说明书作为谷氨酰胺转移酶的抑制剂的酰基哌嗪类及其在药物中的用途
技术领域
本发明提供了具有谷氨酰胺转移酶抑制活性的新化合物及其在药物中的用途。
背景技术
谷氨酰胺转移酶(TG或TGase)是一组能够通过调节肽结合谷氨酰胺的γ-甲酰胺基团和伯胺之间的酰基转移反应来修饰蛋白的酶。该反应的结果为翻译后修饰，如果胺是肽结合赖氨酸的ε-氨基则通过蛋白的交联，或者通过与伯胺(如多胺)交联而修饰肽谷氨酰胺。在某些条件下以及在缺少合适的伯胺的情况下，也可发生肽结合谷氨酰胺的脱酰胺基作用。因为它们具有将蛋白交联到高分子量蛋白聚集体的能力，TG已被称为“天然生物胶”(Griffin et al.,2002)。已在自然界广泛地发现TG，但是在哺乳动物中它们的酶活性为Ca2+依赖性，其它因素包括GTP/GDP也可影响一些哺乳动物TG的活性(Verderio et al.,2004)。哺乳动物TG家族的8个活性成员(TG1-7和因子XIII)不是全都被完全表征(Collighan and Griffin,2009)。该家族的另一个成员band 4.2无催化活性，并主要与红细胞细胞骨架相关联。TG2(组织型谷氨酰胺转移酶，TG2M，tTG)可能是在细胞内和细胞外环境中都发现的最普遍存在的哺乳动物TG家族的成员。除了其转酰胺基、GTPase和ATPase活性(Nakaoka et al.,1994)外，最近报道了TG2的其它新活性，例如蛋白质二硫键异构酶(PDI)(Hasegawa et al.,2003)和蛋白激酶活性(Mishra and Murphy,2004)，因此进一步扩展了这种多样类别的酶的潜在生理和病理重要性。在许多疾病状态如口炎性腹泻(celiac sprue)、神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)(阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病)、纤维化(fibrosis)、白内障(cataract)、癌症转移(cancer metastasis)中观察到了谷氨酰胺转移酶(特别是TG2)的异常水平和/或活性，并且该清单必然不是详尽无遗的。此外，使用TG2-/-动物模型(Bailey and Johnson,2005； Mastroberardino et al.,2002)的概念研究或抑制剂研究(Huang et al.,2009；Johnson et al.,2008)的证据已经显示酶为治疗干预的潜在的新候选物。
由于其参与广泛种类的生物进程和病理，开发化学工具以进一步研究TG2的多种功能是活跃的研究领域。目前开发的大多数抑制剂靶向酶的活性催化位点，但是也报道了竞争TG2辅助因子的结合位点的小分子。根据它们到达并与催化半胱氨酸残基(在hTG2的情况下为CYS277)反应的能力，它们可进一步被分为可逆的及不可逆的抑制剂。这样的衍生物的最近的实例为具有各种亲电子部分(例如氯乙酰胺(Pardin et al.,2006)、α,β-不饱和酰胺(Pardin et al.,2006)、马来酰亚胺(Halim et al.,2007)、锍甲基酮(Griffin et al.,2008)、二氢异噁唑(Dafik and Khosla,2011)、肉桂酰衍生物(Pardin et al.,2008a；Pardin et al.,2008b)、氧化吲哚(oxindoles)(Klock et al.,2011)、磺酰氨基哌嗪(Prime et al.,2012)的肽抑制剂。解析的TG2结构与不可逆抑制剂(Lindemann et al.,2012；Pinkas et al.,2007)或核苷酸(Han et al.,2010；Liu et al.,2002)共结晶，揭示了当酶由非活性状态向活性状态变化时大的构象变化，并且必然将提高未来更有效的抑制剂的设计。
本发明寻求提供抑制谷氨酰胺转移酶活性的新化合物，其用于药物中。
发明内容
本发明源自于以下发现：包含哌嗪骨架的一类新的拟肽类模拟物(peptidomimetic derivatives)，能够与谷氨酰胺转移酶(例如组织型谷氨酰胺转移酶)相互作用，并抑制它们的活性。
根据本发明的第一个方面，提供了根据式I的化合物或其药学上和/或兽医学上可接受的衍生物：
其中
R1选自由R4C(O)-、R5OC(O)-和R6S(O)2-组成的组(其中，‘-’表示R1取 代基与哌嗪环的氮之间的键)
其中
R4为低级烷基
R5和R6选自由杂环基、芳烷基和低级烷基组成的组，
R2为氨基酸的侧链；且
R3选自由–C(O)R7和–S(O)2CHCH2组成的组(其中，‘-’表示本发明的化合物中R3取代基与氨基酸的氮之间的键)
其中，
R7选自由烷基卤化物、亚烷基二烷基锍、亚烷基硫代咪唑鎓、低级
烷基、低级烯基、环氧化物和亚烷基二氢异噁唑基团组成的组。
本发明的化合物是谷氨酰胺转移酶的抑制剂，谷氨酰胺转移酶中有8种是目前已知的(TG1-7和因子XIII)。因此，“谷氨酰胺转移酶(transglutaminase)”包括如根据酶学委员会分类系统2.3.2.13定义的酶。
在优选的实施方式中，所述谷氨酰胺转移酶是组织型谷氨酰胺转移酶。
在可选的实施方式中，所述谷氨酰胺转移酶可为因子XIII。
所述谷氨酰胺转移酶，例如组织型谷氨酰胺转移酶，优选为人类的。
“谷氨酰胺转移酶抑制剂”包括部分或全部地抑制谷氨酰胺转移酶(优选体内)的转酰胺活性的任何化合物。
在一个实施方式中，本发明的化合物为组织型谷氨酰胺转移酶的不可逆抑制剂。
在一个实施方式中，本发明的化合物为组织型谷氨酰胺转移酶的选择性抑制剂。“选择性”意味着所述化合物抑制组织型谷氨酰胺转移酶(优选人类TG2)的程度大于其抑制诸如因子XIII、TG1和TG3的其它谷氨酰胺转移酶的程度。有利地，所述化合物对组织型谷氨酰胺转移酶(优选人类TG2)呈现的IC50比其对诸如因子XIII、TG1和TG3的其它谷氨酰胺转移酶的IC50低至少一个数量级(参见实施例2)。
术语“低级烷基”旨在包括直链或支链的、环状或无环的饱和的C1-C20烷基。R2、R3、R4、R5和/或R6的低级烷基可包括C1-C10烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基、C2-C5烷基、C3-C5烷基、C4-C5烷基、C2-C4烷基、C2-C3烷基和C3-C4烷基。R2、R3、R4、R5和/或R6可表示的优选的低 级烷基包括C1、C2、C3、C4和C5烷基。
可以理解，术语“低级烷基”包括环烷基，例如C6-C20环烷基(碳环)基团，包括单个或多个(稠合)环，以及平面的或非平面的环结构。
在一个实施方式中，所述“低级烷基”为C6-C10环烷基。
术语“亚烷基”被相应地解释。
术语“低级烷基卤化物”也被相应地解释。
术语“低级烯基”旨在包括直链或支链的、环状或无环的C2-C20烯基。
术语“低级烯基”还包括顺式和反式两种几何异构体。R3可表示的低级烯基包括C2-C10烯基、C2-C9烯基、C2-C8烯基、C2-C7烯基、C2-C6烯基、C2-C5烯基、C2-C4烯基、C2-C3烯基和C3-C4烯基。R3可表示的优选的低级烯基包括C2、C3、C4和C5烯基。
在本发明的化合物中，R1选自由R4C(O)-、R5OC(O)-和R6S(O)2-组成的组(其中，‘-’表示与连接R1的哌嗪环的氮结合的键)，其中，R4为低级烷基，并且R5和R6选自由杂环基、芳烷基和低级烷基组成的组。
因此，在一个实施方式中，R1为R4C(O)-。
在一个实施方式中，R4为环烷基(例如包含6至20个碳的平面环或稠合环)。
例如，R4可为具有下述结构的金刚烷取代基：
(其中，虚线表示与连接R4的式I的化合物的羰基的碳结合的键)。
在可选的实施方式中，R1为R5OC(O)-，其中R5为杂环基、芳烷基和低级烷基。
“杂环”包括包含至少一个非碳原子如氮或氧的碳环结构。在一个实施方式中，所述杂环基是单环或多环结构(平面或非平面)，其包含四至九个碳原子以及至少一个氮原子(如喹啉基环)。
“芳烷基”包括通过饱和的无环低级亚烷基连接到本发明的化合物的哌嗪环的芳基。术语“芳基”包括6至10元碳环芳香基团，如苯基和萘基，该基团 任选地被选自氟、氰基、硝基、低级烷基(即烷芳基)、OR、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR’和NRR’(其中R和R’表示低级烷基)的一个或多个取代基取代。
因此，R5可包含通过直链C1-6亚烷基(如亚甲基或亚乙基)连接到R5OC(O)-的酯部分的苯基或萘基，或可由直链C1-6亚烷基(如亚甲基或亚乙基)连接到R5OC(O)-的酯部分的苯基或萘基组成。
在一个实施方式中，所述苯基或萘基被化学式R8OOC-的一个或多个酯取代基取代，其中，R8为低级烷基(如甲基、乙基、丙基或丁基)。
例如，R5可选自由以下组成的组
(其中，虚线表示与连接R1的式I的化合物的羰基的碳结合的键)。
在另外的实施方式中，R5为低级烷基，其可为直链或支链、环状或非环状。
因此，R5可为–CR9(R10)(R11)，其中，R9、R10和R11各自独立地为甲基或乙基。
例如，R1可为：
(其中，虚线表示与连接R1的化学式I的化合物的羰基的碳结合的键)。
在另外的实施方式中，R5包含环烷基，如金刚烷基环。
例如，R5可为：
(其中，虚线表示与连接R5的化学式I的化合物的羰基的碳结合的键)。
在另外的实施方式中，R1为R6S(O)2-，其中，R6为杂环基、芳烷基或低级烷基。
例如，R6可为杂环基、芳烷基或低级烷基(如上面关于R5所公开的)。
在一个实施方式中，R6包含环烷基如苯基或萘基，或者由环烷基如苯基或萘基组成。
因此，在一个实施方式中，R1可为丹磺酰基(dansyl)，例如
(其中，虚线表示与连接R1的化学式I的化合物的哌嗪的氮原子结合的键)。
本发明的化合物包括中心氨基酸部分，其中R2构成氨基酸的侧链。
因此，R2可为天然存在的蛋白氨基酸(proteinogenic amino acid)的侧链，所述天然存在的蛋白氨基酸例如选自由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的组。
然而，在一个实施方式中，R2不是芳香族的。例如，在一个实施方式中，R2不是苯丙氨酸和/或酪氨酸的侧链。
可以理解，R2连接的碳可呈现立体异构。例如，化合物的该部分可对应于L-氨基酸(如L-丙氨酸)。可选地，化合物的该部分可对应于D-氨基酸(如D-丙氨酸)。
在一个实施方式中，R2选自由氢(即甘氨酸的‘侧链’)和烷基(即丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的侧链)组成的组。例如，R2可为甲基(即氨基酸核心为丙氨酸)。
R3为通过其氨基酸部分的氮连接到本发明的化合物的氨基酸核心的取代基。
R3选自由–C(O)R7和–S(O)2CHCH2组成的组，其中，
R7选自由烷基卤化物、亚烷基二烷基锍、亚烷基硫代咪唑鎓、低
级烷基、低级烯基、环氧化物和亚烷基二氢异噁唑基团组成的组。
因此，在一个实施方式中，R3为–C(O)R7。
在一个实施方式中，R7为低级烷基卤化物基团。
“卤化物”包括氟化物(F-)、氯化物(Cl-)、溴化物(Br-)和碘化物(I-)。
因此，所述低级烷基可为直链或支链的C1-C5烷基，并且卤化物可为溴化物或氯化物。
例如，R7可为
(其中，虚线表示与连接R7的羰基的碳结合的键)。
在可选的实施方式中，R7为亚烷基二烷基锍基团，其中，所述亚烷基或烷基分别为低级亚烷基和烷基(例如直链或支链的C1-C5亚烷基或烷基)。
例如，R7可为
(其中，虚线表示与连接R7的羰基的碳结合的键)。
在另外的可选实施方式中，R7为亚烷基硫代咪唑鎓基团，其可被一个或多个低级烷基(如直链或支链的C1-C5烷基)取代。
例如，R7可为
(其中，虚线表示与连接R7的羰基的碳结合的键)。
在另外的可选实施方式中，R7为低级烷基。
例如，R3可为–CH3(其中，‘-’表示与连接R7的羰基的碳结合的键)。
在另外的可选实施方式中，R7为低级烯基。
例如，R7可为
(其中，虚线表示连接R7的羰基的碳结合的键)。
在另外的可选实施方式中，R7为环氧化物基团。
在另外的可选实施方式中，R7为亚烷基3-卤代-4,5-二氢异噁唑基团(例如亚甲基3-溴-4,5-二氢异噁唑基团)。
在另外的可选实施方式中，R3为–S(O)2CHCH2(其中，‘-’表示与连接R3的本发明的化合物的氮结合的键)。
因此，R3形成乙烯基磺酰胺基团(以及与连接其的本发明的化合物的-NH-部分一起)。
可以理解，本发明的各种化合物以不同的效力抑制谷氨酰胺转移酶。
在优选的实施方式中，所述化合物对人类组织型谷氨酰胺转移酶呈现小于100μM，例如小于50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、5μM、4μM、3μM、2μM或小于1μM的IC50(参见实施例2的方法)。
表1至表3显示本发明的示例性化合物(参见下面的实施例2)。
然而，在一个实施方式中，所述化合物不是EB 1-34、EB 1-45、EB1-104、EB 1-105、EB 1-127、EB 1-131、EB 1-126或EB 1-130。
本领域技术人员可以理解式I的化合物的药学上和/或兽医学上可接受的衍生物如盐和溶剂化物也包含在本发明的范围内。可提到的盐包括：酸加成盐，例如，与诸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸的无机酸形成的盐，与羧酸或与有机磺酸形成的盐；碱加成盐；与碱形成的金属盐，例如钠盐和钾盐。
因此，式I的化合物可被反阴离子(counter-anion)平衡。示例性反阴离子包括但不限于卤化物(例如氟化物、氯化物和溴化物)、硫酸根(例如癸基硫酸根)、硝酸根、高氯酸根、磺酸根(例如甲烷-磺酸根)和三氟醋酸根。本领域技术人员熟知其它合适的反阴离子。
在一个实施方式中，所述化合物为溴化物盐。
技术人员可进一步理解，式I的化合物可呈现互变异构。全部的互变异 构形式及其混合物包含在本发明的范围内。
式I的化合物还可包含一个或多个不对称的碳原子，并因此可呈现光学异构和/或非对映异构。可使用常规的技术，例如色谱法或分步结晶，分离非对映异构体。可通过使用常规的，例如分步结晶或HPLC技术，分离化合物的外消旋混合物或其它混合物，来分离各种立体异构体。可选地，可通过在不引起外消旋作用或差向异构的条件下合适的光学活性起始材料的反应，或者通过与例如纯手性酸的衍生化之后通过常规方法(例如HPLC、二氧化硅色谱法)分离非对映体酯，来制造期望的光学异构体。全部的立体异构体包含在本发明的范围内。
本发明的第二个方面提供了药物制剂，该药物制剂包含根据本发明的第一方面的化合物以及药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
根据使用的具体化合物的效力，可以各种浓度配制所述化合物。优选地，所述组合物包含浓度在1nM和1M之间，例如在0.1μM和1mM之间，在1μM和100μM之间，在5μM和50μM之间，在10μM和50μM之间，在20μM和40μM之间，以及任选地为约30μM的化合物。对于离体应用和体外应用，组合物可包含更低浓度的修饰的骨桥蛋白多肽，例如在0.0025μM和1μM之间。
可根据预期的给药路径和标准的制药实践选择赋形剂、载体或稀释剂(例如，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995,Ed.Alfonso Gennaro,Mack Publishing Company,Pennsylvania,USA，其通过引用合并于本文)。
“药学上可接受的”包括无毒、无菌和无热原的赋形剂、载体或稀释剂。
合适的药学载体是药学领域中公知的。载体在与本发明的化合物相容并且对其接受者无害的意义上必须是“可接受的”。通常，载体可为无菌且无热原的水或生理盐水；然而，可使用其它可接受的载体。因此，“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的赋形剂”包括用于形成制剂的一部分且意在仅作用为载体(即意在自身不具有生物活性)的任何化合物。药学上可接受的载体或赋形剂通常是安全、无毒的，并且在生物学上或其它方面都是期望的。如本文中使用的药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或超过一种这样的载体或赋形剂。
赋形剂可为碳水化合物、聚合物、脂质和矿物质中的一种或多种。碳水化合物的实例包括加到组合物中的例如用于促进冻干的乳糖、蔗糖、甘露醇和环糊精。聚合物的实例为淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、海藻酸盐、卡拉胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸酯、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物、具有不同水解度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯以及聚乙烯吡咯烷酮，全部具有不同的分子量，将其加入到组合物中，例如用于粘度控制，用于达到生物粘附，或用于保护脂质免于化学降解及蛋白质降解。脂质的实例为全部具有不同的酰基链长度以及饱和度的脂肪酸、磷脂、甘油单脂、甘油二脂和甘油三脂、神经酰胺、鞘脂类和糖脂类，蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化的蛋黄和大豆卵磷脂，出于与用于聚合物的原因相似的原因，将其加到组合物中。矿物质的实例为滑石粉、氧化镁、氧化锌和氧化钛，将其加到组合物中，以获得诸如减少液体蓄积的或有利的颜料性能的优点。
