分块检测到的光的R个信号，这在48被指示。R个 信号可以是2、3、4或更多个信号。在一些实例中，对应于每个信号的光可以用不同的传感器检测，和/或对应于至少两个信号的光可以在不同的时间使用相同的传感器检测。R个信号可以对应于在相应彼此不同的波长区域中检测到的光。每个波长区域可以以分块被照亮（例如，利用激发光）的波长或波长范围和/或来自分块的光（例如，所发射的光）被检测到的波长或波长范围为特征。探测到的光可以是从一个或多个荧光团发射的光。
可在不同的检测通道中产生R个信号中的每个。相应地，R个信号可在R个检测通道中产生。
每个信号可以是复合信号，其代表两个、三个、四个或更多个反应/分析以及因此代表反应/分析的两个、三个、四个或更多个靶。复合信号可包括两个或多个整体信号部分，其中每个信号部分表示不同的反应/分析和靶。对复合信号之一本身的分析，而不利用来自其它复合信号的数据，可以（或可以不）允许估计复合信号所代表的两个或更多靶的共同浓度但不是单独浓度。替代地，如下文进一步描述的，复合信号一起的分析允许计算每个靶的浓度。（术语“估计”和“计算”可互换地使用。）
R个复合信号（和/或R个检测通道）可以表示多于R个反应和/或靶，反应/分析和靶的数量取决于配置。例如，这R个信号可以是或包括两个复合信号（任意地称为α和β），其共同表示三个反应/分析和/或三个靶（任意地称为1、2和3），每个复合信号表示两个反应/分析/靶的不同组合（例如，α的靶1和2和β的靶1和3）。可选地，如果每个复合信号表示多达四个反应/分析/靶的不同组合（例如，α的靶1、2、3和4；β的靶2、4、5和6；γ的靶3、4、6和7），这R个信号可以是三个复合信号（任意地称为α、β和γ），其共同表示多至7个反应/分析/靶（1到7）。如果每个复合信号表示多达8个反应/分析/靶的不同组合，这R个信号可以是四个复合信号，其表示多达十五个反应/分析/靶。
更一般地，2R-1个靶可以用R个复合信号（或波长区域）来分析。为了在R个波长区域内分析2R-1个靶，每个靶可以由不同于每个其它靶的波长区域或波长区域的组合表示。当所有波长区域单独地和以所有可能的组合被利用时，一组2R-1个靶可以被表示和分析。
每个复合信号可以基于检测到的从分块中的一个或多个探针发射的光而产生。一个或多个探针可以报告信号所表示的两个或多个特定反应中的至少一个是否在分块中发生，以及因此对应于两个或多个特定反应的两个或多个特定靶中的至少一个的至少一个拷贝是否存在于分块中。对应于探针的复合信号的强度可以被分析以确定特定反应中的至少一个是否发生以及特定靶中的一个的至少一个拷贝是否存在。根据至少一个特定反应是发生还是不发生（例如，高于阈值程度）和特定靶中的至少一个是存在于每个单独的分块中还是不存在于每个单独的分块，强度可在分块当中变化。
复合信号代表的探针可以包括不同的荧光团。换句话说，从不同的荧光团发射的光可被探测到在特定的波长区域的复合信号的两个不同的组成部分处产生。可选地或另外，相同的荧光团可包括在复合信号所代表的至少两个靶的一个探针或两个或多个探针中。在一些情况下，相同的荧光团可包括在复合信号所代表的每个靶的探针中。
每个探针可以包括核酸（例如，寡核苷酸）和至少一个荧光团。具有不同的寡核苷酸序列和/或不同的荧光团（或荧光团组合）的不同的探针可以用于产生信号的至少两个不同的组成部分。可选地或另外，相同的探针可以用作至少复合信号所代表的至少两个不同的靶（例如，见实例3-5）的指示器。在一些情况下，相同的探针可用作复合信号所代表的每个靶的指示器。
对于信号或相应的波长区域所代表的反应/分析/靶，从每个分块检测的复合信号和分块本身可以被分类为阳性的或阴性的。分类可以基于信号的强度。如果信号/分块被分类为阳性，则信号所代表的反应/分析中的至少一个被视为已经发生，且信号所代表的靶的至少一个的至少一个拷贝被视为存在于分块中。相反，如果信号/分块被分类为阴性，则信号所代表的反应/分析中没有一个被视作已经发生，且没有信号所代表的任何靶的拷贝被视作存在于分块中。
复合信号共同允许通过每个检测通道中的靶的不同组合的表示来估计靶浓度。因此，当每个靶存在而在分块中没有任何其它靶时，每个靶可 以在波长区域中产生唯一靶识别特征。例如，一些靶如果单独存在于分块中则可选择性地改变仅仅一个波长区域的信号强度。其它的靶如果单独存在于分块中则可选择性地改变波长区域中的两个的唯一组合的信号强度，又一些其它靶可以选择性地改变波长区域中的三个的唯一组合的信号强度，依此类推，任选地达到波长区域/检测通道的数量。
分块的分数可以具有不同靶的同时存在，其中这些分块中的每一个在相同的单独分块中含有两个或多个靶中的每一个的拷贝。此外，这些分块中的每个都可以包含两个或多个不同靶中的每一个的拷贝，对于特定分块，不同靶可以共同产生与不存在于该分块中的靶的识别特征相同的识别特征。然而，含有两个或多个不同靶的分块的分数通过在稀释状态中工作可以（或可以不）被保持为相对低，稀释状态比如是在分块形成时，小于分块的二分之一、五分之一或十分之一等包含多于一个靶分子。在任何情况下，如下所述，浓度的适当估计可以考虑代表同一靶或不同靶的两个或多个靶分子在相同的单独分块中的出现。可选地，如果在足够稀释的状态中工作，对于浓度的期望准确度，每分块两个或多个靶分子的出现可能足够稀疏以忽略。
可以针对每一信号确定阳性的分块的数量，这在50被指示。例如，可以单独地针对每个信号或通道确定（例如，计数）仅对于每个特定的复合信号或相应的波长区域/检测通道为阳性的分块的数量（即，每个通道的数量）。另外，可以为信号或通道的每个组合单独地确定（例如，计数）只对于复合信号或相应的波长区域的每个特定的组合（或至少一个组合或两个或多个组合中的每一个）为阳性的分块的数量（即，每一组合的数量，且特别是对应于特定靶的每个组合）。
可以确定对于单独每个信号和对于每个信号组合为阳性的分块的不同分数。每个信号或信号组合的分数可以通过使在50确定的信号/组合的分块的数量除以信号被检测到的分块的总数目来确定。可以对分块的总数量进行计数或估计。
可以计算每个靶的水平，这在52被指示。该水平可以是平均水平，例如，每分块靶的分子的平均浓度。通常，如果从在波长区域中的R个信 号检测到分块，则可以计算出超过R个靶（例如，多达2R-1个靶）中的每一个的平均水平。每个靶的水平可以基于对于单独每个信号和信号组合为阳性的分块的相应数量而计算。计算可以基于在分块中有泊松分布的每个靶的拷贝。例如可以通过找到对一系列联立方程（可互换地称为一组联立方程）的解来计算浓度，每个方程具有相同的变量。联立方程可以是线性方程。可选地或另外，每个方程可以含有至少2R-1个变量。可以通过也称为数值近似的数值分析来找到解。计算平均靶水平的另外方面在本说明书中的其它地方例如在实例6和7中被描述。
图2示出了用于执行图1的数字分析的示例性系统60。系统60可包括分割组件例如液滴生成器62（“DG”）、热孵育组件例如热循环仪64（“TC”）、检测组件（检测器）66（“DET”）以及数据处理组件（处理器）68（“PROC”）或其任何组合等。数据处理组件可以是控制器或可以包括在控制器中，该控制器与组件通信并控制组件的任何适当的组合的操作。组件之间的箭头指示任选的移动或传送，例如流体（例如，乳液的连续相）和/或分块（例如，液滴）或信号/数据的移动或传送。组件的任何合适的组合可以操作地相互连接，和/或组件中的一个或多个可以不连接至其它组件，使得材料/数据被手动传送。
