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1、(10)申请公布号 CN 103344756 A (43)申请公布日 2013.10.09 CN 103344756 A *CN103344756A* (21)申请号 201310295487.6 (22)申请日 2013.07.15 G01N 33/558(2006.01) (71)申请人 中南大学湘雅二医院 地址 410000 湖南省长沙市芙蓉区人民中路 139 号 (72)发明人 胡敏 潘艺 梁好 (74)专利代理机构 广州凯东知识产权代理有限 公司 44259 代理人 姚迎新 (54) 发明名称 一种用于检测 P24 抗原的碳量子点试纸条的 制备方法 (57) 摘要 本发明涉及用于检测。
2、 P24 抗原的试纸条， 具 体说是一种用于检测 P24 抗原的碳量子点试纸条 的制备方法， 其包括在底板两端分别粘结样品垫 和吸水垫、 P24碳量子点垫的制取和P24硝酸纤维 素膜的制备、 在所述底板上依次相互搭接地粘结 所述样品垫、 P24 碳量子点垫、 P24 硝酸纤维素膜 和吸水垫， 得到试纸板、 将试纸板切割成若干条符 合规定宽度的试纸条， 并将试纸条密封保存的步 骤。本发明将已知的特异性抗体或抗原先固定于 纤维素膜的某一区带， 当待测样品加到样本垫上 后， 溶解碳量子点垫上的碳量子点标记试剂， 使大 量的碳量子点聚集在检测带上， 从而发出明亮的 光， 实现特异性的免疫诊断。 本方法。
3、在检测时不仅 灵敏度较高， 而且少毒性或无毒性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103344756 A CN 103344756 A *CN103344756A* 1/1 页 2 1. 一种用于检测 P24 抗原的碳量子点试纸条的制备方法， 包括在底板两端分别粘结样 品垫和吸水垫的步骤， 其特征在于 ： 还包括以下步骤 ： （1） P24 碳量子点垫的制取和 P24 硝酸纤维素膜的制备 ； （2） 在所述底板上依次相互搭接地粘结。
4、所述样品垫、 P24 碳量子点垫、 P24 硝酸纤维素 膜和吸水垫， 得到试纸板 ； （3） 将试纸板切割成若干条符合规定宽度的试纸条， 并将试纸条密封保存。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于 ： 上述 （1） 中的P24碳量子点垫的制取 按以下步骤进行 ： 1） 制备、 纯化碳量子点溶液， 其步骤如下 ： a、 用三口摇瓶收集碳灰与硝酸溶液， 并混匀 ； b、 将上述混匀的溶液在100磁力搅拌下回流12h， 再以3000rpm 、 4离心10 min， 分 离未反应的碳灰 ； c、 收集上述溶液中清亮的棕黄色上清液， 弃去沉淀 ； d、 加入3倍上述上清液体积的丙酮溶液， 以1。
5、4000rpm离心10 min， 弃去上清液， 收集沉 淀 ； e、 将上述收集的沉淀干燥后， 溶于去离子水中， 用碳酸钠溶液调节 pH 至 7.0 ； f、 将调节 pH 值后的溶液于 4、 12000rpm 离心 30min， 收集上清液 ； g、 将 f 中收集的上清液加入到透析袋中透析 48h， 去除杂质， 得到纯化的水溶性碳量子 点溶液 ； 2） 利用上述碳量子点溶液制取 P24 碳量子点偶联抗体， 其步骤如下 ： h、 将 P24 抗体加入 EDC 和 NHS 混合溶液中， 室温反应 30min ； i、 向上述混合溶液中加入巯基乙醇， 淬灭未反应的 EDC ； j、 加入等体积的。