术语“稀释剂”意指用于在药物制备中稀释肽的目的的含水或非水溶液。稀释剂可为生理盐水、水、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇或油(如红花油、玉米油、花生油、棉花籽油或芝麻油)的一种或多种。
稀释剂还可作用为缓冲剂。术语“缓冲剂”意指用于稳定pH目的的包含酸碱混合物的含水溶液。缓冲剂的实例为Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐(cacodylate)、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。
根据本发明的第二方面的制剂可方便地以单位剂型存在，或者可通过制药领域中已知的任何方法制备。这样的方法包括使活性成分(即根据本发明的第一方面的化合物)与构成一种或多种助剂的载体结合。通常，通过均匀地并且紧密地使活性成分与液体载体或细分散的固体载体或两者结合，然后如果必要，使产品成型，来制备制剂。
适于口服给药的本发明的制剂可以下列形式存在：独立单元，例如胶囊、扁囊(cachet)或片剂，每种包含预定量的活性成分；粉剂或颗粒剂；在含水液体 或非水液体中的溶液或悬浮液；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分还可以丸剂、药糖剂或糊剂存在。本领域技术人员可以理解，用于口服给药的化合物应优选被配制成在肠中得到保护，并允许生物吸收。
优选的单位剂型为包含日剂量或单位、亚日剂量或合适的分数的活性成分。
适于肠胃外给药的制剂包括含水以及非水无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、杀菌剂以及使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及含水以及非水无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并可储存在仅需要在使用前加入无菌的液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)的条件下。可由先前描述无菌粉末、颗粒剂或片剂种类制备即配的注射溶液和悬浮液。
为了治疗眼睛的疾病和状况(conditions)，可根据常规程序将化合物配制成适于应用于眼睛的药物组合物。因此，所述药物组合物可用于眼部外用，例如为含水的滴眼剂、油性滴眼剂、眼药膏、洗眼液、控释膜(ocusert)、水凝胶隐形眼镜、胶原罩和眼药棒(ophthalmic rod)。
用于眼睛的外用组合物通常具有4.5-8.0的pH。眼用组合物还必须被配制成具有与眼睛及眼睛组织的房水相容的渗透值。这样的渗透值通常在约200至约400毫渗摩尔/千克水(“mOsm/kg”)的范围内，但是优选为约300mOsm/kg。
在另一个实施方式中，可在控释系统中递送如本文中所述的TGase抑制剂化合物。例如，可使用泵(参见Langer,supra；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980)；Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574(1989)；它们的公开内容通过引用被合并)。
在另一个实施方式中，可使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger and Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)；还参见Levy et al.,Science 228:190(1985)；During et al.,Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard et al.,J.Neurosurg.71:105(1989)；它们的公开内容通过引用被合并)。
本领域技术人员可以理解本发明的化合物可包含一种或多种其它活性剂，例如抗炎剂、局部麻醉剂和抗生素剂。
本发明的第三个方面提供了制造根据本发明的第一方面的化合物的方法，该方法包括下面的步骤：
(a)合成对硝基苯基碳酸酯；
(b)使所述对硝基苯基碳酸酯进行哌嗪烷基化，以产生哌嗪羧酸酯；
(c)对所述哌嗪羧酸酯进行肽偶联；和
(d)对步骤(c)的产物进行氨基甲酸酯脱保护。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤(e)：使步骤(d)的产物进行丙烯酰胺衍生化。
在可选的实施方式中，所述方法进一步包括步骤(e)：使步骤(d)的产物进行乙酰化。
在可选的实施方式中，所述方法进一步包括步骤(e)：产生步骤(d)的产物的二烷基锍盐。
在可选的实施方式中，所述方法进一步包括步骤(e)：产生步骤(d)的产物的乙烯基磺酰胺。
在实施例1中提供了用于生产本发明的化合物的合适的合成路线的进一步的细节。
本发明的第四方面提供了根据本发明的第一方面的化合物，其用在医药中。
本发明的第五方面提供了根据本发明的第一方面化合物用于治疗或预防响应于用谷氨酰胺转移酶抑制剂治疗的疾病或状况。
例如，所述疾病或状况可响应于用组织型谷氨酰胺转移酶(TG2)抑制剂的治疗。
在一个实施方式中，所述疾病或状况响应于用血管生成抑制剂的治疗。因此，本发明的化合物可用于抑制血管生成，尤其是病理性血管生成(即与疾病或病症相关的新脉管的形成；参见Chung&Ferrera,2011,Ann.Rev.Cell Dev.Biol.27:563-584，它们的公开内容通过引用被合并)。
“抑制血管生成”意为化合物的给药能够至少部分地减少体内新血管的形成。因此，与不存在所述化合物的情况下的血管生成水平相比，所述化合物 可抑制体内的血管生成至少10％，例如抑制至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。可以理解，所述抑制可需要重复地(即长期地)给予所述化合物。
在另外的实施方式中，所述疾病或状况选自由纤维化(例如囊性纤维化(cystic fibrosis))、疤痕形成(scarring)、神经退行性疾病(如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、亨廷顿氏病(Huntington’s disase)和帕金森病(Parkinson’s disease))、自体免疫疾病(autoimmune diseases)(例如多发性硬化(multiple sclerosis)和腹腔病(coeliac disease))、血栓形成(thrombosis)、增生性病症(proliferative disorders)(例如癌症)、AIDS、银屑病(psoriasis)和炎症(inflammation)(例如慢性炎性疾病(chronic inflammatory disease))组成的组。
例如，所述疾病或状况可为纤维化(如囊性纤维化)。
可选地，所述疾病或状况可为神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、亨廷顿氏病或帕金森病)。
在另外的的可选实施方式中，所述疾病或状况为自体免疫疾病(如多发性硬化和乳糜泻)。
在一个实施方式中，所述疾病或状况与病理性血管生成相关。“与病理性血管生成相关的疾病或状况”意为其中发生异常或其它不良的血管生成的疾病或病症，以便血管生成的部分或完全抑制给患者提供了有益的效果(例如减轻一个或多个症状，和/或减缓或预防疾病或病症的进展)。
例如，疾病或状况可选自由血管瘤(hemangiomas)、银屑病、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、眼部新生血管(ocular neovascularisation)、风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、子宫内膜异位症(endometriosis)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)和肿瘤生长和转移组成的组。
在一个实施方式中，所述疾病或状况可为癌症。
例如，所述癌症可与实体瘤相关(例如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、宫颈癌、食管癌(oesophageal cancer)、胃癌、头/颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤(lymphomas)、卵巢癌、胰腺癌和肉瘤)。
在其它实施方式中，所述疾病或状况为眼睛的疾病或状况，例如视网膜和/或脉络膜的疾病或病症。
因此，所述疾病或状况可为视网膜病变(retinopathy)。
例如，所述疾病或状况可选自由糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、老年性黄斑退化症(age-related macular degeneration)、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity)、视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion)、镰状细胞视网膜病变(sickle cell retinopathy)、视网膜分支和中央静脉阻塞(branch and central retinal vein occlusion)和视网膜创伤(retinal trauma)组成的组。
可选地，所述疾病或状况可选自由慢性炎症或感染(例如导致血管形成的眼表面的HSV感染)、角膜瘢痕形成(corneal scarring)、创伤修复(wound repair)、翼状胬肉(pterygium)和新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)(即血管在虹膜上的生长，并生长至前房角中；虹膜发红(robeosis iridis))组成的组。
在其它实施方式中，所述疾病或状况可响应于用因子XIII的抑制剂的治疗。例如，所述疾病或状况可与纤维蛋白凝块的形成相关。
本发明的相关的第五方面提供了根据本发明的第一方面的化合物在制备用于治疗或预防响应于用谷氨酰胺转移酶(如组织型谷氨酰胺转移酶或因子XIII)的抑制剂的治疗的疾病或状况的药物中的用途。
在上面关于本发明的第四方面中鉴别了所述化合物可用于的合适的疾病和状况。
例如，疾病或状况可选自由纤维化(如囊性纤维化)、疤痕形成、神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、亨廷顿氏病和帕金森病)、自体免疫疾病(如多发性硬化和腹腔病)、血栓形成、增生性病症(如癌症)、AIDS、银屑病和炎症(如慢性炎性疾病)组成的组。
本发明的相关的第六方面提供了用谷氨酰胺转移酶抑制剂治疗需要治疗的患者的方法，该方法包括向所述受试者给予根据本发明第一方面的化合物或根据本发明的第二方面的药物制剂。
可以理解，应以治疗有效量给予所述化合物，以(至少部分地)抑制谷氨酰胺转移酶活性。如本文中使用的，‘治疗有效量’或‘有效量’或‘治疗上有效的’是指对于给定的状况和给药方案(通过抑制谷氨酰胺转移酶活性)提供治疗作用的量。这是为与需要的添加剂或稀释剂(即载体或给药载剂)联合产生期 望的治疗作用计算的本发明的化合物的预定量。此外，其意在表示足以减少且最优选地防止受试者的活动、功能和响应的临床上显著的不足的量。可选地，治疗有效量足以引起受试者的临床显著状况的改善。如本领域技术人员可以理解的，化合物的量可根据其具体的活性而变化。合适的剂量可包含为与所需的稀释剂联合产生期望的治疗作用计算的预定量的活性成分。在用于制造本发明的组合物的方法和用途中，提供了活性组分的治疗有效量。如本领域中公知的，普通的医疗和兽医工作者可基于患者的特征，如年龄、体重、性别、状况、并发症、其它疾病等确定治疗有效量。
在上面关于本发明的第四方面中鉴别了所述化合物可用于的合适的疾病和状况。
优选地，以足以(至少部分地)抑制tTGase-调节的蛋白质修饰(即交联)的量给予根据本发明第一方面的化合物或根据本发明的第二方面的药物制剂。更优选地，以足以使tTGase-调节的蛋白质交联抑制至少10％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的量给予所述化合物或制剂。更优选地，以足以完全抑制tTGase-调节的蛋白质交联的量给予所述化合物或制剂。
可通过本领域中已知的方法测量TGase-调节的蛋白质修饰。例如，检测体液中的异二肽ε(γ-谷氨酰基)赖氨酸可用作涉及该蛋白质交联的疾病中的交联频率的间接测量。因此，体液中异二肽(isodipeptide)的减少提供了减少的蛋白质交联的间接测量(参见Nemes et al.,2002,Minerva Biotechnology 14,183)。
可选地，可进行组织活检并分析，例如在材料的蛋白水解消化后通过离子交换或反相HPLC(Griffin&Wilson,1984,Mol.Cell Biochem.58:37-49)，或通过染色活组织切片及通过免疫组织化学分析(Skill et al.,2001,81:705-716)。
在其它实施方式中，以足以至少部分地抑制血管生成的量给予所述化合物或制剂。
例如，受试者可具有疾病或状况，或者具有发展为疾病或状况的风险，所述疾病或状况选自由纤维化(如囊性纤维化)、疤痕形成、神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、亨廷顿氏病和帕金森病)、自体免疫疾病(如多发性硬化和腹腔病)、血栓形成、增生性病症(如癌症)、AIDS、银屑病和炎症(如慢性炎 性疾病)组成的组
本领域技术人员可以理解，所述治疗可为预防性和/或治疗性。例如，本发明的化合物和制剂可用于减缓和/或预防正在治疗的受试者的疾病/病症的发作。可选地或此外，本发明的化合物或制剂可用于减小或根除正在治疗的受试者中的疾病/病症的症状。
本领域技术人员可以进一步理解，可通过本领域中已知或开发的任何途径分别给予本发明的第一个方面和第二方面的化合物或制剂。例如，可通过肠胃外注射(例如静脉内、皮下或肌肉内)、口服或局部地给予所述化合物或制剂。
在一个实施方式中，全身例如通过静脉内给予所述化合物或制剂，。可选地，局部给药所述化合物或制剂，例如在待抑制TGase-调节的蛋白质修饰的靶位点或在待抑制的TGase-调节的蛋白质修饰的靶位点。
用本发明的化合物或制剂治疗可由单次给药或在一段时间内多次给药组成。有利地，重复地给予所述化合物或制剂。
本发明的化合物和制剂还可通过外科植入装置给药，该外科植入装置直接释放所述化合物或制剂到所需的位点，例如在实体瘤附近。
本领域的技术人员可以理解本发明的化合物可用于治疗任何哺乳动物。优选地，所述受试者是人类。可选地，所述受试者可为狗、猫、马或其它家养哺乳动物或农场用哺乳动物。
本发明的再一个方面提供了用于预防或治疗移植器官的排斥的方法，该方法包括使所述器官接触根据本发明的第一个方面的化合物或根据本发明的第二方面的制剂。因此，本发明提供了根据本发明的第一方面的化合物在制备用于预防或治疗移植器官的排斥的药物中的用途。
在一个实施方式中，所述器官为心脏、肺、肾脏或肝脏。
因此，所述器官可为肾脏。待被移植的肾脏经常显示组织型谷氨酰胺转移酶以及可能的其它谷氨酰胺转移酶的一些上调。此外，在移植后被排斥的肾脏经常呈现过多的瘢痕形成以及谷氨酰胺转移酶活性的上调和交联(Abo-Zenah et al.,2001,J.Am.Soc.Nephrol.12,4454A)。可通过用谷氨酰胺转移酶抑制剂处理肾脏(或其它器官)来预防这样的组织退化及随后的器官排斥。
可以理解，可在移植所述器官之前、期间和/或之后递送所述化合物或制剂。因此，在一个实施方式中，在移植前处理所述器官，例如，通过用包含根据本发明第一方面的化合物的溶液灌注和/或浸润。
在可选的实施方式中，在移植到患者期间和/或之后，处理所述器官。有利地，在移植位点或在移植位点附近递送所述化合物或制剂，例如通过局部给药。
现将参照下面的附图描述体现本发明的某些方面的优选的非限制性实施例。
图1显示了本发明的示例性TGase抑制剂化合物对细胞内组织型谷氨酰胺转移酶(TG2)活性的作用。三种测试化合物包括基于丙烯酰胺的R3“弹头(warhead)”基团(1-155、1-180和2-16)，以及三种测试化合物包括基于磺酰胺的R3“弹头”基团(1-159、1-178和2-18)。