系统60可以如下操作。液滴生成器62可以形成布置于载体流体例如连续相中的液滴。液滴可使用热循环仪64热循环以促进液滴中的靶的扩增。复合信号可以使用检测器66从液滴中被检测到。信号可由处理器68处理来计算靶的水平。
可以适合于本文所公开的方法和系统的样品制备、液滴产生、分析，试剂、反应、热循环和检测和数据处理等的另外的方面在下面和在交叉引用下在上面所列出的文档中被描述，这些文档通过引用被并入本文，特别是2010年7月8日公布的美国专利申请号2010/0173394A1；2011年9月29日公开的PCT专利申请公开号WO2011/120006A1；2011年9月29日公开的PCT专利申请公开号WO2011/120024A1；以及2011年11月1日提交的美国专利申请号13/287,120。
II.实例
本章提供了涉及用于执行多重数字分析的方法和合成物的本公开的所选择的方面和实施方式。方面和实施方式为了举例说明而被包括，而不是用来限制或限定本公开的整个范围。
实例1.使用专用信号和复合信号的数字扩增分析
本实例比较和对比利用（i）两个靶的一对专用信号（参见附图3-5）和（ii）三个靶的一对复合信号（见附图6-8）的示例性数字扩增分析。这里所解释的原理可以扩展到2R-1个靶的R个信号。
图3示出了一对核酸靶80、82（“靶1”和“靶2”）和相应的探针84、86（“探针1”和“探针2”），探针可以用来产生专用信号用于在数字扩增分析中的每个靶的扩增。每个探针可以包括寡核苷酸88、90、荧光团92、94和淬灭剂96。荧光团和猝灭剂相关于和/或连接于寡核苷酸，例如共价连接。探针此外或可选地可以包括用于DNA双链体的小沟的结合部分（小沟结合剂），DNA双链体可接合到寡核苷酸，且可起作用来允许在探针中使用的更短的寡核苷酸。探针可以为TaqMan探针、分子信标探针、蝎形探针和锁核酸探针等。
通过主要或至少实质上专门杂交到两个靶中的仅仅一个的扩增所产生的扩增子，每个寡核苷酸可以提供靶特异性。在98示意性地示出了寡核苷酸杂交到其相应的靶/扩增子。
荧光团92和94可以光学地彼此区别开，如每个荧光团的不同的阴影图案示意性示出的。例如，荧光团可以具有不同的吸收光谱和/或吸收最大值，和/或不同的发射光谱和/或发射最大值。用于检测的波长区域的适当选择允许荧光团被区分。换句话说，用于每个波长区域的激发光的波长或波长带和/或由传感器接收和感测的用于波长区域的所发射的光的波长或波长带在检测通道中提供了来自荧光团中的仅仅一个的光的选择性检测。可以是适当的示例性的荧光团包括FAM、VIC、HEX、ROX、TAMRA和JOE等。
淬灭剂96配置成以接近度相关的方式淬灭荧光团92或94所产生的信号。当相关的寡核苷酸88或90结合到扩增的靶以增大荧光团和猝灭剂 之间的分离距离时或者当在靶扩增期间探针被割开时，等等，从荧光团检测的光可以增加。在一些情况下，猝灭剂可以用能够使用荧光团92或94进行能量转移的荧光团代替或补充。
图4示出了在液滴中执行的对靶1和靶2的示例性数字扩增分析中收集的数据的一对示例性曲线102、104。每个曲线标出专用信号106（“信号1”）或信号108（“信号2”），其表示从相应的探针84、86（和/或其一个或多个改性（例如，分裂）产物）探测的光（见图3）。每个专用信号从在相同时间段内从含有液滴和流过通道的检查区域的流体流检测的光产生。信号1报告靶1是否存在于每个液滴中，且信号2报告靶2是否存在于每个靶中。特别是，如果信号1（或者信号2）的强度增加到高于阈值110，则靶1（或靶2）被视为在对应液滴中存在（和被扩增）。在本图中，每个液滴——不管对于每个靶是阴性的还是阳性的——产生在基线信号之上的信号强度的增加，这形成可辨认的峰值112。相应地，每个信号的强度可以随着液滴的存在或不存在和随着对应靶的存在或不存在而变化。
在液滴中，在这里，每个靶出现在大约0.2的平均水平（或频率）处。换句话说，每个靶平均每五个液滴被扩增和检测大约一次。因此，包含两个靶的液滴的预期频率是两个液滴频率的乘积，或约0.04（每25个液滴中有1个）。与这种频率相一致的，对这两个靶均为阳性的液滴在此处分析的二十个液滴上仅出现一次，并由在曲线102、104中的在114围绕液滴的信号峰值延伸的虚线框指示。
图5示意性表示在与图4的液滴信号峰值相对应并以与图4的液滴信号峰值相同的顺序的一组液滴116中的靶1和2的分布。对于信号1为阳性的液滴比如在118处指示的液滴根据荧光团92被加阴影，而对于信号2为阳性的液滴比如在120处指示的液滴根据荧光团94被加阴影（见图3）。包含靶1和靶2的双阳性液滴122被加双阴影并由虚线框114指示。
图6分别示出了三个靶80、82和140以及对应的示例性探针84、86和142，这些探针可以用来在数字扩增分析中产生三个靶的一对复合信号。靶和探针中的两个，即，靶80和82（靶1和靶2）和探针84和86（探针1和探针2）与图3-5所示的和所使用的靶和探针相同。靶140（靶3）和 其对应的探针142（探针3）可被引入到图3-5的多重分析中以增加多重化的水平和从分析中可提取的靶信息的量，而不增加探测通道的数量。
靶3的扩增由探针3报告。探针包括相对于靶1和2特别杂交到靶3（和/或其扩增子）的寡核苷酸144。探针可以使用单独地存在于用于报告相应的靶1和靶2的扩增的探针1和探针2中的相同的荧光团（92、94）被双标记。三个靶的探针可被选择成允许在仅两个检测通道而不是三个检测通道中的靶扩增的检测，三个检测通道对每个靶的专用检测通道的使用是必需的。实例2-5描述可适于增加的多重化的水平的其它示例性探针配置。
图7示出了可在一对波长区域/检测通道中检测到的一对复合信号156和158的一对示例性曲线152和154。任意表示为α和β的复合信号表示在液滴中执行的数字扩增分析中从图6的三个探针检测到的光。每个复合信号从在相同的时间内从含有液滴的流体流检测到的光产生。为了简化表示，靶1和靶2以相同频率且在相同液滴中存在，如在图4和5中的。
每个复合信号α或β（156或158）表示一对靶。信号α（曲线152）具有每个液滴的强度，其指示液滴对于第一对靶，即，靶1和靶3中的至少一个成员是阳性的还是阴性的。信号β（曲线154）具有每个液滴的强度，其指示液滴对于不同的第二对靶，即，靶2和靶3中的至少一个成员是阳性的或阴性的。因此，所分析的每个复合信号可能独自不提供关于这对靶的给定成员多么频繁地存在于液滴中的信息。
组合地分析的复合信号提供关于靶频率的附加信息，该频率不能从相互隔离的复合信号中推导。当每个靶存在而在液滴中不存在其它靶时，每个靶单独地产生不同于每个其它靶的识别特征的信号识别特征。在液滴中的靶1的识别特征在160被指示：对信号α为阳性而对信号β为阴性。在液滴中的靶2的识别特征在162被指示：对信号α为阴性，而对信号β为阳性。此外，在液滴中的靶3的识别特征在164由虚线框概述：对信号α和信号β均为阳性。最后，在液滴中的靶1、2和3均不存在的识别特征在166被指示：对信号α和信号β均为阴性。
图8示意性地表示与图7的液滴信号峰值相对应的并以与图7的液滴 信号峰值相同的顺序的一组液滴168中的靶1、2和3的分布。仅对于信号α为阳性的单阳性液滴比如在118指示的液滴根据荧光团92被加阴影，对于信号β为阳性的液滴例如在120指示的液滴根据荧光团94被加阴影（见图6）。每个双阳性液滴170被加双阴影并由虚线框164指示。