6、 g 中纯化的水溶性碳量子点溶液， 室温下反应 2h ； k、 接着加入 BSA 溶液与 NH4Cl 溶液， 室温放置 10min ； n、 最后用 PBS 透析除去未偶联的抗体及游离 NHS， 得到 P24 碳量子点偶联抗体 ； 3） 将玻璃纤维膜放入含有蔗糖、 BSA、 吐温的磷酸缓冲液中浸透， 取出干燥后放入上述 制取的 P24 碳量子点偶联抗体中浸泡 10 min， 再取出晾干， 得到 P24 碳量子点垫 ； 4） 待上述 P24 碳量子点垫干燥后， 4保存。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于 ： 上述 （1） 中P24硝酸纤维素膜制备是 在硝酸纤维素膜上均匀地喷上分别针。
7、对 Test 区和 Control 区的 P24 抗体和羊抗鼠 IgG， 室 温下干燥后用适当浓度的BSA溶液进行封闭， 然后用Na2HPO4洗涤液漂洗三次， 室温下充分 干燥后， 4保存。 权 利 要 求 书 CN 103344756 A 2 1/4 页 3 一种用于检测 P24 抗原的碳量子点试纸条的制备方法 0001 技术领域 0002 本发明涉及用于检测 P24 抗原的试纸条， 具体说是一种用于检测 P24 抗原的试纸 条的制备方法。 背景技术 0003 机体感染艾滋病 HIV 病毒后， P24 抗原是较早能从血清中检出的病原学标志， 感 染后 23 周即可检出。目前检测 P24 抗体。
8、一般采用试纸条， 试纸条主要是在底板上依次 粘结样品垫、 胶体金垫、 包被膜和吸水垫。其中样品垫的处理是将玻璃纤维膜放入含有 BSA 和 PBS 样品垫处理溶液中处理 ； 包被膜的制备是用包被膜缓冲液稀释抗原后喷印在包被膜 上 ； 胶体金垫的制备是用碳酸钾调节胶体金溶液， 并将该溶液与其他抗原进行重组， 混匀重 组抗原后静置， 离心处理， 弃去上清， 将沉淀用标记洗涤液洗涤， 再将沉淀用胶体金的金标 抗原保存液溶解， 最后将溶解液涂覆在玻璃纤维膜上， 干燥后保存， 从而制得胶体金垫。这 种形式的试纸条由于含有胶体金垫， 其不仅灵敏度较低， 而且胶体金的原材料中含氯金酸， 具有毒性。 发明内容 。
9、0004 本发明的主要目的在于提供一种用于检测 P24 抗原的碳量子点试纸条的制备方 法， 通过该方法制备的试纸条不仅灵敏度较高， 而且很少或无毒性。 0005 本发明解决上述技术问题采用的技术方案为 ： 一种用于检测 P24 抗原的碳量子点 试纸条的制备方法， 包括在底板两端分别粘结样品垫和吸水垫的步骤， 还包括以下步骤 ： （1） P24 碳量子点垫的制取和 P24 硝酸纤维素膜的制备 ； （2） 在所述底板上依次相互搭接地粘结所述样品垫、 P24 碳量子点垫、 P24 硝酸纤维素 膜和吸水垫， 得到试纸板 ； （3） 将试纸板切割成若干条符合规定宽度的试纸条， 并将试纸条密封保存。 00。
10、06 作为优选， 上述 （1） 中的 P24 碳量子点垫的制取按以下步骤进行 ： 1） 制备、 纯化碳量子点溶液 ： a、 用三口摇瓶收集碳灰与硝酸溶液， 并混匀 ； b、 将上述混匀的溶液在100磁力搅拌下回流12h， 再以3000rpm 、 4离心10 min， 分 离未反应的碳灰 ； c、 收集上述溶液中清亮的棕黄色上清液， 弃去沉淀 ； d、 加入3倍上述上清液体积的丙酮溶液， 以14000rpm离心10 min， 弃去上清液， 收集沉 淀 ； e、 将上述收集的沉淀干燥后， 溶于去离子水中， 用碳酸钠溶液调节 pH 至 7.0。 0007 f、 将上述去离子水溶液于 4、 12000。
11、rpm 离心 30min， 收集上清液 ； 说 明 书 CN 103344756 A 3 2/4 页 4 g、 将上述收集的上清液加入到透析袋中透析 48h， 去除杂质， 得到纯化的水溶性碳量子 点溶液。 0008 2） 利用上述碳量子点溶液制取 P24 碳量子点偶联抗体 ： h、 将 P24 抗体加入 EDC 和 NHS 混合溶液中， 室温反应 30min ； i、 向上述混合溶液中加入巯基乙醇， 淬灭未反应的 EDC ； j、 加入等体积的上述纯化的水溶性碳量子点溶液， 室温下反应 2h ； k、 加入 BSA 溶液与 NH4Cl 溶液， 室温放置 10min ； n、 用 PBS 透析除。