实施例
实施例1–合成本发明的示例性化合物
分析方法
在配备有ID5 Diamond ATR配件的Thermo Scientific Nicolet iS5FT-IR光谱仪上记录红外(IR)光谱。信号强度缩写如下：弱(w)、中等(m)和强(s)。
用Bruker Avance DPX250(分别在250.131MHz和62.895MHz下)记录在CDCl3和DMSO中的1H NMR和13C NMR，使用四甲基硅烷(TMS)作为内标。以百万分率(ppm)报告化学位移，并以赫兹[Hz]为单位报告耦合常数。峰裂数(Multiplicities)缩写如下：单峰(s)、双峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、五重峰(p)、六重峰(sx)、七重峰(sp)、表观单峰(as)、表观双峰(ad)、表观三重峰(at)
用Waters-LCT Premier记录低分辨率质谱(MS)。并在EPSRC国家质谱中心(EPSRC National Mass Spectrometry Centre，Swansea(UK))用Thermo Fischer Scientific LTQ Orbitrap XL记录高分辨率质谱(HRMS)。
用Reichert-Jung Thermo Galen—配备有Pt 100/RTD温度传感器的高温热台显微镜(Hot Stage Microscope)记录熔点。
在氮气压力下，在Merck 40-70nM(230-400目)的硅胶上进行快速色谱法。在Merck硅胶60F254预涂布板上进行薄层色谱法(TLC)。用紫外线(λ＝ 254/365nm)进行可视化，并且必要时，使用高锰酸钾的乙醇溶液。
合成路线的概述
(a)合成氨基甲酸酯中间体的一般方案
a)p-NO2-苯基氯甲酸酯，NMM/DCM/0℃，2h；b)哌嗪，TEA/DMF/0℃至室温，12h
(b)合成胺前体的一般方案
(c)合成最终衍生物的一般方案
(d)合成最终的衍生物
i)溴乙酰溴或氯乙酰氯，TEA/DCM/-78℃至r.t，12h；ii)乙酰溴，TEA/DCM/-78℃，2h；
iii)乙酰氯，TEA/ACN/0℃至r.t，3h；iv)2-氯乙基磺酰氯，TEA/DCM/-60℃至0℃，4h；
合成对硝基苯基碳酸酯(A)的一般方法
在氮气气氛下，将N-甲基吗啉(1.6eq.)加入到相应的醇(1eq.，3mmol)在DCM(20ml)中的溶液。冷却混合物到0℃，然后缓慢加入对硝基苯基氯甲酸酯(1.5eq.)在DCM(5ml)中的溶液，并且在0℃剧烈搅拌所述混合物，直到完全消耗起始材料(通常1-2h)。用DCM(75ml)稀释反应混合物，然后用碳酸氢钠洗涤(饱和水溶液，3×100ml)。经硫酸镁干燥回收的有机层，并在真空下蒸发溶剂。
(a)4-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯甲酸甲酯(1b)
将按照所述一般方案获得的粗产物用甲醇洗涤，然后用二乙醚洗涤，并在减压下进一步干燥，以去除痕量的溶剂。C16H13NO7；产率88％；白色固体；熔点95-96℃；M＝331.28g/mol；IR(ATR)：ν＝1763(s),1706(s),1527(s),1448(m),1430(m),1281(m),1208(m-s),980(m),853(m-s),753(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.28(d,J＝9.2Hz,2H),8.08(d,J＝8.3Hz,2H),7.51(d,J＝8.3Hz,2H),7.38(d,J＝9.2Hz,2H),5.35(s,2H),3.93(s,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.7(Cq),155.5(Cq),152.5(Cq),145.6(Cq),139.2(Cq),130.8(Cq),130.2(2CH),128.2(2CH),125.5(2CH),121.9(2CH),70.2(CH2),52.4(CH3)；MS:m/z＝354[M+Na]+；
(b)(4-硝基苯基)碳酸2-萘基甲基酯(1c)
将按照所述一般方案获得的粗产物用甲醇洗涤，然后用二乙醚洗涤，并在减压下进一步干燥，以去除痕量的溶剂。C18H13NO5；产率67％；白色固体；熔点151-152℃；M＝323.30g/mol；IR(ATR)：ν＝1748(s),1524(m),1351(m),1263(s),1214(s),953(m),859(m),750(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.31-8.24(m,2H),7.92-7.84(m,4H),7.56-7.50(m,3H),7.42-7.36(m,2H),5.47(s,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ155.7(Cq),152.6(Cq),145.5 (Cq),133.6(Cq),133.2(Cq),131.7(Cq),128.9(CH),128.3(CH),128.3(CH),127.9(CH),126.9(CH),126.7(CH),126.0(CH),125.4(2CH),121.9(2CH),71.3(CH2)；MS:m/z＝346[M+Na]+；
(c)6-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]萘-2-羧酸甲酯(1d)
将按照所述一般方案获得的粗产物不经进一步的纯化用于接下来的步骤。C20H15NO7；白色固体；产率88％；M＝381.34g/mol；IR(ATR)：ν＝1754(s),1715(s),1515(s),1384(m),1254(m),1208(m-s),853(m-s),750(w)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),8.31-8.25(m,2H),8.11(dd,J＝8.6Hz,J＝1.6Hz,1H),8.01(d,J＝8.5Hz,1H),7.95(as,1H),7.91(d,J＝8.7Hz,1H),7.60(dd,J＝8.4Hz,J＝1.7Hz,1H),7.43-7.36(m,2H),5.48(s,2H),4.00(s,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.2(Cq),155.6(Cq),152.6(Cq),145.6(Cq),135.4(Cq),134.3(Cq),132.6(Cq),131.0(CH),130.3(CH),128.5(CH),128.4(Cq),127.8(CH),126.6(CH),126.1(CH),125.5(2CH),121.9(2CH),70.9(CH2),52.5(CH3)；MS:m/z＝404[M+Na]+；
(d)(4-硝基苯基)碳酸1-金刚烷基甲基酯(1f)
将按照所述一般方案获得的粗产物用甲醇洗涤，然后用二乙醚洗涤，并在减压下进一步干燥，以去除痕量的溶剂。C18H21NO5；产率82％；白色固体；熔点102-103℃；M＝331.36g/mol；IR(ATR)：ν＝2913(m),2847(m),1748(s),1518(s),1342(m-s),1266(m-s),1217(s),856(m),762(w),729(w)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.31-8.25(m,2H),7.42-7.36(m,2H),3.89(s,2H),2.03(s,3H),1.79-1.70(m,6H),1.61(d,J＝2.6Hz,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ155.9(Cq),152.9(Cq),145.4(Cq),125.4(2CH),121.9(2CH),79.1(CH2),39.0(3CH2),36.9(3CH2),33.5(Cq),28.0(3CH)；MS:m/z＝354[M+Na]+；
(e)(4-硝基苯基)碳酸2-(1-金刚烷基)乙基酯(1g)
将按照所述一般方案获得的粗产物用甲醇洗涤，然后用二乙醚洗涤，并在减压下进一步干燥，以去除痕量的溶剂。C19H23NO5；产率81％；白色固体；熔点94-95℃；M＝345.39g/mol；IR(ATR)：ν＝2898(m),2841(w),1757(s),1527(s),1342(s),1260(s),1205(s),950(m),856(s),668(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.31-8.35(m,2H),7.41-7.34(m,2H),4.35(t,J＝7.5Hz,2H),1.98(as,3H),1.75-1.62(m,6H),1.59-1.53(m,8H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ155.7(Cq),152.6(Cq),145.4(Cq),125.4(2CH),121.9(2CH),66.4(CH2),42.5(3CH2),42.3(CH2),37.0(3CH2),31.8(Cq),28.6(3CH)；MS:m/z＝368[M+Na]+；
哌嗪烷基化步骤(B)的一般方法
在惰性气氛和0℃下，将先前获得的碳酸酯(1eq.，1.5mmol)加入到哌嗪(2eq.)和TEA(5eq.)在DMF(20ml)中的溶液。让混合物回到室温，并剧烈搅拌过夜。在完全消耗起始材料后，用乙酸乙酯(100ml)稀释所述混合物，并用氯化钠(饱和水溶液，3×200ml)洗涤。经硫酸镁干燥有机层，过滤，并在减压下蒸发溶剂。
(a)(4-甲氧基羰基苯基)甲基哌嗪-1-羧酸酯(2b)
通过进行快速色谱法(洗脱液：DCM/MeOH 9/1)进一步纯化按照所述一般方案获得的粗产物，以得到最终的衍生物。C14H18N2O4；产率64％；浅黄色固体；熔点69-70℃；M＝278.30g/mol；IR(ATR)：ν＝3338(w),2950(w),1709(s),1687(s),1433(s),1423(s),1405(s),1275(s),1226(s),1129(s),1105(s),798(m),762(s),750(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.03(d,J＝8.3Hz,2H),7.41(d,J＝8.1Hz,2H),5.18(s,2H),3.91(s,3H),3.49(t,J＝5.1Hz,4H),2.84(t,J＝4.7Hz,4H),1.86(s,1H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.9 (Cq),155.2(Cq),142.0(Cq),130.0(2CH),129.9(Cq),127.5(2CH),66.5(CH2),52.3(CH3),45.9(2CH2),45.1(2CH2)；MS:m/z＝279[M+H]+；
(b)哌嗪-1-羧酸2-萘基甲基酯(2c)
通过进行快速色谱法(洗脱液：DCM/MeOH 9/1)进一步纯化按照所述一般方案获得的粗产物，以得到最终的衍生物。C16H18N2O2；产率92％；白色固体；熔点44-45℃；M＝270.33g/mol；IR(ATR)：ν＝3259(w),2913(w),1681(s),1442(m),1417(m),1229(s),1129(m),1111(m),1084(m),744(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.85-7.81(m,4H),7.51-7.44(m,3H),5.29(s,2H),3.49(t,J＝5.1Hz,4H),2.82(as,4H),2.25(s,1H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ155.4(Cq),134.2(Cq),133.3(Cq),133.2(Cq),128.4(CH),128.1(CH),127.8(CH),127.1(CH),126.3(CH),126.3(CH),125.9(CH),67.7(CH2),45.8(2CH2),44.8(2CH2)；MS:m/z＝271[M+H]+；
(c)哌嗪-1-羧酸(6-甲氧基羰基-2-萘基)甲基酯(2d)
通过进行快速色谱法(洗脱液：DCM/MeOH 9/1)进一步纯化按照所述一般方案获得的粗产物，以得到最终的衍生物。C18H20N2O4；产率85％；白色固体；熔点94-95℃；M＝328.36g/mol；IR(ATR)：ν＝3320(w),2950(w),1712(m),1681(s),1433(m),1287(m),1226(m),1193(m),1120(m),1075(m),756(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),8.07(dd,J＝8.6Hz,J＝1.7Hz,1H),7.95(d,J＝8.5Hz,1H),7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.84(s,1H),7.53(dd,J＝8.5Hz,J＝1.6Hz,1H),5.31(s,2H),3.98(s,3H),3.51(t,J＝5.1Hz,4H),2.85(at,J＝4.6Hz,4H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.3(Cq),155.3(Cq),137.0(Cq),135.5(Cq),132.3(Cq),130.9(CH),129.9(CH),128.4(CH),127.8(Cq),126.6(CH),126.5(CH),125.8(CH),67.1(CH2),52.4(CH3),46.0(2CH2),45.1(2CH2)；MS:m/z＝329[M+H]+和351[M+Na]+；
(d)哌嗪-1-羧酸1-金刚烷基甲基酯(2f)
然后在不进行进一步纯化的情况下使用按照所述一般方案获得的粗产物。C16H26N2O2；产率62％；浅黄色固体；M＝278.39g/mol；IR(ATR)：ν＝2883(m-s),2841(m),1678(s),1427(s),1232(s),1120(m),765(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ3.66(s,2H),3.44(t,J＝5.1Hz,4H),2.82(t,J＝5.1Hz,4H),2.13(s,1H),1.96(as,3H),1.73-1.60(m,6H),1.51(d,J＝2.5Hz,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ155.9(Cq),75.2(CH2),46.0(2CH2),44.9(2CH2),39.5(3CH2),37.1(3CH2),33.6(Cq),28.2(3CH)；MS:m/z＝279[M+H]+；
(e)哌嗪-1-羧酸2-(1-金刚烷基)乙基酯(2g)
通过进行快速色谱法(洗脱液：DCM/MeOH 95/5)进一步纯化按照所述一般方案获得的粗产物，以得到最终的衍生物。C17H28N2O2；产率77％；浅黄色油状物，静置时变成浅黄色固体；熔点56-57℃；M＝292.42g/mol；IR(ATR)：ν＝2895(s),2837(m),1687(s),1436(s),1232(s),1120(s),1087(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ4.12(t,J＝7.3Hz,2H),3.42(t,J＝5.0Hz,4H),2.81(t,J＝5.0Hz,4H),1.93(as,3H),1.71-1.58(m,6H),1.52-1.51(m,6H),1.41(t,J＝7.3Hz,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ155.8(Cq),61.9(CH2),46.0(2CH2),44.9(2CH2),43.0(CH2),42.7(3CH2),37.2(3CH2),31.9(Cq),28.7(3CH)；MS:m/z＝293[M+H]+；
(f)N-[2-[4-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(2h)