在160和162指示的单阳性识别特征将相应的液滴118、120明确地识别为分别包含靶1或靶2的至少一个拷贝和没有靶3的拷贝。相应地，每种类型的单阳性液滴的数量可以以与液滴的总数的比率用于计算靶1和靶2的平均水平。然而，如果液滴含有多个靶分子，则这种估计可能不足够精确，因为估计忽略含有靶1和/或靶2但具有靶3的识别特征的任何液滴。这些液滴可以产生相同的靶3的识别特征，同时包含靶1+2、靶1+3或靶2+3。如果每个靶的浓度足够低，则含有至少两个不同靶的液滴的频率可以被忽略和/或忽视。在这里，靶1、2和3的浓度高到足以以每20个液滴平均仅仅产生具有两个靶1和2的约一个液滴（见图4和5）。相应地，双阳性液滴170中的一个预期包含这两个靶1和2，而另外两个双阳性液滴预期包含靶3。
不必知道每个双阳性液滴的靶组成。替代地，知道具有每个靶识别特征的液滴的频率就足够了。然后使用泊松统计来计算每个靶的平均水平。在一些情况下可通过例如数字地找到对一系列联立方程的解以获得最佳拟合或通过封闭式方法等来执行计算。
实例2.复合信号的示例性靶特异性探针
这个实例描述了附加的示例性靶特异性探针，其可以在任何适当的多重数字分析中被利用；参见附图9A、9B和10。这里所解释的原理可以扩展到任意数目的信号和/或靶。
图9A、9B和10示出了图6的第三靶140和探针180、182（探针3A和3B）的其它示例性探针配置，每个探针对靶3（和/或其扩增子）是特异性的。探针3A和3B可以一起使用来取代图6的探针3，并结合图6的探针1和探针2在数字扩增分析中仅产生靶1到3的一对复合信号。
一个探针（例如，探针3A）可以包括荧光团92，而另一个探针（例 如，探针3B）可以包括荧光团94。相应地，探针3A所发射的光可以在与来自图6的探针1的光相同的检测通道中被检测，而探针3B所发射的光可以在与探针2相同的检测通道中被检测。
图9A和9B示出了特别结合到靶3的不同位置的探针3A和3B。探针可以结合到在靶的同一条链上的不重叠的（或只部分重叠的）位置（图9A）。可选地，探针可以结合到靶3的相对链（图9B）。
图10示出了能够结合到靶3（和/或其扩增子）的相同位置的探针3A和3B。每个探针可含有相同的寡核苷酸144，并因此不同仅是连接到寡核苷酸144的特定的荧光团（92或94）。这个实例的探针可以以任何适当的比率或任何一组不同的比率混合用于多重分析。
实例3.复合信号的示例性加尾引物和共享探针
该实例描述了能够产生复合信号的示例性共享探针和形成共享探针的结合位置的示例性加尾引物；见图11。这里所解释的原理可以扩展到任意合适数目的复合信号和/或靶。
图11示出了在数字扩增分析中的三个靶80、82和140（即，图6的靶1至3）和相应的引物，引物使得仅用两个探针，即，探针190（探针A）和探针192（探针B）就能够分析三个靶。探针A和探针B可以包括相应的荧光团和猝灭剂（例如，见图3）。
靶1可以用一对正向和反向引物194、196扩增。正向引物194可以是具有与靶1的区域互补的3结合部分198和不与靶1的区域互补的5′尾部分200的加尾引物。尾部可以将探针A的结合位置引入到在202由虚线指示的所产生的扩增子中，使得探针A（如图6的探针1）可报告靶1的扩增。
靶2可以用一对正向和反向引物204、206扩增。反向引物206可以与靶1的正向引物194类似地被构造，3′结合部分与靶2的区域互补，而5′尾部分207则不。尾部分可以将探针B的结合位置引入到所产生的扩增子中，使得探针B（如图6的探针2）可以报告靶2的扩增。
靶3可以使用一对正向和反向引物208、210扩增。两个引物都可以 与正向引物194类似地被构造，3′结合部分与靶3的区域互补，而5′尾部分则不。引物208和210的尾部分200和207可以将探针A和B的相应的结合位置引入到扩增产物中，使得探针A和探针B（如图6的探针3）的组合报告靶3的扩增。
实例4.启用共享探针的示例性连接策略
该实例描述一种示例性连接策略以实现共享探针的使用；见图12。这里所解释的原理可以扩展到任何数量的复合信号和/或靶。
图12示出了图6的靶3（在140）和另一种示例性探针和引物配置，该配置能够在数字扩增分析中仅使用图6的探针1和2（在84和86）分析图6的靶1至3。下面示出的连接、延伸和消化步骤可以以任何适当的顺序和在提供靶3的样本分离成分块之前或之后被执行。
模板220（和/或其互补链和/或扩增子）可以设计成结合探针1和2中的每一个。
模板220还可以设计成经由模板的相对的端部区域222、224结合到靶3的相邻区域。（模板可以被描述为一种分子倒置“探针”，但通常不连接到荧光团）。模板的5′和3′末端在结合到靶3时可以通过连接而彼此直接连接或可以在模板的对齐的5′和3′末端之间形成一个或多个核苷酸的间隙226。在模板连接以形成闭环前，间隙可以通过延伸模板的3′末端来闭合，同时结合于靶3。在连接和可选的延伸之后，未能连接（并且因此没有发现用于结合的靶3的拷贝）的模板的拷贝可能被外切核酸酶降解。模板的连接的拷贝可以抵抗这种降解，使得连接的模板分子的数目对应于靶3分子的数目。
连接的模板220（和/或其互补链）可以提供用于结合至少一个引物228（或230）的一个或多个位置。引物可通过滚环扩增来扩增连接的模板。可选地或另外，一对引物228、230（正向和反向）可以被包括以产生一系列扩增。在一些实施方式中，在用引物228、230扩增之前，连接的模板220可通过在预定位置232处的分裂来线性化。在任何情况下，分块中的靶3的存在都由该实施方式中的探针1和探针2的组合报告。
实例5.具有多靶特异性的示例性共享探针
该实例描述了示例性共享探针，每一个共享探针都能够结合到两个不同靶的序列区域；参见图13。这里所解释的原理可以扩展到任何数目的复合信号和/或靶。
图13示出了由具有多靶特异性的探针结合的靶80、82、140（即，靶1-3）。特别是，探针240（探针1/3）包括能够结合到存在于靶1中的序列区域和存在于靶3中的另一序列区域的寡核苷酸242。另外，另一探针244（探针2/3）包括能够结合到存在于靶2中的序列区域和存在于靶3中的另一序列区域的寡核苷酸246。
实例6.在数字扩增中增加多重化水平而没有额外的检测通道
这个实例描述了一种用于增加多重数字扩增分析的多重化水平的示例性方法。
A.介绍
同时测量数字扩增系统的每个分块内的多个靶（多重化）的能力通常被检测方法限制。通常人们测量荧光来将分块分类为阳性（如果所测量的荧光高）或阴性（如果所测量的荧光低）。一些化学物质例如TaqMan允许通过利用使用不同的染料标记的靶特异性探针来同时测量几个靶。如果检测器可以测量由R个不同的染料发射的荧光，那么数字扩增系统能够有效地测量R个不同的靶。通常，能够检测更多的颜色的仪器比那些能够检测较少的颜色的仪器更昂贵。增加可检测的染料的数目是昂贵的，并且超出某个数目是不切实际的。另一方面，许多应用——尤其是其中样品被限制——可极大地受益于更高程度的多重化。
该实例提出了一种方法，给出能够检测多种颜色的仪器，该方法可在不需要对仪器的检测光学器件的任何改变的情况下急剧地增加同时测量的靶的数目。设计分析的标准方法是，根据从具有单一染料的单个探针产生的荧光评估给定的靶。因此，如果仪器能够检测两种颜色，例如从染料FAM和VIC发射的光，我们通过用阳性FAM信号对分块的数目计数来测量一个靶的浓度，并通过用阳性VIC信号对分块的数目计数来测量另一个 靶的浓度。
人们可以设计同时在多个通道上产生荧光的分析。如果在具有大量分块的数字扩增平台上被处理，那么这些分析可以与单通道分析一起被多重化，并且可以通过用两个通道上的荧光对分块的数目计数来测量。
B.使用两种颜色FAM-VIC检测的实例