12、去未偶联的抗体及游离 NHS， 得到 P24 碳量子点偶联抗体。 0009 3） 将玻璃纤维膜放入含有蔗糖、 BSA、 吐温的磷酸缓冲液中浸透， 取出干燥后放入 上述制取的 P24 碳量子点偶联抗体中浸泡 10 min， 再取出晾干， 得到 P24 碳量子点垫 ； 4） 待上述 P24 碳量子点垫干燥后， 4保存。 0010 作为优选， 上述 （1） 中 P24 硝酸纤维素膜制备是在硝酸纤维素膜上均匀地喷上分 别针对 Test 区和 Control 区的 P24 抗体和羊抗鼠 IgG， 室温下干燥后用适当浓度的 BSA 溶 液进行封闭， 然后用 Na2HPO4 洗涤液漂洗三次， 室温下充分干燥。
13、后， 4保存。 0011 从以上方案可知， 本发明制备的碳量子点试纸条是一种以膜为固相载体的快速诊 断技术， 是将已知的特异性抗体或抗原先固定于纤维素膜的某一区带， 当待测样品加到样 本垫上后， 由于毛细管虹吸作用， 待测样品将沿着膜从一端向另一端移动， 从而溶解碳量子 点垫上的碳量子点标记试剂， 并与之相互反应 ； 当移至固有已知抗体或抗原的区域时， 该已 知的抗体或抗原会与待测样品， 即碳量子点标记试剂的结合物发生特异性结合， 使大量的 碳量子点聚集在检测带上， 当大量的免疫碳量子点聚集时可使该区域在紫外灯下发出明亮 的光， 从而实现特异性的免疫诊断。因此， 根据本方法获得试纸条由于采用了。
14、碳量子点， 其 在检测时不仅灵敏度较高， 而且少毒性或无毒性。 附图说明 0012 图 1 是从左到右依次为检测 P24 标准品抗原 1000 pg/ml ,100pg/ml,10pg/ml ,1 pg/ml , 0.1pg/ml ； 图 2 是本实施例中 400nm 激发波长照射获得的水溶性碳量子点， 用不同波长的滤光片 拍摄的图片 ； 图 3 是本实施例中透射电镜检测碳量子点颗粒大小的图片。 具体实施方式 0013 下面对本发明作进一步地详细说明 ： 本方法包括在底板两端分别粘结样品垫和吸水垫的步骤， 该步骤为现有技术， 底板、 样 品垫和吸水垫为现有产品， 本方法还包括制取P24碳量子点。
15、垫和制备P24硝酸纤维素膜。 所 有产品准备好以后， 在底板上依次相互搭接地粘结所述样品垫、 P24 碳量子点垫、 P24 硝酸 纤维素膜和吸水垫， 得到试纸板 ； 一般地两者搭接重叠 2mm 左右， 以保证结合精密严实。所 有产品粘结好以后， 将试纸板切割成若干条符合规定宽度的试纸条， 一般宽度为 4mm 左右， 并将试纸条密封保存。 0014 作为本发明的优选， P24 碳量子点垫的制取按以下步骤进行 ： 说 明 书 CN 103344756 A 4 3/4 页 5 1） 制备、 纯化碳量子点溶液 ； 2） 利用上述碳量子点溶液制取 P24 碳量子点偶联抗体 ； 3） 将玻璃纤维膜放入含有。
16、蔗糖、 BSA、 吐温的磷酸缓冲液中浸透， 取出干燥后放入上述 制取的 P24 碳量子点偶联抗体中浸泡 10 min， 再取出晾干， 得到 P24 碳量子点垫 ； 4） 待上述 P24 碳量子点垫干燥后， 4保存。 0015 本发明通过上述步骤制取碳量子点垫， 然后将碳量子点垫粘结于底板上， 从而发 挥检测功能。 0016 本发明在制备 P24 碳量子点垫过程中， 制备、 纯化碳量子点溶液优选采用以下方 法 ： a、 用三口摇瓶收集碳灰与硝酸溶液， 并混匀 ； b、 将上述混匀的溶液在100磁力搅拌下回流12h， 再以3000rpm 、 4离心10 min， 分 离未反应的碳灰 ； c、 收集。
17、上述溶液中清亮的棕黄色上清液， 弃去沉淀 ； d、 加入3倍上述上清液体积的丙酮溶液， 以14000rpm离心10 min， 弃去上清液， 收集沉 淀 ； e、 将上述收集的沉淀干燥后， 溶于去离子水中， 用碳酸钠溶液调节 pH 至 7.0。 0017 f、 将上述去离子水溶液于 4、 12000rpm 离心 30min， 收集上清液 ； g、 将上述收集的上清液加入到透析袋中透析 48h， 去除杂质， 得到纯化的水溶性碳量子 点溶液。 0018 上述制备、 纯化碳量子点溶液的方法操作简单， 无需特殊设备， 成本较低， 获得的 水溶性碳量子点大小均匀， 重复性较好， 无需后续的钝化等修饰过程。。