按照前面所述的一般方法获得偶联化合物。通过快速色谱法(DCM/MeOH 98/2)纯化所述粗产物，以产生标题的衍生物。C23H32N4O5S；产率89％；浅黄色固体；熔点176-177℃；M＝476.59g/mol；IR(ATR)：ν＝3287(w),2977 (w),1703(m),1642(s),1339(m),1232(m),1160(s),1141(s),932(m),798(s),710(m),616(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.58(d,J＝8.5Hz,1H),8.35(d,J＝8.7Hz,1H),8.19(dd,J＝7.4Hz,J＝1.3Hz,1H),7.54(dd,J＝8.6Hz,J＝7.5Hz,2H),7.19(d,J＝7.0Hz,1H),5.36(as,1H),3.86(d,J＝4.5Hz,2H),3.67–3.63(m,2H),3.44–3.40(m,2H),3.19–3.15(m,4H),2.88(s,6H),1.40(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.0(Cq),155.8(Cq),152.0(Cq),132.2(Cq),131.3(CH),131.0(CH),130.4(Cq),130.2(Cq),128.5(CH),123.3(CH),119.4(CH),115.5(CH),79.9(Cq),45.6(CH2),45.5(2CH3),45.4(CH2),44.2(CH2),42.2(CH2),41.6(CH2),28.4(3CH3)；MS:m/z＝499[M+Na]+；
偶联肽步骤(C)的一般方法
在惰性气氛和室温下，向先前获得的哌嗪(1.85mmol，1eq.)在二氯甲烷(DCM，15ml)中的溶液依次加入：N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC，1.85mmol，1eq.)、1-羟基苯并三唑(0.37mmol，0.2eq.)、相应的Boc保护的氨基酸(1.85mmol，1eq.)和N-甲基吗啉(5.55mmol，3eq.)。在搅拌12个小时后，通过加入75ml的DCM来稀释反应混合物，并用柠檬酸(10％水溶液，3×50ml)洗涤，然后用盐水洗涤。然后经硫酸镁干燥有机相，过滤，并在真空下蒸发溶剂。通过快速色谱法纯化粗产物，以产生期望的偶联产物。(a)4-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸苄酯(3a)
通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc/PE 5/5)纯化按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物。C19H27N3O5；产率95％；白色固体；熔点66-67℃；M＝377.43g/mol；IR(ATR)：ν＝3329(w),2971(w),1691(s),1627(m),1527(m),1420(m),1223(s),1153(m),756(m),695(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.40-7.32(m,5H),5.48(as,1H),5.14(s,2H),3.96(d,J＝4.4Hz,2H),3.69-3.60(m,2H),3.53-3.49(m,4H),3.45-3.47(m,2H),1.44(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.2(Cq),155.9(Cq),155.2(Cq),136.4(Cq),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),79.9(Cq),67.7(CH2),44.3(CH2),43.7(CH2),43.6(CH2),42.4 (CH2),41.8(CH2),28.5(3CH3)；MS:m/z＝400[M+Na]+；
(b)4-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸(4-甲氧基羰基苯基)甲基酯(3b)
通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc/PE 5/5)纯化按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物。C21H29N3O7；产率80％；白色固体；熔点90-91℃；M＝435.47g/mol；IR(ATR)：ν＝2977(w),1703(s),1651(s),1430(m),1278(m),1223(m),1160(m),1105(m),1017(m),756(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.41(d,J＝8.4Hz,2H),5.47(as,1H),5.20(s,2H),3.97(d,J＝4.5Hz,2H),3.92(s,3H),3.70-3.62(m,2H),3.56-3.50(m,4H),3.41-3.37(m,2H),1.44(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.3(Cq),166.8(Cq),154.9(Cq),141.4(2Cq),130.1(Cq),130.0(2CH),127.7(2CH),80.0(Cq),67.0(CH2),52.3(CH3),44.3(CH2),43.7(2CH2),42.4(CH2),41.8(CH2),28.5(3CH3)；MS:m/z＝458[M+Na]+；
(c)4-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸2-萘基甲基酯(3c)
通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc/PE 5/5)纯化按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物。C23H29N3O5；产率91％；白色固体；熔点41-42℃；M＝427.49g/mol；IR(ATR)：ν＝3332(w),2971(w),1697(s),1645(s),1460(m),1427(s),1214(s),1160(m),1117(w),1017(w),747(w)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.87-7.82(m,4H),7.53-7.45(m,3H),5.48(as,1H),5.31(s,2H),3.96(d,J＝4.4Hz,2H),3.69-3.61(m,2H),3.56-3.50(4H),3.42-3.33(m,2H),1.44(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.3(Cq),155.9(Cq),155.2(Cq),133.8(Cq),133.3(Cq),133.3(Cq),128.6(CH),128.1(CH),127.9(CH),127.5(CH),126.5(CH),126.5(CH),126.0(CH),79.9(Cq),67.9(CH2),44.3(CH2),43.7(2CH2), 42.4(CH2),41.8(CH2),28.5(3CH3)；MS:m/z＝450[M+Na]+；
(d)4-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙酰基]-哌嗪-1-羧酸(6-甲氧基羰基-2-萘基)甲基酯(3d)。
通过快速色谱法(洗脱液：DCM/MeOH 95/5)纯化按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物。C25H31N3O7；产率97％；白色固体；熔点43-44℃；M＝485.53g/mol；IR(ATR)：ν＝3350(w),2974(w),1697(s),1651(s),1460(m),1423(s),1366(m),1284(m),1220(m-s),1163(m),762(w)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),8.08(dd,J＝8.6Hz,J＝1.6Hz,1H),7.96(d,J＝8.5Hz,1H),7.88(d,J＝1Hz,1H),7.84(s,1H),7.52(dd,J＝8.4Hz,J＝1.6Hz,1H),5.47(s,1H),5.33(s,CH2),3.99-3.98(m,5H),3.70-3.62(m,2H),3.58-3.52(m,4H),3.41-3.36(m,2H),1.44(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.3(Cq),155.1(Cq),136.4(Cq),135.(Cq),132.3(Cq),130.9(CH),130.0(CH),128.4(CH),128.0(Cq),127.0(CH),126.6(CH),125.9(CH),80.0(Cq),67.6(CH2),52.4(CH3),44.3(CH2),43.8(CH2),43.7(CH2),42.4(CH2),41.8(CH2),28.5(3CH3)；MS:m/z＝508[M+Na]+；
(e)N-[2-[4-(金刚烷-1-羰基)哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯(3e)
随后通过进行快速色谱法(洗脱液：PE/EtOAc 5/5)纯化按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物，以得到期望的衍生物。C22H35N3O4；产率78％；白色固体；熔点187-188℃；M＝405.53g/mol；IR(ATR)：ν＝3423(w),2904(m),1712(s),1642(s),1615(s),1442(m-s),1399(m),1153(m),1008(m)cm-1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ6.75(t,J＝5.7Hz,1H),3.78(d,J＝5.8Hz,2H),3.65-3.49(m,4H),3.47-3.36(m,4H),1.97(as,3H),1.90(as,6H),1.73-1.63(m,6H),1.38(s,9H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ174.6(Cq),167.6(Cq),155.8 (Cq),77.9(Cq),44.6(2CH2),44.1(CH2),41.7(2CH2),40.9(Cq),28.4(3CH2),36.0(3CH2),28.2(3CH),27.9(3CH3)；MS:m/z＝428[M+Na]+；
(f)4-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸1-金刚烷基甲基酯(3f)
随后通过快速色谱法(洗脱液：PE/EtOAc 5/5)纯化按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物。C23H37N3O5；产率78％；白色固体；熔点156-157℃；M＝435.56g/mol；IR(ATR)：ν＝3405(w),2907(m),1712(s),1678(s),1639(s),1475(m-s),1430(s),1229(m-s),1163(m-s)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ5.48(as,1H),3.97(d,J＝4.4Hz,2H),3.71(s,2H),3.65-3.59(m,2H),3.53-3.47(m,4H),3.40-3.37(m,2H),1.99(as,3H),1.76-1.62(m,6H),1.53(d,J＝2.5Hz,6H),1.45(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.3(Cq),155.9(Cq),155.7(Cq),79.9(Cq),75.6(CH2),44.3(CH2),43.7(CH2),43.6(CH2),42.4(CH2),41.9(CH2),39.5(3CH2),37.1(3CH2),33.6(Cq),28.5(3CH3),28.1(3CH)；MS:m/z＝458[M+Na]+；
(g)4-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸2-(1-金刚烷基)乙基酯(3g)
随后通过快速色谱法(洗脱液：PE/EtOAc 5/5)纯化按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物。C24H39N3O5；产率78％；白色固体；熔点167-168℃；M＝449.58g/mol；IR(ATR)：ν＝3362(w),2898(m),2844(w),1706(m-s),1687(m-s),1645(s),1463(m),1427(m-s),1217(s),1156(m),1123(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ5.48(as,1H),4.14(t,J＝7.3Hz,2H),3.95(d,J＝4.4Hz,2H),3.62-3.58(m,2H),3.47-3.41(m,4H),3.37-3.34(m,2H),1.93(as,3H),1.72-1.58(m,6H),1.51(d,J＝2.5Hz,6H),1.43-1.39(m,11H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.2(Cq),155.9(Cq),155.5(Cq),79.9(Cq),62.5(CH2),44.3(CH2),43.6(CH2),43.5(CH2),42.9(CH2),42.7(3CH2),42.4(CH2),41.9(CH2), 37.1(3CH2),31.9(Cq),28.7(3CH),28.5(3CH3)；MS:m/z＝472[M+Na]+；
(h)4-[(2R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(3i)
然后在不经任何进一步纯化的情况下使用按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物。C20H29N3O5；无色粘性油；产率90％；M＝391.46g/mol；IR(ATR)：ν＝2980(w),1700(s),1645(s),1423(m),1217(m),1160(m),1014(m),765(w),695(w)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.39-7.32(m,5H),5.49(d,J＝8.1Hz,1H),5.15(s,2H),4.60(p,J＝7.1Hz,1H),3.74-3.39(m,8H),1.43(s,9H),1.29(d,J＝6.9Hz,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ171.6(Cq),155.2(2Cq),136.4(Cq),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),79.9(Cq),67.7(CH2),46.2(CH),45.3(CH2),44.0(CH2),43.7(CH2),42.0(CH2),28.5(3CH3),19.3(CH3)；MS:m/z＝414[M+Na]+；
(i)4-[(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(3j)
然后在不经任何进一步纯化的情况下使用按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物。C20H29N3O5；无色粘性油；产率90％；M＝391.46g/mol；IR(ATR)：ν＝2974(w),1694(s),1639(s),1433(m),1220(m),1163(m),1014(m),762(w),698(w)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.40-7.30(m,5H),5.47(d,J＝7.9Hz,1H),5.15(s,2H),4.60(p,J＝7.1Hz,1H),3.76-3.39(m,8H),1.43(s,9H),1.29(d,J＝6.9Hz,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ184.8(Cq),171.6(Cq),155.2(2Cq),136.4(Cq),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),79.9(Cq),67.7(CH2),46.2(CH),45.3(CH2),44.0(CH2),43.7(CH2),42.0(CH2),28.5(3CH3),19.5(CH3)；MS:m/z＝414[M+Na]+；