假定我们正在观看两个不相关的位点（靶1和靶2）并给出某个数目的仅FAM阳性液滴以及某个数目的仅VIC阳性液滴，我们可估计出我们预期多少FAM-VIC双阳性液滴。如果我们在低浓度下操作，该数目应该很小并可以以简单的方式被计算出。
如果我们设立了第三种分析（靶3）使得它具有两个附加探针—一个用FAM标记而一个用VIC标记，则我们可按照与预期相比我们有多少过量的FAM-VIC双阳性液滴来估计该第三靶位点的浓度。这将减小总精度，但不多，且基本上根本不减小，如果我们在稀释状态（即，液滴的总数目远大于阳性液滴的数目）下操作。以下是可以用来确定过量的FAM-VIC双阳性液滴（或其它分块）的浓度的算法的实例。
使用相同染料标记的多个探针将增加阴性液滴的荧光，这可能在极端情况下提出挑战——如果阴性液滴的荧光开始接近阳性液滴的荧光。该挑战可通过使用足够可靠的分析来被有效地处理。人们还可以使用公共探针（例如，参见实例3-5）并完全避免阴性荧光的升高。对于上述实例，我们可以考虑通过利用加尾引物或锁核酸探针来使用靶1和靶3的公共FAM探针和靶2和靶3的公共VIC探针。
C.额外的考虑因素
当人们使用四种或更多种颜色时，人们从该方法中获得更大的优势。如果人们有四种颜色可供选择，那么有两种颜色的六种组合。与单独颜色一起，这将给出总共十个指示器。如果我们继续并使用一组三种颜色，我们将获得13个指示器。
使用该多色方案的优点随着较高数目的分块变得更加更明显。因为这个原因，当结合数字扩增例如液滴中的数字PCR的最近的实现时，该方法 具有特别效用，其中可以以容易的和成本有效的方式来产生数千或数百万个分块。
可采用几种分析方案同时以多种颜色来评估靶。人们可以设计多标记探针，例如单个探针可以用在相同分子上的（例如，参见图6）上的FAM和VIC来标记。作为另一个实例，相同的寡核苷酸可以单独地用FAM和VIC标记以产生相同探针的FAM标记的版本和VIC标记的版本，并且然后这两种版本混合（例如，参见图9B）。在其它情况下，例如对于TaqMan分析，两个探针可以设计成结合到相同的扩增子链的不同区域（例如，参见图9A）。可选地，探针可以结合到扩增子的相对链（例如，参见图10），其可以将染料定位成远离猝灭剂，并且便于从结合探针增加荧光。
该方法是一般的，并且可以与一系列化学物质——包括连接链式反应、分子信标、蝎形探针、分子倒置探针等——一起使用。
D.用于估计过量的FAM-VIC液滴的数学方法
以下是可用来估计联合的FAM-VIC种类的浓度的算法的实例（例如，图6-8的靶3）。
1.得到FAM与VIC计数的2x2表。
2.计算不同的FAM和联合的FAM-VIC的浓度，好像有1个种类一样。
3.计算不同的VIC和联合的FAM-VIC的浓度，好像有1个种类一样。
4.试验联合的FAM-VIC的不同浓度（从其可以发现不同的FAM和不同的VIC的浓度），并找出概率表（表1）与观察到的计数的最佳拟合。
表1
 FAM-FAM+VIC+（1-f）v（1-c）1–其它的总和VIC-（1-f）（1-v）（1-c）f(1-v）（1-c）
E.算法的MATLAB实现
下面是算法的MATLAB实现的实例。注意，该算法可以以简单的方式扩展到高级多重法。
％考虑DNA片段的三种类型：FAM-Vic一起、Fam片段、Vic片段。我们观察一些概率（在FAM-VIC综合图表中的计数），并且目的是推断出浓度。首先让我们向前进行。给出浓度，计算计数。然后完成反向，我们简单地试验不同的浓度值并选择给出实际计数的一个浓度值。
N=20000；
A=10000；
B=20000；
AB=10000；%连接在一起
cA=A/N；
cB=B/N；
cAB=AB/N；
fprintf（1，'%f%f%f\n'，cAB，cA，cB）；
pA=1-exp（-cA）；
pB=1-exp（-cB）；
pAB=1-exp（-cAB）；
%A是综合图表中的X，B是综合图表中的Y
p（2，1）=（1-pA）*（1-pB）*（1-pAB）；%左下方
p（2，2）=pA*（1-pB）*（1-pAB）；%右下方
p（1，1）=（1-pA）*pB*（1-pAB）；%左上方
p（1，2）=1-p（2，1）-p（2，2）-p（1，1）；%右上方
disp（round（p*N））；
%也直接计算临界值
cAorAB=（A+AB）/N；%=c_A+c_AB；
cBorAB=（B+AB）/N；%=c_B+c_AB；
pAorAB=1-exp（-cAorAB）；%也可以从p计算
pBorAB=1-exp（-cBorAB）；
%反向
H=p*N；%我们得到一些命中项
%H=[08000；20000]；
%计算概率
estN=sum（H（:））；
i_p=H/estN；
i_pAorAB=i_p（1，2）+i_p（2，2）；
i_pBorAB=i_p（1，1）+i_p（1，2）；
i_cAorAB=-log（1-i_pAorAB）；
i_cBorAB=-log（1-i_pBorAB）；
maxVal=min（i_cAorAB，i_cBorAB）；
delta=maxVal/1000；
errArr=[]；
gcABArr=[]；
forgcAB=0:delta:maxVal
gcA=i_cAorAB-gcAB；
gcB=i_cBorAB-gcAB；
gpA=1-exp（-gcA）；
gpB=1-exp（-gcB）；
gpAB=1-exp（-gcAB）；
gp（2，1）=（1-gpA）*（1-gpB）*（1-gpAB）；%左下方
gp（2，2）=gpA*（1-gpB）*（1-gpAB）；%右下方
gp（1，1）=（1-gpA）*gpB*（1-gpAB）；%左上方
gp（1，2）=1-gp（2，1）-gp（2，2）-gp（1，1）；%右上方
gH=gp*estN；
err=sqrt（sum（（H（:）-gH（:））.^2））；
errArr=[errArr；err]；
gcABArr=[gcABArr；gcAB]；
end
figure，plot（gcABArr，errArr）；
minidx=find（errArr==min（errArr（:）））；
minidx=minidx（1）；
estAB=gcABArr（minidx）；
estA=i_cAorAB-estAB；
estB=i_cBorAB-estAB；
fprintf（1，'%f%f%f\n'，estAB，estA，estB）；
gpA=1-exp（-estA）；
gpB=1-exp（-estB）；
gpAB=1-exp（-estAB）；
gp（2，1）=（1-gpA）*（1-gpB）*（1-gpAB）；%左下方
gp（2，2）=gpA*（1-gpB）*（1-gpAB）；%右下方
gp（1，1）=（1-gpA）*gpB*（1-gpAB）；%左上方
gp（1，2）=1-gp（2，1）-gp（2，2）-gp（1，1）；%右上方
gH=gp*estN；
disp（round（gH））；
%使用仿真确认结果
numMolA=round（estA*estN）；
numMolB=round（estB*estN）；
numMolAB=round（estAB*estN）；
A=unique（randsample（estN，numMolA，1））；
B=unique（randsample（estN，numMolB，1））；
AB=unique（randsample（estN，numMolAB，1））；
U=1:estN；
notA=setdiff（U，A）；
notB=setdiff（U，B）；
notAB=setdiff（U，AB）；