18、 0019 制备、 纯化碳量子点溶液后， 本发明利用上述纯化的碳量子点溶液制取 P24 碳量 子点偶联抗体， 优选以下方法 ： h、 将 P24 抗体加入 EDC 和 NHS 混合溶液中， 室温反应 30min ； i、 向上述混合溶液中加入巯基乙醇， 淬灭未反应的 EDC ； j、 加入等体积的上述纯化的水溶性碳量子点溶液， 室温下反应 2h ； k、 加入 BSA 溶液与 NH4Cl 溶液， 室温放置 10min ； n、 用 PBS 透析除去未偶联的抗体及游离 NHS， 得到 P24 碳量子点偶联抗体。 0020 上述制取 P24 碳量子点偶联抗体的方法， 不仅标记效率较高， 而且操作简。
19、单， 重复 性较好。 0021 本发明制备 P24 硝酸纤维素膜优选在硝酸纤维素膜上均匀地喷上分别针对该膜 的 Test 区和 Control 区的 P24 抗体和羊抗鼠 IgG， 室温下干燥后用适当浓度的 BSA 溶液进 行封闭， 然后用 Na2HPO4 洗涤液漂洗三次， 室温下充分干燥后， 4保存。 实施例 0022 用三口摇瓶收集 50mg 碳灰与 30ml 5mol/L 的硝酸溶液， 并混匀， 将混匀的溶液在 100磁力搅拌下回流 12h， 再以 3000rpm 、 4离心 10 min， 分离未反应的碳灰后， 收集溶 液中清亮的棕黄色上清液， 弃去沉淀， 然后加入 3 倍上清液体积的。
20、丙酮溶液， 以 14000rpm 离心 10 min， 弃去上清， 收集沉淀， 即碳量子点 ； 将该沉淀干燥后， 溶于去离子水中， 用碳酸 说 明 书 CN 103344756 A 5 4/4 页 6 钠溶液调节 pH 至 7.0， 将该溶液于 4、 12000rpm 离心 30min， 收集上清液到透析袋中透析 48h， 去除杂质， 得到纯化的约 2-6nm 的水溶性碳量子点溶液， 待用。 0023 同时， 一方面将 1mg P24 抗体加入 0.4mg EDC 和 1mg NHS 混合溶液中， 室温反应 30min， 然后加入终浓度为 20mM 的巯基乙醇， 淬灭未反应的 EDC， 接着加。
21、入等体积的上述 待用的水溶性碳量子点溶液， 室温下反应 2h， 再加入终浓度为 0.1% 的 BSA 溶液与 100ul 1mol/L 的 NH4Cl 溶液， 室温放置 10min， 接着用 PBS 透析除去未偶联的抗体及游离 NHS， 得到 P24 碳量子点偶联抗体 ； 另一方面将玻璃纤维膜放入含有蔗糖、 BSA、 吐温的磷酸缓冲液中 浸透， 取出并干燥。待玻璃纤维膜干燥后放入上述制取的 P24 碳量子点偶联抗体中浸泡 10 min， 再取出晾干， 从而得到 P24 碳量子点垫， 待彻底干燥后， 4保存待用。 0024 同时， 在现有的硝酸纤维素膜上均匀地喷上分别针对该膜的Test区和Control区 的 P24 抗体和羊抗鼠 IgG， 室温下干燥后用适当浓度的 BSA 溶液进行封闭， 然后用 Na2HPO4 洗涤液漂洗三次， 室温下充分干燥后， 4保存待用 ； 接着， 在PVC底板上依次相互搭接地粘结样品垫、 P24碳量子点垫、 P24硝酸纤维素膜和 吸水垫， 得到试纸板 ； 最后， 将制得的试纸板切割成若干条符合规定宽度或指定宽度的试纸 条， 密封保存。 说 明 书 CN 103344756 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103344756 A 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 103344756 A 8 。