(j)4-[(2R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(3k)
然后在不经任何进一步纯化的情况下使用按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物。C26H33N3O5；无色粘性油；产率97％；M＝467.56g/mol；IR(ATR)：ν＝3314(w),2968(w),1700(s),1636(s),1423(m),1220(m-s),1163(m-s),1011(w-m),750(w),698(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.41-7.17(m,10H),5.41(d,J＝8.6Hz,1H),5.10(s,2H),4.85-4.75(m,1H),3.60-3.14(m,6H),3.06-2.87(m,3H),2.66-2.57(m,1H),1.42(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ170.6(Cq),155.2(Cq),155.1(Cq),136.5(Cq),136.4(Cq),129.7(2CH),128.8(2CH),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),127.3(CH),80.1(Cq),67.6(CH2),51.1(CH),45.4(CH2),43.4(CH2),43.4(CH2),41.8(CH2),40.6(CH2),28.5(3CH3)；MS:m/z＝490[M+Na]+；
(k)4-[(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(3l)
然后在不经任何进一步纯化的情况下使用按照前面所述的一般方案获得的粗衍生物。C26H33N3O5；无色粘性油；产率97％；M＝467.56g/mol；IR(ATR)：ν＝2971(w),1700(s),1633(s),1420(m),1220(s),1163(s),1011(m),695(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.41-7.17(m,10H),5.41(d,J＝8.5Hz,1H),5.10(s,2H),4.85-4.75(m,1H),3.60-3.38(m,3H),3.33-3.14(m,3H),3.06-2.87(m,3H),2.67-2.57(m,1H),1.42(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ170.6(Cq),155.2(Cq),155.1(Cq),136.5(Cq),136.4(Cq),129.7(2CH),128.8(2CH),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),127.3(CH),80.1(Cq),67.6(CH2),51.1(CH),45.4(CH2),43.4(2CH2),41.8(CH2),40.6(CH2),28.5(3CH3)；MS:m/z＝490[M+Na]+；
氨基甲酸酯脱保护步骤(D)的一般方案
将先前获得的氨基甲酸酯(1.2mmol)溶解在DCM(15ml)中，并在室温与过量的三氟乙酸(9.6mmol，8eq.)反应，直到完全消耗起始材料(通常3h)。在反应结束时，用DCM(35ml)稀释混合物，并用氯化氢(水溶液0.5M，3×50ml)洗涤。通过加入碳酸钾(饱和溶液)将合并的水层的pH调节至9-10，然后用DCM(3×75ml)萃取。经硫酸镁干燥合并的有机层，并在减压下蒸发溶剂。在不经任何其它纯化的情况下，进一步使用获得的胺。
(a)4-(2-氨基乙酰基)-1-羧酸苯甲酯(4a)
C14H19N3O3；产率82％；白色固体；熔点52-53℃；M＝277.32g/mol；IR(ATR)：ν＝3526(w),2901(w),1678(s),1642(s),1420(m-s),1363(w),1281(w),1229(s),1123(m-s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.38-7.32(m,5H),5.14(s,2H),3.70-3.58(m,2H),3.52-3.50(m,4H),3.47(s,2H),3.43-3.30(m,2H),1.80(s,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ171.5(Cq),155.2(Cq),136.4(Cq),128.6(2CH),128.3(CH),128.1(2CH),67.6(CH2),44.1(CH2),43.7(2CH2),43.4(CH2),41.8(CH2)；MS:m/z＝278[M+H]+；
(b)4-(2-氨基乙酰基)哌嗪-1-羧酸(4-甲氧基羰基苯基)甲基酯(4b)
C16H21N3O5；产率88％；浅黄色固体；熔点94-95℃；M＝335.36g/mol；IR(ATR)：ν＝3520(w),3350(w),2904(w),1715(s),1691(s),1624(m-s),1448(m-s),1430(s),1275(s),1226(s),1111(s),1065(m),759(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.03(d,J＝8.3Hz,2H),7.41(d,J＝8.3Hz,2H),5.20(s,2H),3.92(s,3H),3.69-3.59(m,2H),3.54-3.52(m,4H),3.47(s,2H),3.40-3.33(m,2H),1.62(s,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ171.6(Cq),166.8(Cq),155.0(Cq),141.5(Cq),130.1(Cq),130.0(2CH),127.7(2CH),66.9(CH2),52.3(CH3), 44.1(CH2),43.8(2CH2),43.5(CH2),41.8(CH2)；MS:m/z＝336[M+H]+；
(c)4-(2-氨基乙酰基)哌嗪-1-羧酸2-萘基甲基酯(4c)
C18H21N3O3；产率61％；白色固体；熔点109-110℃；M＝327.38g/mol；IR(ATR)：ν＝3526(w),3350(w),2907(w),1691(s),1618(s),1445(m),1433(s),1281(m-s),1220(s),804(s),735(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.86-7.82(m,4H),7.53-7.45(m,3H),5.31(s,2H),3.70-3.58(m,2H),3.57-3.50(m,4H),3.46(s,2H),3.43-3.30(m,2H),1.64(s,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ171.6(Cq),133.8(Cq),133.3(Cq),128.6(CH),128.1(CH),127.9(CH),127.4(CH),126.5(CH),126.5(CH),126.0(CH),67.9(CH2),44.1(CH2),43.8(2CH2),43.5(CH2),41.9(CH2)；MS:m/z＝328[M+H]+；
(d)4-(2-氨基乙酰基)哌嗪-1-羧酸(6-甲氧基羰基-2-萘基)甲基酯(4d)
C20H23N3O5；产率79％；浅黄色固体；熔点91-92℃；M＝385.41g/mol；IR(ATR)：ν＝2953(w),1718(m),1687(s),1639(m),1423(m),1281(m),1226(m),1196(m),1126(m),1075(w),759(w-m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),8.08(dd,J＝8.6Hz,J＝1.7Hz,1H),7.96(d,J＝8.5Hz,1H),7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.84(s,1H),7.53(dd,J＝8.5Hz,J＝1.6Hz,1H),5.33(s,2H),3.99(s,3H),3.69-3.63(m,2H),3.57-3.54(m,4H),3.47(s,2H),3.40-3.34(m,2H),1.60(s,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ171.7(Cq),167.3(Cq),155.1(Cq),136.5(Cq),135.5(Cq),132.3(Cq),130.9(CH),130.0(CH),128.4(CH),128.0(Cq),126.9(CH),126.6(CH),125.9(CH),67.5(CH2),52.4(CH3),44.1(CH2),43.8(2CH2),43.5(CH2),41.9(CH2)；MS:m/z＝386[M+H]+；
(e)1-[4-(金刚烷-1-羰基)哌嗪-1-基]-2-氨基-乙酮(4e)
C17H27N3O2；产率47％；白色固体；熔点231-132℃；M＝305.42g/mol；IR(ATR)：ν＝2904(m),2844(w),1697(w),1606(s),1414(m),1226(m),1005(m-s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ3.70-3.62(m,6H),3.47(s,2H),3.38-3.34(m,2H),2.04(as,3H),1.98-1.97(m,6H),1.77-1.66(m,6H),1.60(s,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ176.2(Cq),171.7(Cq),45.6(CH2),44.8(CH2),44.4(CH2),43.5(CH2),42.3(CH2),41.9(Cq),39.2(3CH2),36.7(3CH2),28.5(3CH)；MS:m/z＝306[M+H]+；
(f)4-(2-氨基乙酰基)哌嗪-1-羧酸1-金刚烷基甲基酯(4f)
C18H29N3O3；产率60％；无色粘性油；M＝335.44g/mol；IR(ATR)：ν＝3384(w),2901(m-s),2847(m),1694(s),1627(s),1457(m),1423(s),1223(s)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ3.70(s,2H),3.66-3.59(m,2H),3.53-3.48(m,6H),3.41-3.35(m,2H),2.04(as,3H),1.76-1.61(m,8H),1.53(d,J＝2.5Hz,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ171.5(Cq),155.7(Cq),75.6(CH2),44.1(CH2),43.6(2CH2),43.4(CH2),41.9(CH2),39.5(3CH2),37.1(3CH2),33.6(Cq),28.1(3CH)；MS:m/z＝336[M+H]+；
(g)4-(2-氨基乙酰基)哌嗪-1-羧酸2-(1-金刚烷基)乙基酯(4g)
C19H31N3O3；产率72％；浅黄色粘性油，静置时变成浅黄色固体；熔点58-59℃；M＝349.47g/mol；IR(ATR)：ν＝3375(m),2892(s),2844(m),1697 (s),1639(s),1448(m),1417(s),1375(m),1220(s),1123(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ4.15(t,J＝7.2Hz,2H),3.67-3.59(m,2H),3.54-3.48(m,6H),3.37-3.33(m,2H),1.93(as,3H),1.72-1.58(m,6H),1.51(d,J＝2.5Hz,6H),1.42(t,J＝7.3Hz,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ171.1(Cq),155.5(Cq),62.4(CH2),44.2(CH2),43.6(2CH2),43.2(CH2),42.9(CH2),42.7(3CH2),41.9(CH2),37.1(3CH2),31.9(Cq),28.7(3CH)；MS:m/z＝350[M+H]+；
(h)2-氨基-1-[4-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基]哌嗪-1-基]乙酮(4h)
C18H24N4O3S；产率95％；黄色固体；熔点82-83℃；M＝376.47g/mol；IR(ATR)：ν＝3441(w),2932(w),1654(m-s),1636(m-s),1451(m),1342(m),1323(m),1156(s),1144(s),941(m-s),896(m),789(s),707(s),619(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.58(d,J＝8.5Hz,1H),8.36(d,J＝8.7Hz,1H),8.19(dd,J＝7.4Hz,J＝1.2Hz,1H),7.53(dd,J＝8.5Hz,J＝7.6Hz,2H),7.18(d,J＝7.5Hz,1H),3.72-3.57(m,2H),3.50-3.31(m,4H),3.23-3.10(m,4H),2.88(s,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ171.2(Cq),152.0(Cq),132.2(Cq),131.2(CH),130.9(CH),130.4(Cq),130.2(Cq),128.4(CH),123.3(CH),119.4(CH),115.5(CH),45.6(CH2),45.5(2CH3),45.5(CH2),44.0(CH2),43.2(CH2),41.6(CH2)；MS:m/z＝377[M+H]+；
(i)4-[(2R)-2-氨基丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(4i)
C15H21N3O3；无色粘性油；产率41％；M＝291.35g/mol；IR(ATR)：ν＝3372(w),2922(w),1694(s),1639(s),1466(w),1417(m-s),1223(s),1117(m),1072(m),1020(m),729(m),698(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.38-7.31(m,5H),5.15(s,2H),3.90-3.36(m,9H),1.83(s,2H),1.25(d,J＝6.7Hz,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ174.9(Cq),155.2(Cq),136.4(Cq),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),67.7(CH2),47.1(CH),45.0(CH2),44.0(CH2), 43.8(CH2),42.0(CH2),21.7(CH3)；MS:m/z＝292[M+H]+；
(j)4-[(2S)-2-氨基丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(4j)
C15H21N3O3；无色粘性油，静置时变成白色固体；熔点：53-54℃；产率35％；M＝291.35g/mol；IR(ATR)：ν＝2965(w),1697(s),1633(s),1420(s),1366(m),1223(s),1129(m-s),984(m),886(m),732(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.40-7.31(m,5H),5.14(s,2H),3.85-3.36(m,9H),1.81(s,2H),1.25(d,J＝6.8Hz,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ174.9(Cq),155.2(Cq),136.4(Cq),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),67.7(CH2),47.1(CH),45.0(CH2),44.0(CH2),43.8(CH2),41.9(CH2),21.8(CH3)；MS:m/z＝292[M+H]+；(k)4-[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(4k)