AorBorAB=union（A，union（B，AB））；
none=setdiff（U，AorBorAB）；
simcount（2，1）=length（none）；
simcount（2，2）=length（intersect（A，intersect（notB，notAB）））；
simcount（1，1）=length（intersect（B，intersect（notA，notAB）））；
simcount（1，2）=length（AorBorAB）-simcount（2，2）-simcount（1，1）；
disp（simcount）；
实例7.用于计算DNA片段或用于数字扩增多重化的算法
该实例描述了一种用来计算DNA片段的水平和/或多重扩增分析中的靶的水平的示例性算法。
A.介绍
1.完全成碎片的靶
考虑分别对应于两种染料FAM和VIC的两个DNA靶T1和T2。让T1和T2总是在分离的DNA片段上，如图14中示意性所示的。让具有T1和T2靶的DNA片段的数目分别为M1和M2。
让FAM和VIC阳性分块的计数分别为N1和N2。注意，N1和N2将 分别小于M1和M2，因为在分块中可以有多个DNA片段。让分块的总数目为N。我们将把数字扩增分块简单地称为分块。在这种情况下，我们可预期看到列于表2中的分块的计数。
表2
 VIC阴性VIC阳性总数FAM阳性N1·（N-N2）/NN1·N2/NN1FAM阴性（N-N1）·（N-N2）/N（N-N1）·N2/NN-N1总数N-N2N2N
如果我们将看到分块是FAM阳性的概率表示为p1=N1/N，并且将看到分块是VIC阳性的概率表示为p2=N2/N，那么概率表由表3给出。
表3
 VIC阴性VIC阳性概率FAM阳性p1·（1-p2）p1·p2p1FAM阴性（1-p1）·（1-p2）（1-p1）·p21-p1概率1-p2p21
这种情况下，我们可以说100%片段存在。
我们可以如下分别计算T1和T2分子的数目M1和M2，其中（其中log=loge）：
M1=-Nlog（1–p1）
M2=-Nlog（1–p2）
（给出N个数字分块，其中P是阳性的，分子的数目是
M=-Nlog（1–P/N）.）
2.没有片段
现在考虑另一个极端情况。靶T1和T2总是被发现一起在相同的DNA片段上（例如，见图15）。它们被连接，或许因为它们的位点在染色体的 相同部分上是彼此非常接近的，并且染色体的片段在DNA隔离期间不分离位置。因此，N1=N2。预期计数和概率分别列于表4和5中。
表4
 VIC阴性VIC阳性总数FAM阳性0N1N1FAM阴性N-N10N–N1总数N–N1N1N
表5
 VIC阴性VIC阳性概率FAM阳性0p1p1FAM阴性（1-p1）01-p1概率1-p1p11
在这种情况下，我们可以说0%片段存在。
我们可以如下计算出T1和T2分子的数目，其中p1=N1/N：
M1=-Nlog（1–p1）
M2=-Nlog（1–p1）
3.部分片段
在中间的情况下，其中靶一起在一些片段上，但也会在分离的片段上，然后我们有部分片段（例如，见图16）。
假设我们有连接的T1和T2片段的M3个分子、分离的T1片段的M1个分子和分离的T2片段的M2个分子。
我们可以做出分块的计数的表（表6）。
表6
 VIC阴性VIC阳性总数FAM阳性N01N11N1FAM阴性N00N10N–N1总数N–N2N2N
4.问题陈述
我们如何可以发现分子的数目M1、M2和M3，并从而得到片段的大小？例如，如果M1=M2=M3，那么我们可以说有50%的片段，因为50%的连接的分子被分割成分离的片段，而50%保持完整。
B.使用很少的颜色多重化对许多靶的PCR
我们有提供对上述问题的解决方案的算法，并且有对该算法的另一个有趣的应用。使用这个算法和通过使用靶T1的FAM探针、靶T2的VIC探针、以及靶T3的彼此靠近放置的FAM和VIC探针，我们可以通过使用两种颜色实现3个靶的多重化。基本上，我们得到第三种颜色用于“自由”使用该算法。
现在考虑如果有3种染料的情况。因此，我们将有8个观察到的计数的2x2x2表。
有七种不同种类的靶：T1、T2、T3、T12、T23、T13和T123。在此处，例如T12意指被扩增以产生由染料1和染料2探针结合的扩增子的靶，并且T123意指被扩增以产生由含有全部三种染料的一个或多个探针结合的扩增子的靶，并且对于其它的靶是同样的。
如果我们有4种染料，那么我们将有24=16个计数，并且我们现在可以多重化24-1=15个靶基因的定量。一般，使用R种颜色，我们有2R个观察到的计数，并且我们可以有2R-1个靶。
C.对2种染料和3个靶的解决方案
假设我们给出列于表7中的计数。
表7
 VIC阴性VIC阳性总数FAM阳性N01N11N1FAM阴性N00N10N–N1总数N–N2N2N
考虑以下三种情况：
1.我们去掉VIC，好像VIC根本无法被看到一样。
2.我们去掉FAM，好像FAM根本无法被看到一样。
3.我们考虑FAM和VIC，好像它们仅是一种颜色。
我们将有以下的三种观察：
1.去掉VIC：我们将能够一起且无差别地看到T1或T12，好像有一个靶一样。它给出了T1和T12的分子的总数，好像有一个靶种类一样。
2.去掉FAM：我们将能够无差别地对T2或T12计数，好像有一个靶一样。它给出了T2和T12的分子的总数，好像有一个靶种类一样。
3.无差别地考虑FAM和VIC：我们将能够无差别地对T1、T2或T12计数。它给出了T1、T2和T12的分子的总数，好像有一个靶种类一样。
这允许我们列出3个未知数的3个方程。我们可以以表格的形式示出这三种情况。
表8


三个未知数M1、M2和M12的三个线性方程是：
101011111M1M2M12=M1or12M2or12M1or2or12=-Nlog(1-N1N)-Nlog(1-N2N)-Nlog(1-N01+N10+N11N)]]>
我们对上述方程求解以得到M1、M2和M12的值。
然后我们可以如下计算以%的片段的大小：
M=（M1+M2）/2
F=M/（M+M12）*100
D.算法步骤
现在我们使用表9的输入清楚地写下算法的步骤。
表9
 VIC阴性VIC阳性总数FAM阳性N11N12N1FAM阴性N21N22N–N1总数N–N2N2N
算法：
步骤1.计算三个实体：
M1or12=-N.log（1–N1/N）
M2or12=-N.log（1–N2/N）
M1or2or12=-N.log（1–（N01+N10+N11）/N）
步骤2.对以下线性方程求解：
101011111M1M2M12=M1or12M2or12M1or2or12=-Nlog(1-N1N)-Nlog(1-N2N)-Nlog(1-N01+N10+N11N)]]>
步骤3.计算片段的大小。
M=（M1+M2）/2
F=M/（M+M12）*100
步骤4.根据浓度和阳性计数的预期数目计算置信区间。为了计算F的置信区间，我们注意到它是两个随机变量的比。随后，我们应用技术来估计F的两个随机变量的比的置信区间。
输出是M1、M2和F以及它们的置信区间。
E.可选的解决方案的概述
现在我们依据客观标准的优化提出对部分片段的问题的解决方案。首先让我们做出以下的表格。根据在分块中我们有什么类型的分子，我们将有分块的相应的FAM和VIC颜色。
表10将分子映射到分块颜色。
表10


假设我们做出M1、M2和M12的“猜测”。我们可使用逆方程来计算分块具有T1、T2或T12靶的拷贝的概率：
p12=1–exp（-M12/N）
p1=1–exp（-M1/N）
p2=1–exp（-M2/N）.