C21H25N3O3；浅黄色粘性油；产率64％；M＝367.44g/mol；IR(ATR)：ν＝3365(w),2913(w),1697(s),1633(s),1427(m),1223(s),1117(w),747(m),695(m-s)；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.41-7.16(m,10H),5.10(s,2H),3.94(as,1H),3.66-3.19(m,6H),3.05-2.97(m,1H),2.94-2.81(m,2H),2.76-2.68(m,1H),1.89(宽s,2H)；MS:m/z＝368[M+H]+；
(l)4-[(2S)-2-氨基-3-苯基-丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(4l)
C21H25N3O3；浅黄色粘性油；产率46％；M＝367.44g/mol；IR(ATR)：ν＝3372(w),2919(w),1694(s),1636(s),1423(s),1226(s),1114(m),741(m), 692(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.41-7.16(m,10H),5.11(CH2),3.69-2.83(m,10H),2.74-2.67(m,1H),1.76(宽s,2H)；MS:m/z＝368[M+H]+；(m)合成4-(2-氨基乙酰基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(4m)。
在0℃下，4-(2-溴乙酰基)哌嗪-1-羧酸酯(9.77mmol，1eq.)在甲醇(26ml)中。密封反应瓶，并在室温剧烈搅拌所述化合物过夜。然后蒸发溶剂，残余物溶于氯化氢(水溶液，0.1N，100ml)，并用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。通过加入氢氧化钠(水溶液，1N)将回收的水层的pH调节为10，然后，用乙酸乙酯(3×100ml)提取有机物。经硫酸镁干燥合并的有机层，过滤，并在真空下蒸发溶剂，以产生浅黄色的粗产物。在二乙醚中进一步研磨，得到期望的胺，为白色固体，无需另外的纯化即可用于下一步骤。C11H21N3O3；产率58％；白色固体；熔点159-160℃；M＝243.30g/mol；IR(ATR)：ν＝2974(w),1675(s),1627(s),1417(m),1360(m),1235(m),1172(m),1123(m),990(m),759(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ3.71-3.41(m,10H),1.46(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ169.5(Cq),154.6(Cq),80.5(Cq),50.4(CH2),44.6(2CH2),41.7(2CH2)；HRMS：对于C11H21N3O3计算244.1661，测得244.1657；
合成丙烯酰胺衍生物(E)
将三乙胺(1.25mmol，5eq.)加入到先前获得的胺(0.25mmol，1eq.)在乙腈(5ml)中的溶液。冷却混合物到0℃，然后在氮气下加入丙烯酰氯(0.63mmol，2.5eq.)。在0℃搅拌3个小时后，用乙酸乙酯(100ml)稀释反应混合物，并用碳酸氢钠(饱和的水溶液，3×50ml)洗涤。经硫酸镁干燥回收的有机相，然后在减压下蒸发溶剂，以产生粗产物。
(a)4-[2-(丙-2-烯酰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(5a)
然后通过快速色谱法(洗脱液：DCM/MeOH 96/4)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C17H21N3O4；产率56％；无色粘性油；M＝331.37g/mol；IR(ATR)：ν＝3004(w),1691(s),1636(s),1420(s),1223(s),744(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.42-7.32(m,5H),6.73(as,1H),6.32(dd,J＝17.0Hz,J＝1.9Hz,1H),6.18(dd,J＝17.0Hz,J＝9.8Hz,1H),5.68(dd,J＝9.8Hz,J＝1.9Hz,1H),5.15(s,2H),4.15(d,J＝4.0Hz,2H),3.70-3.62(m,2H),3.57-3.50(m,4H),3.43-3.36(m,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.8(Cq),165.5(Cq),155.2(Cq),136.3(Cq),130.4(CH),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),127.1(CH2),67.8(CH2),44.4(CH2),43.7(CH2),43.6(CH2),41.9(CH2),41.4(CH2)；MS:m/z＝354[M+Na]+；HRMS：对于C17H22O4N3计算332.1605，测得332.1610(1.6ppm)。
(b)4-[2-(丙-2-烯酰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸(4-甲氧基羰基苯基)甲基酯(5b)
然后通过快速色谱法(洗脱液：DCM/MeOH 97/3)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C19H23N3O6；产率60％；白色固体；熔点159-160℃；M＝389.40g/mol；IR(ATR)：ν＝3284(w),2898(w),1703(s),1648(s),1427(s),1278(m),1214(m),1105(m),759(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,2H),6.68(as,1H),6.33(dd,J＝17.0Hz,J＝1.9Hz,1H),6.18(dd,J＝17.0Hz,9.9Hz,1H),5.69(dd,J＝9.8Hz,J＝1.9Hz,1H),5.21(s,2H),4.15(d,J＝4.1Hz,2H),3.92(s,3H),3.68-3.63(m,2H),3.59-3.52(m,4H),3.49-3.39(m,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.8(Cq),165.5(Cq),154.9(Cq),141.4(Cq),130.4(CH),130.2(Cq),130.0(2CH),127.7(2CH),127.0(CH2),67.0(CH2),52.3(CH3),44.3(CH2),43.8(CH2),43.7(CH2),41.9(CH2),41.4(CH2)；MS:m/z＝412[M+Na]+；HRMS：对于C19H24O6N3计算390.1660，测得390.1663(0.9ppm)。
(c)4-[2-(丙-2-烯酰基氨基)乙酰基]哌嗪-1羧酸2-萘基甲基酯(5c)
然后通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C21H23N3O4；产率59％；白色固体；熔点125-126℃；M＝381.43g/mol；IR(ATR)：ν＝3332(w),2925(w),1703(s),1663(m),1642(s),1621(s),1460(m),1436(m),1417(m),1220(s),817(w),750(w)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.86-7.82(m,4H),7.53-7.54(m,3H),6.71(as,1H),6.31(dd,J＝17.0Hz,J＝2.0Hz,1H),6.18(dd,J＝17.0Hz,J＝9.7Hz,1H),5.67(dd,J＝9.7Hz,J＝2.0Hz,1H),5.32(s,2H),4.14(d,J＝4.0Hz,2H),3.65-3.42(m,8H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.7(Cq),165.5(Cq),155.2(Cq),133.7(Cq),133.3(Cq),133.3(Cq),130.4(CH),128.6(CH),128.1(CH),127.9(CH),127.5(CH),127.1(CH2),126.5(CH),126.5(CH),126.0(CH),68.0(CH2),44.4(CH2),43.8(CH2),43.6(CH2),41.9(CH2),41.4(CH2)；MS:m/z＝404[M+Na]+；HRMS：对于C21H24O4N3计算382.1761，测得382.1765(1.0ppm)。
(d)4-[2-(丙-2-烯酰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸(6-甲氧基羰基-2-萘基)甲基酯(5d)
然后通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C23H25N3O6；产率71％；白色固体；熔点159-160℃；M＝439.46g/mol；IR(ATR)：ν＝3338(w),2938(w),1697(s),1666(s),1648(s),1618(s),1430(s),1290(s),1217(m),1123(m),804(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),8.08(dd,J＝8.6Hz,J＝1.7Hz,1H),7.96(d,J＝8.5Hz,1H),7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.85(s,1H),7.53(dd,J＝8.5Hz,J＝1.6Hz,1H),6.70(as,1H),6.32(dd,J＝17.0Hz,J＝1.9Hz,1H),6.18(dd,J＝17.0Hz,J＝9.8Hz,1H),5.68(dd,J＝9.8Hz,J＝1.9Hz,1H),5.33(s,2H),4.15(d,J＝4.1Hz,2H),3.98(s,3H),3.68-3.64(m,2H),3.60-3.53(m,4H),3.50-3.38(m,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.2(Cq),166.8(Cq),165.5(Cq),155.1(Cq),136.4(Cq),135.5(Cq),132.2(Cq),130.9(CH),130.4(CH),130.0(CH),128.4(CH),128.0(Cq),127.1(CH2),127.0(CH),126.6(CH),125.9(CH),67.6(CH2),52.4(CH3),44.3(CH2),43.8(CH2),43.7(CH2),41.9(CH2),41.4(CH2)；MS：m/z＝462[M+Na]+；HRMS：对于C23H26O6N3计算440.1816，测得440.1814(0.5ppm)。
(e)N-[2-[4-(金刚烷-1-羰基)哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]丙-2-烯酰胺(5e)
然后通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C20H29N3O3；产率41％；白色固体；熔点195-196℃；M＝359.46g/mol；IR(ATR)：ν＝3311(w),2910(m),1675(m-s),1642(m),1599(s),1557(m),1417(m),1223(s),1008(m-s),947(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ6.68(as,1H),6.32(dd,J＝17.0Hz,J＝1.9Hz,1H),6.18(dd,J＝17.0Hz,J＝9.9Hz,1H),5.69(dd,J＝9.8Hz,J＝1.9Hz,1H),4.15(d,J＝4.1Hz,2H),3.75-3.71(m,4H),3.66-3.63(m,2H),3.45-3.41(m,2H),2.06(as,3H),1.99-1.98(m,6H),1.79-1.68(m,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ176.3(Cq),166.8(Cq),165.5(Cq),130.5(CH),127.1(CH2),45.3(CH2),44.9(CH2),44.7(CH2),42.4(CH2),42.0(Cq),41.4(CH2),39.2(3CH2),36.7(3CH2),28.5(3CH)；MS:m/z＝382[M+Na]+；HRMS：对于C20H30O3N3计算360.2282，测得360.2287(1.5ppm)。
(f)4-[2-(丙-2-烯酰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸2-1-金刚烷基甲基酯(5f)
然后通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C21H31N3O4；产率48％；白色固体；熔点176-177℃；M＝389.49g/mol；IR(ATR)：ν＝3335(w),2892(m),2844(w),1687(s),1672(m),1621(s), 1469(m),1420(s),1251(m),1223(s)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ6.70(as,1H),6.32(dd,J＝17.0Hz,J＝1.9Hz,1H),6.18(dd,J＝17.0Hz,J＝9.8Hz,1H),5.68(dd,J＝9.8Hz,J＝1.9Hz,1H),4.16(d,J＝4.1Hz,2H),3.71(s,2H),3.68-3.62(m,2H),3.56-3.49(m,4H),3.46-3.42(m,2H),1.99(as,3H),1.77-1.62(m,6H),1.53(d,J＝2.5Hz,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.8(Cq),165.5(Cq),155.7(Cq),130.5(CH),127.1(CH2),75.7(CH2),44.4(CH2),43.7(CH2),43.5(CH2),42.0(CH2),41.5(CH2),39.5(3CH2),37.1(3CH2),33.6(Cq),28.1(3CH)；MS:m/z＝412[M+Na]+；HRMS：对于C21H32O4N3计算390.2387，测得390.2391(0.9ppm)。
(g)4-[2-(丙-2-烯酰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸2-(1-金刚烷基)乙基酯(5g)
然后通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C22H33N3O4；产率54％；白色固体；熔点155-156℃；M＝403.52g/mol；IR(ATR)：ν＝3317(w),2901(m-s),2847(w),1684(s),1624(s),1469(m),1427(s),1223(s)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ6.73(as,1H),6.32(dd,J＝17.0Hz,J＝1.9Hz,1H),6.18(dd,J＝17.0Hz,J＝9.8Hz,1H),5.68(dd,J＝9.8Hz,J＝1.9Hz,1H),4.19-4.13(m,4H),3.65-3.61(m,2H),3.50-3.46(m,4H),3.43-3.39(m,2H),1.94(as,3H),1.73-1.59(m,6H),1.52(d,J＝2.4Hz,6H),1.43(t,J＝7.3Hz,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.7(Cq),165.5(Cq),155.5(Cq),130.5(CH),127.0(CH2),62.5(CH2),44.4(CH2),43.6(CH2),43.5(CH2),42.9(CH2),42.7(3CH2),42.0(CH2),41.4(CH2),37.1(3CH2),31.9(Cq),28.7(3CH)；MS:m/z＝426[M+Na]+；HRMS：对于C22H34O4N3计算404.2544，测得404.2547(0.8ppm)。
(h)N-[2-[4-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]丙-2-烯酰胺(5h)
然后通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C18H24N4O3S；产率39％；浅黄色固体；熔点185-186℃；M＝430.52g/mol；IR(ATR)：ν＝2935(w),1651(s),1454(m),1436(m),1311(m),1141(s),941(s),789(s),704(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.59(d,J＝8.5Hz,1H),8.35(d,J＝8.7Hz,1H),8.21(dd,J＝7.4Hz,J＝1.2Hz,1H),7.55(dd,J＝8.5Hz,J＝7.5Hz,2H),7.19(d,J＝7.5Hz,1H),6.58(as,1H),6.28(dd,J＝17.0Hz,J＝1.8Hz,1H),6.13(dd,J＝17.0Hz,J＝9.9Hz,1H),5.65(dd,J＝9.9Hz,J＝1.8Hz,1H),4.05(d,J＝4.1Hz,2H),3.68(t,J＝5.1Hz,2H),3.47(t,J＝5.0Hz,2H),3.21(dt,J＝9.8Hz,J＝4.7Hz,4H),2.89(s,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.5(Cq),165.4(Cq),152.1(Cq),132.2(Cq),131.4(CH),131.0(CH),130.4(Cq),130.3(CH),130.3(Cq),128.5(CH),127.1(CH2),123.3(CH),119.3(CH),115.6(CH),45.6(CH2),45.6(2CH3),45.4(CH2),44.3(CH2),41.8(CH2),41.3(CH2)；MS:m/z＝453[M+Na]+；HRMS：对于C21H27O4N4S计算431.1748，测得431.1751(0.8ppm)。
(i)4-[(2R)-2-(丙-2-烯酰基氨基)丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(5i)
然后通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C18H23N3O4；无色粘性油；产率73％；M＝345.39g/mol；IR(ATR)：ν＝3290(w),2929(w),1697(s),1621(s),1423(s),1220(s),1020(m),759(m),695(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.41-7.32(m,5H),6.71(d,J＝7.1Hz,1H),6.30(dd,J＝17.0Hz,J＝1.7Hz,1H),6.12(dd,J＝17.0Hz,J＝10.0Hz,1H),5.66(dd,J＝10.0Hz,J＝1.7Hz,1H),5.15(s,2H),4.96(p,J＝6.9Hz,1H),3.79-3.40(m,8H),1.36(d,J＝6.8Hz,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ 171.2(Cq),164.7(Cq),155.2(Cq),136.4(Cq),130.7(CH),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),127.0(CH2),67.7(CH2),45.4(CH2),45.3(CH),44.0(CH2),43.7(CH2),42.1(CH2),19.2(CH3)；MS:m/z＝368[M+Na]+；HRMS：对于C18H24O4N3计算346.1761，测得346.1767(1.6ppm)。
(j)4-[(2S)-2-(丙-2-烯酰基氨基)丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(5j)
然后通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C18H23N3O4；白色固体；熔点121-122℃；产率72％；M＝345.39g/mol；IR(ATR)：ν＝3271(w),2929(w),1697(s),1624(s),1423(s),1223(s),1117(w-m),1011(m),759(m),695(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.40-7.35(m,5H),6.71(d,J＝7.1Hz,1H),6.29(dd,J＝17.0Hz,J＝1.6Hz,1H),6.12(dd,J＝17.0Hz,J＝10.0Hz,1H),5.66(dd,J＝10.0Hz,J＝1.6Hz,1H),5.15(d,2H),4.96(p,J＝7.0Hz,1H),3.81-3.40(m,8H),1.35(d,J＝6.8Hz,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ171.1(Cq),164.6(Cq),155.1(Cq),136.3(Cq),130.7(CH),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),127.0(CH2),67.7(CH2),45.3(CH2),45.2(CH),43.9(CH2),43.6(CH2),42.0(CH2),19.2(CH3)；MS:m/z＝368[M+Na]+；HRMS：对于C18H24O4N3计算346.1761，测得346.1767(1.6ppm)。
(k)4-[(2R)-3-苯基-2-(丙-2-烯酰基氨基)丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(5k)
然后通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C24H27N3O4；无色粘性油；产率79％；M＝421.49g/mol；IR(ATR)：ν＝3284(w),2929(w),1700(s),1621(s),1423(s),1220(s),729(m),692(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.41-7.18(m,10H),6.77(d,J＝8.0Hz,1H), 6.31(dd,J＝17.0Hz,J＝1.6Hz,1H),6.12(dd,J＝17.0Hz,J＝10.1Hz,1H),5.67(dd,J＝10.1Hz,J＝1.6Hz,1H),5.20(td,J＝9.0Hz,J＝5.3Hz,1H),5.10(s,2H),3.59-2.92(m,9H),2.68-2.58(m,1H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ170.2(Cq),164.9(Cq),155.0(Cq),136.4(Cq),136.0(Cq),130.5(CH),129.6(2CH),128.8(2CH),128.7(2CH),128.3(CH),128.1(2CH),127.5(CH),127.3(CH2),67.6(CH2),49.9(CH),45.4(CH2),43.3(2CH2),41.8(CH2),40.1(CH2)；MS:m/z＝444[M+Na]+；HRMS：对于C24H28O4N3计算422.2074，测得422.2077(0.6ppm)。
(l)4-[(2S)-3-苯基-2-(丙-2-烯酰基氨基)丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(5l)
然后通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化按照前面所述的一般方法获得的粗衍生物。C24H27N3O4；无色粘性油；产率65％；M＝421.49g/mol；IR(ATR)：ν＝3287(w),2925(w),1697(s),1621(s),1423(s),1220(s),1123(w),729(m),695(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.41-7.18(m,10H),6.77(d,J＝8.0Hz,1H),6.31(dd,J＝17.0Hz,J＝1.6Hz,1H),6.12(dd,J＝17.0Hz,J＝10.1Hz,1H),5.67(dd,J＝10.1Hz,J＝1.6Hz,1H),5.23(td,J＝9.0Hz,J＝5.3Hz,1H),5.10(s,2H),3.64-2.92(m,9H),2.68-2.58(m,1H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ170.2(Cq),164.9(Cq),155.0(Cq),136.4(Cq),136.0(Cq),130.5(CH),129.6(2CH),128.8(2CH),128.7(2CH),128.3(CH),128.1(2CH),127.5(CH),127.3(CH2),67.6(CH2),49.9(CH),45.4(CH2),43.3(2CH2),41.8(CH2),40.1(CH2)；MS:m/z＝444[M+Na]+；HRMS：对于C24H28O4N3计算422.2074，测得422.2077(0.6ppm)。
乙酰化步骤(F)的一般方法
在惰性气氛和-78℃下，将相应的乙酰化试剂溴乙酰溴或氯乙酰氯(1.65mmol，1.1eq.)缓慢地加入到相应的胺(1.5mmol，1eq.)和TEA(7.5mmol，5eq.) 在DCM(15ml)中的溶液中。在-78℃搅拌反应混合物3个小时，用DCM(75ml)稀释，并用氯化氢(水溶液0.2M，3×50ml)洗涤。经硫酸镁干燥回收的有机层，并在真空下蒸发溶剂，以产生粗产物。
(a)4-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(6a)
在二乙醚中进一步研磨使用前述一般方法获得的粗衍生物，以产生期望的乙酰化化合物，为固体。C16H20BrN3O4；产率84％；白色固体；熔点132-133℃；M＝398.25g/mol；IR(ATR)：ν＝3344(w),2904(w),1681(s),1621(s),1478(m),1423(s),1263(m-s),1223(s),750(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.51(as,1H),7.38-7.32(m,5H),5.15(s,2H),4.08(d,J＝4.1Hz,2H),3.89(s,2H),3.70-3.62(m,2H),3.57-3.48(m,4H),3.46-3.32(m,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.1(Cq),165.8(Cq),155.1(Cq),136.3(Cq),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),67.8(CH2),44.3(CH2),43.7(CH2),43.6(CH2),42.0(CH2),41.9(CH2),28.6(CH2)；MS：对于79Br，m/z＝420[M+Na]+，对于81Br，m/z＝422[M+Na]；HRMS：对于C16H21O4N3Br计算398.0710，测得398.0713(0.8ppm)。
(b)4-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙酰基]哌嗪-1-羧酸(4-甲氧基羰基苯基)甲基酯(6b)
在二乙醚中进一步研磨使用前述一般方法获得的粗衍生物，以产生期望的乙酰化化合物，为固体。C18H22BrN3O6；产率95％；浅米色固体；熔点134-135℃；M＝456.29g/mol；IR(ATR)：ν＝3284(m),2898(w),1715(m),1697(s),1675(m),1642(s),1433(m),1278(m),1223(s),1102(m),1026(m),759(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.51(as,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,2H),5.20(s,2H),4.09(d,J＝4.1Hz,2H),3.92(s,3H),3.90(s, 2H),3.68-3.62(m,2H),3.59-3.52(m,4H),3.46-3.36(m,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.2(Cq),165.9(Cq),154.9(Cq),141.3(Cq),130.2(Cq),130.1(2CH),127.8(2CH),67.0(CH2),52.3(CH3),44.3(CH2),43.8(CH2),43.7(CH2),41.9(2CH2),28.6(CH2)；MS:m/z＝480[M+Na]+；HRMS：对于C18H23O6N3Br计算456.0765，测得456.0768(0.7ppm)。
(c)4-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙酰基]哌嗪-1-羧酸2-萘基甲基酯(6c)
在二乙醚中进一步研磨使用前述一般方法获得的粗衍生物，以产生期望的乙酰化化合物，为固体。C20H22BrN3O4；产率77％；浅米色固体；熔点133-134℃；M＝448.31g/mol；IR(ATR)：ν＝3338(w),2922(w),1687(s),1621(s),1478(w),1423(s),1217(s),826(w),765(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.87-7.83(m,4H),7.52-7.45(m,4H),5.31(s,2H),4.08(d,J＝4.0Hz,2H),3.90(s,2H),3.66-3.40(m,8H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.1(Cq),165.8(Cq),155.2(Cq),133.7(Cq),133.3(2Cq),128.6(CH),128.1(CH),127.9(CH),127.5(CH),126.5(CH),126.5(CH),126.0(CH),68.0(CH2),44.3(CH2),43.7(CH2),43.6(CH2),42.0(CH2),41.9(CH2),28.6(CH2)；MS:m/z＝472[M+Na]+；HRMS：对于C20H23O4N3Br计算448.0866，测得448.0867(0.1ppm)。(d)4-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙酰基]哌嗪-1-羧酸(6-甲氧基羰基-2-萘基)甲酯(6d)
在二乙醚中进一步研磨使用前述一般方法获得的粗衍生物，以产生期望的乙酰化化合物，为固体。C22H24BrN3O6；产率80％；白色固体；熔点136-137℃；M＝506.35g/mol；IR(ATR)：ν＝3326(w),2916(w),1706(s),1621(s),1423(s),1214(m),1202(m),814(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),8.08(dd,J＝8.6Hz,J＝1.6Hz,1H),7.96(d,J＝8.5Hz,1H),7.88 (d,J＝8.7Hz,1H),7.85(s,1H),7.53(dd,J＝8.5Hz,1H),7.53-7.47(m,1H),5.33(s,2H),4.09(d,J＝4.1Hz,2H),3.98(s,3H),3.90(s,2H),3.69-3.65(m,2H),3.60-3.54(m,4H),3.43-3.36(m,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.2(Cq),166.1(Cq),165.9(Cq),155.1(Cq),136.4(Cq),135.5(Cq),132.3(Cq),130.9(CH),130.0(CH),128.4(CH),128.0(Cq),127.0(CH),126.6(CH),125.9(CH),67.6(CH2),52.4(CH3),44.3(CH2),43.7(CH2),43.7(CH2),42.0(CH2),41.9(CH2),28.6(CH2)；MS：对于79Br，m/z＝528[M+Na]+，对于81Br，m/z＝530[M+Na]+；HRMS：对于C22H25O6N3Br计算506.0921，测得506.0918(0.6ppm)。(e)2-N-[2-[4-(金刚烷-1-羰基)哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]-2-溴-乙酰胺(6e)