根据这些概率，我们可以计算如表11所示的预测的计数。
表11

上述的概率可以使用表10被填写，表10将分子的存在映射到分块颜色。
如果我们的“猜测”是正确的，那么预测的计数将与我们预期的计数紧密地“匹配”。因此，在上述客观标准下的需要被最小化的优化算法也可以用来解决该问题。
M1、M2、M12=最佳猜测=预测的计数和实际计数的最小偏差。
然后我们可以如下计算以%的片段的大小：
M=（M1+M2）/2
F=M/（M+M12）*100。
F.对3种染料和7个靶的解决方案
为了解决更多数目的染料的问题，我们需要更多的方程，因为有更多的未知数。对于3种染料和7个靶，我们需要7个方程来找到这7个靶的浓度。
我们有表12，其具有分块的计数的23=8行，取决于哪些染料是阳性的。
用D1、D2和D3表示这三种染料。
表12

考虑表13
表13

*注意，对于第5行，我们也可以检测{T2、T23}或{T12、T123}，且对于第6行，我们可以检测{T3、T23}，而对于第7行，我们可以检测{T3、T13}和{T23、T123}。这种选择并不重要，且都导致相同的结果。
在行5、6和7中我们做出3个递归调用。
例如，在行5中，我们实际上求解2种染料D1和D2、具有3个靶的情况：{T1，T13}作为一个靶，{T2，T23}作为第二个靶，{T12，T123}作为第三个连接的靶。
类似地，在行6和7中，我们做出递归调用来求解2种染料和3个靶的比较简单的问题。
方程的系统看起来如下：

上述线性方程的系统可以被求解以找到7个靶的浓度。
G.R种染料和2R-1个靶
现在我们给出将该算法一般化为任意数目的染料的步骤。这是递归算法。由于我们有对当R=2时的情况的解决方案，我们可通过递归来解出任何数目的R。
输入：
对于R种染料，我们得到对分块中的颜色的存在或不存在的所有可能组合的具有2R行的分块的计数的表。
算法：
步骤1.建立2R–1个线性方程的系统。为了获得这些方程，考虑使一些颜色不可见的不同方式。也考虑当所有的颜色是不能区分的时的情况，其给出了第一行。可以表明，我们可以得到2R–1个靶浓度（未知数）的 2R–1个方程。当我们使某些颜色不可见时，然后我们将问题简化为具有较少的颜色的情况，其可以被递归地求解，一直至当有2种染料和3个靶时的情况。
步骤2.对方程求解。
步骤3.根据浓度和阳性计数的预期的数目来计算置信区间。
输出：
2R–1个靶的浓度连同置信区间。
实例8.多标记探针
这个实例描述了示例性的多标记探针和在多重数字扩增分析中使用探针的方法；见图17-22。多标记探针可以用于在第一章中和实例6和7中描述的基于颜色的多重分析。可选地或另外，多标记探针可以用于如在于2011年7月12日提交的美国临时专利申请序列号61/507,082和于2011年7月20日提交的美国临时专利申请序列号61/510,013中描述的基于强度的多重化，这些专利申请通过引用被引入本文。
典型的5'核酸酶分析（TaqMan）探针具有单个荧光团和猝灭剂或两个荧光体，其中第二个荧光体用来通过FRET（例如，TAMRA“猝灭剂”）来猝灭第一个荧光团。荧光团和猝灭剂通常连接到寡核苷酸探针的5'-和3'-大部分碱基/核苷酸。
寡核苷酸合成化学物质允许荧光团被添加到探针的内部核苷酸/碱基。将多个荧光团连接到一个寡核苷酸探针允许产生更宽范围的探针，这可以用来增强多重化能力。将多个荧光体放置在一个探针上的能力允许因而得到的发射荧光被“调整”以实现比通过单个荧光团可能的更多的荧光识别特征。探针光谱通常是包括多个荧光团的复合的结果。对于可谐振或以其它方式相互作用的荧光团，荧光团的接近度和位置（内部或末端标记）将允许额外的调节可能性。多个荧光团（或猝灭剂）不同是不必要的。同一荧光体的多个分子的添加也可以允许在每探针基础上不同的荧光输出。对于一些应用，可能是有益的是，将猝灭剂放置在寡核苷酸的5'端上使得探针降解除去猝灭剂，但是留下连接在寡核苷酸的其余部分上的其它的荧光 团。通过这种方式，当猝灭剂被分裂掉时，从探针得到相同的信号，但是每个探针都可以具有不同的识别标记（例如，探针1-FAM、探针2-FAM+Cy3、探针3-FAM+HEX、探针4-FAM+FAM等）。
该方法也可应用于其它靶分子的多重化。尽管靶核酸的检测显然是极大地所关注的领域，但也可能将这个概念应用到其它类型的探针（例如，蛋白质靶的抗体探针）。
图17示出了未标记的寡核苷酸（A）和含有寡核苷酸的一组示例性多标记探针（B-G）的示意图。每个实心圆和空心圆分别表示连接到寡核苷酸的猝灭剂（也称为猝灭剂部分）和荧光团。F1至F4识别结构上不同的荧光团。寡核苷酸可以具有任何合适的长度，例如5至500、10至200、或15至100个核苷酸等。
图17的多标记探针如下：B）在相应的内部和3′端位置处具有5′猝灭剂和荧光团（F1和F2）的寡核苷酸；C）在3′和多个内部位置处具有5′猝灭剂部分和荧光团（F1至F4）的寡核苷酸；D）在3′和多个内部位置处具有5′猝灭剂部分和荧光团（3XF1、F2）的寡核苷酸；E）在3′和内部位置处具有5′猝灭剂部分和内部猝灭剂部分加上荧光团的寡核苷酸；F）在3′和内部位置处具有5′猝灭剂部分和荧光团的寡核苷酸，在荧光团间具有更大的间隔；以及G）在5′端和内部位置处具有荧光团且在3′端位置处具有猝灭剂的寡核苷酸。
图18示出了在靶扩增期间的探针分子的猝灭剂和荧光团的分离。模板分子被示为在存在示例性多标记探针分子（图17B）的情况下通过DNA聚合酶被复制（互补地）。A）聚合酶正在延伸位于探针结合位置上游的核酸链。B）聚合酶的5′核酸酶活性从探针除去5′-大部分核苷酸（在该实例中包括猝灭剂），允许猝灭剂和荧光团部分地分离。C）聚合酶继续从探针除去5′-核苷酸直到探针的结合变得不稳定，并且剩余的探针片段从模板链分离。多个荧光团仍然可以在探针片段中彼此连接，但与猝灭剂分离。
图19示出了液滴强度的示例性二维直方图，其示出了可以在使用单标记和双标记探针的组合执行的三个靶的多重数字扩增分析中获得的液滴簇，每一个探针都用FAM、VIC、或FAM和VIC标记。在此处由靶-3 阳性产生的液滴簇没有从靶1和靶2的双阳性液滴分离。
图20示出了可以在图19的分析中获得的液滴强度的另一示例性二维直方图，靶-3-阳性液滴的簇与靶-1+2-阳性液滴的簇之间以部分分辨率区分。
可以选择检测器光学器件尤其是激发光源和光学滤波器以优化簇的分离。例如，两个簇可在第一波长条件下可实质上重叠（难以分离），但在第二波长条件下实质上不重叠。具有分光光度计光栅或可互换的滤波器组的检测器可提供在波长选择方面的更大的灵活性。
图21示出了液滴强度的示例性二维直方图，其说明了可以在仅用多标记探针执行的数字扩增分析中获得的数据点的两个簇。
图22示出了液滴强度的另一示例性二维直方图，其说明了可以在如在图21中执行的数字扩增分析中获得的数据点的各种簇，但是除了多标记探针（用于测量靶3扩增）以外，分析使用一对单标记探针（用于测量靶1和靶2扩增）被补充。当结合不同水平的探针和/或结合具有在两个（或多个）检测通道中的不同的光谱重叠的不同的荧光体时，将多个荧光体放置在相同的寡核苷酸上可能是更有利的。图22的实例示出了与仅FAM和仅VIC探针相比具有略高一点的荧光的双荧光体探针，但是它可以更高或更低（或相同）。如果大约相同（或不同），本文所公开的基于颜色的多重化方法可以有利地用来确定平均靶水平。
几种化学物质可产生本文所公开的多标记探针，包括标记的脱氧核苷酸、点击化学物质和各种其它联结子化学物质。探针可以通过由寡核苷酸的供应商的定制合成产生。描述用于内部荧光团合并的示例性合成路线的参考文献在下面列出并通过引用被并入本文。
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实例9.所选择的实施方式
该实例描述了与组合使用信号进行数字分析有关的所选择的方面和实施方式，其没有限制地被呈现为一系列编号的段落。这些段落中的每一个都可以以任何合适的方式与一个或多个其它段落组合和/或与来自在本公开的其它地方的公开组合。下面的一些段落明确地参考并进一步限制其它的段落，没有限制地提供一些合适的组合的实例。
A1.一种执行数字分析的方法，该方法包括：（a）产生代表从样品的多个分块中的每一个检测的光的R个信号；和（b）基于R个信号如何在分块当中相对于彼此变化来估计在分块中的多于R个不同的靶的浓度。
B1.一种执行多于R个靶的数字分析的方法，该方法包括：（a）将样品分成分块；（b）产生代表从分块检测的光的R个信号；以及（c）基于R个信号估计在分块中的多于R个靶的浓度。
B2.段落B1的方法，其中R个信号中的至少一个独立于R个信号中的每个其它信号报告在每个分块中的靶的存在或不存在。
B3.段落B1或B2的方法，其中R个信号中的每个独立于R个信号中的每个其它信号报告在每个分块中的不同靶的存在或不存在。
B4.段落B1至B3中的任一项的方法，其中R个信号中的两个或多个的组合共同报告在每个分块中的R+1个靶的存在或不存在。
B5.段落B1至B4中的任一项的方法，还包括确定只对R个信号的每一个为阳性的分块的数量和对R个信号中的两个或多个的至少一个组合为阳性的分块的数目。
B6.段落B5的方法，其中估计浓度的步骤包括如果每一个靶都具有在分块当中的泊松分布则估计共同地对应于阳性的所确定的数目的多于R个靶中的每一个的浓度的步骤。
B7.段落B1至B6中的任一项的方法，其中估计的步骤包括找到对一组联立方程的解的步骤，并且其中每一个方程都具有相同的变量。
B8.段落B7的方法，其中联立方程是线性方程。
B9.段落B7或B8的方法，其中解通过数值分析来获得。
B10.段落B7至B9中的任一项的方法，其中找到解的步骤包括找到对至少2R-1个方程的解的步骤。
B11.段落B7至B10中的任一项的方法，其中每一个方程基于具有在分块当中的泊松分布的每一个靶的拷贝。
B12.段落B1至B11中的任一项的方法，其中所述R个信号中的每一个都是包括对应于单独分块中的不同靶的存在或不存在的两个或多个整体信号部分的复合信号。
B13.段落B1至B12中的任一项的方法，其中分离样品的步骤形成的分块的每分块平均浓度小于多于R个靶中的每一个的约一个拷贝。
B14.段落B1至B13中的任一项的方法，其中分离样品的步骤针对多于R个靶中的每一个形成不包含靶的拷贝的一个或多个分块。
B15.段落B1至B14中的任一项的方法，其中分块是液滴。
B16.段落B1至B15中的任一项的方法，其中R个信号中的每一个都代表检测到的荧光发射。
B17.段落B1至B16中的任一项的方法，还包括在产生R个靶的步骤 之前在一个或多个分块中执行扩增反应的步骤。
B18.段落B17的方法，其中执行扩增反应的步骤包括对分块进行热循环的步骤。
B19.段落B1至B18中的任一项的方法，其中每一个靶都是核酸。
B20.段落B1至B19中的任一项的方法，其中所述分块包括报告在单独分块中的第一靶分子的存在或不存在的第一探针、报告在单独分块中的第二靶分子的存在或不存在的第二探针，以及报告在单独分块中的第三靶分子的存在或不存在的至少一个第三探针。
B21.权利要求B20的方法，其中至少一个第三探针是单个第三探针。
B22.段落B1至B19中的任一项所述的方法，其中分块包括报告在单独分块中的第一靶分子的存在或不存在的第一探针、报告在单独分块中的第二靶分子的存在或不存在的第二探针，并且其中第一和第二探针共同报告在单独分块中的第三靶分子的存在或不存在。
B23.段落B1至B22中的任一项所述的方法，其中R个信号中的每一个都至少主要代表从不同的荧光团检测的光。
B24.段落B1至B23中的任一项的方法，其中分块都具有实质上相同的体积。
B25.段落B1至B24中的任一项所述的方法，其中多于R个靶中的至少一个是其它R个靶中的至少两个的连接版本。
C1.一种执行数字分析的方法，该方法包括：（a）将样品分成分块，每个分块都能够扩增多于R个靶，如果靶存在于该分块中；（b）产生代表从分块检测的光的R个信号，其中对于多于R个靶中的至少一个靶，在至少一个靶的分块中的扩增选择性地改变R个信号中的仅仅一个信号，并且其中对于多于R个靶中的至少一个其它靶，在至少一个其它靶的分块中的扩增协调地改变信号中的两个或多个；以及（c）基于所产生的R个信号估计多于R个靶中的每一个的浓度。
C2.段落C1的方法，其中扩增的步骤包括在产生步骤之前对分块进 行热循环的步骤。
C3.段落C1或C2的方法，其中R个信号代表从穿过检查区域运送液滴的流体检测的光。
C4.段落C1至C3中的任一项的方法，其中产生步骤包括产生表示所检测的光的不同波长和/或波长范围的两个或多个信号。
C5.段落C1至C4中的任一项的方法，其中产生步骤包括产生代表由使用两个或多个信号中的每一个的不同的波长或波长范围照射产生的所检测的光的相同波长范围的两个或多个信号的步骤。
D1.一种执行多重数字扩增分析的方法，该方法包括：（a）扩增在分块中的多于R个靶；（b）产生代表在R个不同的波长区域中从分块检测的光的R个信号，其中R≥2；并且（c）基于R个信号计算分块中的每一个靶的平均水平，其中计算出的水平考虑到在相同的单独分块中的不同靶的同时存在，如果有的话。例如，如果T表示靶的数量，则T>R。
D2.段落D1的方法，其中每个靶的扩增单独地通过与其它靶中的任一个不同的信号或信号的组合来报告。
D3.段落D1或D2的方法，其中信号中的每一个都报告靶中的至少两个的不同组合的扩增。
D4.段落D3的方法，其中分块是液滴，该方法还包括针对每个信号确定呈现至少两个靶中的任一个的扩增的液滴的数量的步骤，并且其中计算步骤基于针对R个信号中的每一个确定的数量。
D5.段落D1至D4中的任一项的方法，其中计算步骤包括找到对一组联立方程的解的步骤。
D6.段落D5的方法，其中有T个靶，其中找到解的步骤包括找到对T个联立方程的解的步骤，并且其中R<T≤2R-1。
D7.段落D5或D6的方法，其中解通过数值分析来获得。
D8.段落D1至D7中的任一项的方法，其中有三个靶，并且其中代表光的信号在扩增期间从与结合到相应的靶的扩增子的探针相关联的两个 荧光团检测到。
D9.段落D8的方法，其中两个荧光团是VIC和FAM。
D10.段落D8或D9的方法，其中分块包含三个靶中的第一个的第一探针、三个靶中的第二个的第二探针、以及三个靶中的第三个的第三探针，并且其中第一探针仅用VIC标记，第二探针仅用FAM标记，第三探针用VIC和FAM标记。
D11.段落D10的方法，其中所述第三探针包括不用VIC标记的FAM标记探针和不用FAM标记的VIC标记探针。
D12.段落D1至D11中的任一项的方法，其中平均水平是浓度。
D13.段落D1至D12中的任一项的方法，其中计算平均水平的步骤包括为每一个类型的靶确定扩增阳性分块的总数的步骤和确定分块的总数的步骤。
D14.段落D1至D13中的任一项的方法，还包括在分块当中分配多于R个靶的拷贝使得一些分块包含给定靶的多于一个拷贝的步骤。
D15.段落D1至D13中的任一项的方法，其中有至少四个靶。
E1.一种执行多重数字扩增分析的方法，该方法包括：（a）扩增在液滴中的多于R个靶；（b）产生代表在来自液滴的R个不同的波长范围中检测的光的R个信号，其中R≥2；并且（c）通过找到对一系列联立方程的解来计算多于R个靶中的每一个的平均水平。例如，如果T表示靶的数目，那么T>R。
E2.段落E1的方法，其中每个靶的扩增单独地通过与其它靶中的任一个不同的信号或信号的组合来报告。
E3.段落E1至E2中的任一项的方法，其中信号中的每一个都报告靶中的至少两个的不同组合的扩增。
E4.段落E3的方法，还包括确定对由每个信号报告的至少两个靶中的任何一个为扩增阳性的液滴的总数的步骤，并且其中计算步骤基于针对R个信号中的每一个确定的总数。
E5.段落E1至E4中的任一项的方法，其中有T个靶，其中计算步骤包括找到对T个联立方程的解的步骤，并且其中R<T≤2R-1。
E6.段落E1至E5中的任一项的方法，其中解通过数值分析来获得。
E7.段落E1至E6中的任一项的方法，其中水平考虑到在相同的单独液滴中的不同的靶的任何同时存在。
F1.一种执行多重数字扩增分析的方法，该方法包括：（a）扩增在液滴中的多于R个靶；（b）产生代表在R个不同的波长范围中从液滴检测的光的R个信号，其中R≥2，并且信号中的每一个都报告靶中的至少两个的不同组合的扩增；并且（c）基于R个信号计算在液滴中的每一个靶的平均水平，而不对每个信号确定至少两个靶中的哪一个在对这样的信号的单独扩增阳性液滴中扩增。例如，如果T表示靶的数目，那么T>R。
F2.段落F1的方法，还包括确定对由每个信号报告的至少两个靶中的任一个为扩增阳性的液滴的总数的步骤，并且其中计算步骤基于针对R个信号中的每一个所确定的总数。
F3.段落F1或F2的方法，其中计算步骤包括找到对一组联立方程的解的步骤。
G1.一种合成物包括：含有探针的液滴，该探针包括寡核苷酸、第一荧光团、第二荧光团以及能量转移部分，其中能量转移部分是猝灭剂和/或第一和第二荧光团中的一个或两个的能量转移伙伴。
G2.段落G1的合成物，其中第一荧光团、第二荧光团以及能量转移部分每个共价地连接到寡核苷酸。
G3.段落G1至G2的合成物，还包括含有探针并布置在载流流体中的多个液滴。
G4.段落G1至G3中的任一项的合成物，其中液滴含有模板分子和能够扩增模板分子的至少一个区域的扩增试剂，并且其中探针能够结合到通过模板分子的区域的扩增产生的扩增子。
G5.段落G1至G4中的任一项的合成物，其中所述探针是第一探针， 并且其中所述液滴还包括包含所述第一荧光团或所述第二荧光团而不是包含所述第一荧光团和所述第二荧光团的第二探针。
G6.段落G1至G5中的任一项的合成物，其中能量转移部分是在寡核苷酸的5′-端连接到核苷酸的猝灭剂。
G7.段落G1至G6中的任一项的合成物，其中第一荧光团、第二荧光团以及能量转移部分中的每一个被连接到寡核苷酸的不同核苷酸。
G8.段落G7的合成物，其中一对第一荧光团、第二荧光团以及能量转移部分连接到寡核苷酸的相同核苷酸。
G9.段落G1至G8中的任一项的合成物，其中第一荧光团、第二荧光团以及能量转移部分中的至少一个通过第一荧光团、第二荧光团以及能量转移部分中的另一个连接到寡核苷酸的核苷酸。
G10.段落G1至G9中的任一项的合成物，其中荧光团或猝灭剂连接到寡核苷酸的5′-端，其中荧光团或猝灭剂连接到寡核苷酸的3′-端，并且其中荧光团或猝灭剂连接到在5′-端和3′-端中间的核苷酸。
G11.段落G1至G10中的任一项的合成物，其中第一荧光团、第二荧光团以及能量转移部分中的一个或多个连接到布置在寡核苷酸的5′-端和3′-端中间的一个或多个内部核苷酸。
上面阐述的内容可包括具有独立效用的多个不同的发明。虽然这些发明中的每一个在优选的形式中被公开，但是如这里所述和示出的特定实施方式不应在限制的意义上被考虑，因为很多变化是可能的。发明的主题包括本文公开的各种元素、特征、功能和/或特性的所有新颖而非明显的组合和子组合。下列权利要求特别指出被视为新颖的和非明显的组合及子组合。体现在特征、功能、元件和/或特性的其它组合和子组合中的发明可在从本申请或相关申请要求优先权的申请中被主张。这样的权利要求不管是否指向不同的发明或相同的发明且不管与原始权利要求相比是否在范围上更宽、更窄、相等或不同都被视为包括在本公开的发明的主题内。此外，所标识的元素的顺序指示器例如第一、第二或第三指示器用于区分开元素，且不指示这样的元素的特定位置或顺序，除非另外特别说明。