在二乙醚中进一步研磨使用前述一般方法获得的粗衍生物，以产生期望的乙酰化化合物，为固体。C19H28BrN3O3；产率86％；白色固体；熔点203-204℃；M＝426.35g/mol；IR(ATR)：ν＝3305(m-s),2932(m-s),1681(s),1645(s),1590(s),1563(m),1420(s),1223(s),1205(m-s),1014(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.50(as,1H),4.09(d,J＝4.1Hz,2H),3.90(s,2H),3.74-3.70(m,4H),3.66-3.63(m,2H),3.43-3.39(m,2H),2.06(as,3H),1.99-1.97(m,6H),1.79-1.67(m,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ176.3(Cq),166.2(Cq),165.8(Cq),45.4(CH2),44.8(CH2),44.7(CH2),42.4(CH2),41.9(CH2),41.9(Cq),39.2(3CH2),36.7(3CH2),28.6(CH2),28.5(3CH)；MS:对于79Br，m/z＝448[M+Na]+，对于81Br，m/z＝450[M+Na]；HRMS：对于C19H29O3N3Br计算426.1387，测得426.1389(0.5ppm)。
(f)4-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙酰基]哌嗪-1-羧酸1-金刚烷基甲基酯(6f)
在二乙醚中进一步研磨使用前述一般方法获得的粗衍生物，以产生期望的乙酰化化合物，为固体。C20H30BrN3O4；产率76％；浅米色固体；熔点 210-211℃；M＝456.37g/mol；IR(ATR)：ν＝3335(w),2898(m-s),2847(w),1678(s),1621(s),1466(m),1430(m),1247(m),1220(s),1205(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.52(s,1H),4.09(d,J＝4.0Hz,2H),3.90(s,2H),3.71(s,2H),3.68-3.64(m,2H),3.56-3.50(m,4H),3.45-3.41(m,2H),1.99(as,3H),1.76-1.61(m,6H),1.53(d,J＝2.9Hz,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.2(Cq),165.8(Cq),155.6(Cq),75.7(CH2),44.4(CH2),43.7(CH2),43.5(CH2),42.0(CH2),42.0(CH2),39.5(3CH2),37.1(3CH2),33.6(Cq),28.6(CH2),28.1(3CH)；MS:m/z＝480[M+Na]+；HRMS：对于C20H31O4N3Br计算456.1492，测得456.1491(0.3ppm)。
(g)4-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙酰基]哌嗪-1-羧酸2-(1-金刚烷基)乙基酯(6g)
在二乙醚中进一步研磨使用前述一般方法获得的粗衍生物，以产生期望的乙酰化化合物，为固体。C21H32BrN3O4；产率39％；浅米色固体；熔点111-112℃；M＝470.40g/mol；IR(ATR)：ν＝3335(w),2895(m-s),2844(m),1700(s),1612(s),1427(s),1284(w),1226(s)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.51(as,1H),4.16(t,J＝7.3Hz,2H),4.09(d,J＝4.0Hz,2H),3.90(s,2H),3.66-3.59(m,2H),3.57-3.45(m,4H),3.41-3.34(m,2H),1.95(as,3H),1.73-1.59(m,6H),1.52(as,6H),1.43(t,J＝7.3Hz,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.1(Cq),165.8(Cq),155.5(Cq),62.6(CH2),44.4(CH2),43.6(CH2),43.5(CH2),42.9(CH2),42.7(3CH2),42.1(CH2),42.0(CH2),37.1(3CH2),31.9(Cq),28.7(3CH),28.6(CH2)；MS:m/z＝494[M+Na]+；HRMS：对于C21H33O4N3Br计算470.1649，测得470.1646(0.6ppm)。
(h)22-溴-N-[2-[4-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]-乙酰胺(6h)
在二乙醚中研磨在水溶液后处理(aqueous work-up)(碳酸氢钠饱和溶液/DCM萃取)后获得的粗衍生物，以得到期望的衍生物。C20H25BrN4O4S；产率79％；黄色固体；熔点173-174℃；M＝497.41g/mol；IR(ATR)：ν＝3381(w),2925(w),1651(s),1451(m),1339(m),1144(s),941(s),792(s),707(s)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.64(d,J＝8.1Hz,1H),8.38(d,J＝8.6Hz,1H),8.21(dd,J＝7.4Hz,J＝1.2Hz,1H),7.60-7.53(m,2H),7.39(as,1H),7.22(d,J＝7.4Hz,1H),3.99(d,J＝4.1Hz,2H),3.85(s,2H),3.70-3.66(m,2H),3.47-3.43(m,2H),3.21(dd,J＝10.1Hz,J＝5.2Hz,4H),2.92(s,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ165.9(Cq),165.9(Cq),132.1(Cq),131.2(CH),131.0(CH),130.3(Cq),129.9(Cq),128.4(CH),123.5(CH),119.7(CH),115.7(CH),45.6(2CH3),45.5(CH2),45.3(CH2),44.2(CH2),41.7(2CH2),28.5(CH2)；
(i)4-[(2R)-2-[(2-溴乙酰基)氨基]丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(6i)
在二乙醚中进一步研磨使用前述一般方法获得的粗衍生物，以产生期望的乙酰化化合物，为固体。C17H22BrN3O4；浅米色固体；熔点104-105℃；产率78％；M＝412.28g/mol；IR(ATR)：ν＝3302(m),2929(w),1700(s),1678(s),1615(s),1475(m),1427(s),1257(m),1226(s),1120(m),741(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.53(d,J＝6.9Hz,1H),7.40-7.30(m,5H),5.15(s,2H),4.83(p,J＝6.9Hz,1H),3.85(ad,J＝1.3Hz,2H),3.70-3.35(m,8H),1.35(d,J＝6.8Hz,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ170.5(Cq),165.0(Cq),155.1(Cq),136.3(Cq),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),67.7(CH2),46.1(CH),45.3(CH2),43.9(CH2),43.6(CH2),42.1(CH2),28.8(CH2),18.9(CH3)；MS：对于79Br，m/z＝434[M+Na]+，对于81Br，m/z＝436[M+Na]+；HRMS：对于 C17H23O4N3Br计算412.0866，测得412.0870(0.9ppm)。
(j)4-[(2S)-2-[(2-溴乙酰基)氨基]丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(6j)
在二乙醚中进一步研磨使用前述一般方法获得的粗衍生物，以产生期望的乙酰化化合物，为固体。C17H22BrN3O4；浅米色固体；熔点104-105℃；产率83％；M＝412.28g/mol；IR(ATR)：ν＝3305(m),2929(w),1697(s),1675(s),1612(s),1484(m),1427(s),1254(m),1226(s),1120(m),741(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝4.7Hz,1H),7.47-7.28(m,5H),5.14(s,2H),4.92-4.74(m,1H),3.85(s,2H),3.79-3.33(m,8H),1.34(m,J＝6.1Hz,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ170.5(Cq),165.0(Cq),155.1(Cq),136.3(Cq),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),67.7(CH2),46.0(CH),45.3(CH2),43.9(CH2),43.6(CH2),42.1(CH2),28.8(CH2),18.9(CH3)；MS：对于79Br，m/z＝434[M+Na]+，对于81Br，m/z＝436[M+Na]+；HRMS：对于C17H23O4N3Br计算412.0866，测得412.0871(1.1ppm)。
(k)4-[(2R)-2-[(2-溴乙酰基)氨基]-3-苯基-丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(6k)
然后在不经任何进一步纯化的情况下使用用前述方案获得的粗衍生物。C23H26BrN3O4；无色粘性油；产率85％；M＝488.37g/mol；IR(ATR)：ν＝3293(w),3026(w),1694(s),1621(s),1420(s),1226(s),1120(w),750(w),732(w),695(m-s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.46(d,J＝8.0Hz,1H),7.41-7.17(m,10H),5.14-5.05(m,3H),3.85(s,2H),3.66-3.39(m,3H),3.34-3.15(m,3H),3.11-2.88(m,3H),2.70-2.60(m,1H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ169.8(Cq),165.5(Cq),155.0(Cq),136.3(Cq),135.6(Cq),129.7(2CH),128.9(2CH),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),127.7(CH),67.7(CH2),50.6(CH),45.5(CH2),43.3(2CH2),42.0(CH2),39.9(CH2),28.7(CH2)；MS：对于79Br，m/z＝510[M +Na]+，对于81Br，m/z＝512[M+Na]+；HRMS：对于C23H27O4N3Br计算488.1179，测得488.1178(0.3ppm)。
(l)4-[(2S)-2-[(2-溴乙酰基)氨基]-3-苯基-丙酰基]哌嗪-1-羧酸苯甲酯(6l)
然后在不经任何进一步纯化的情况下使用用前述一般方案获得的粗衍生物。C23H26BrN3O4；无色粘性油；产率98％；M＝488.37g/mol；IR(ATR):ν＝3274(w),3032(w),1697(s),1624(s),1427(s),1223(s),1117(m),750(m),695(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.41-7.17(m,11H),5.14-5.05(m,3H),3.85(s,2H),3.62-3.40(m,3H),3.34-3.18(m,3H),3.11-2.88(m,3H),2.72-2.62(m,1H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ169.6(Cq),165.3(Cq),155.0(Cq),136.3(Cq),135.6(Cq),129.7(2CH),128.9(2CH),128.7(2CH),128.4(CH),128.2(2CH),127.6(CH),67.6(CH2),50.6(CH),45.5(CH2),43.3(2CH2),42.0(CH2),39.9(CH2),28.7(CH2)；MS：对于79Br，m/z＝510[M+Na]+，对于81Br，m/z＝512[M+Na]+；HRMS：对于C23H27O4N3Br计算488.1179，测得488.1178(0.3ppm)。
(m)4-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙酰基]哌嗪-1-羧酸叔丁酯(6m)
在二乙醚中进一步研磨使用前述一般方案获得的粗衍生物，以产生期望的乙酰化化合物，为固体。C13H22BrN3O4；产率42％；白色固体；熔点148-149℃；M＝364.24g/mol；IR(ATR)：ν＝3323(w),2968(w),1687(m),1615(s),1405(m),1247(m),1223(m),1156(s),1123(m),1023(m),859(w)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.52(as,1H),4.09(d,J＝4.0Hz,2H),3.90(s,2H),3.65-3.61(m,2H),3.49-3.42(m,4H),3.40-3.36(m,2H),1.47(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.1(Cq),165.8(Cq),154.5(Cq),80.7(Cq),44.4(2CH2), 42.1(2CH2),41.9(CH2),28.6(CH2),28.5(3CH3)；MS：对于79Br，m/z＝386[M+Na]+，以及MS：对于81Br，m/z＝388[M+Na]+；HRMS：对于C13H23O4N3Br计算364.0866，测得364.0872(1.5ppm)。
(n)4-[2-[(2-氯乙酰基)氨基]乙酰基]哌嗪-1-羧酸(6-甲氧基羰基-2-萘基)甲基酯(6n)
通过快速色谱法(洗脱液：EtOAc)进一步纯化使用前述的一般方案获得的粗衍生物。C22H24ClN3O6；产率96％；白色固体；熔点56-57℃；M＝461.90g/mol；IR(ATR)：ν＝2950(w),1697(s),1642(s),1430(m-s),1284(m),1223(m-s),753(w)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),8.09(dd,J＝8.6Hz,J＝1.7Hz,1H),7.96(d,J＝8.5Hz,1H),7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.85(s,1H),7.60(as,1H),7.53(dd,J＝8.5Hz,J＝1.6Hz,1H),5.33(s,2H),4.10(d,J＝4.2Hz,2H),4.08(s,2H),3.99(s,3H),3.69-3.65(m,2H),3.60-3.54(m,4H),3.44-3.41(m,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ167.2(Cq),166.3(Cq),166.1(Cq),155.1(Cq),136.4(Cq),135.4(Cq),132.3(Cq),130.9(CH),130.0(CH),128.4(CH),128.0(Cq),127.0(CH),126.6(CH),125.9(CH),67.6(CH2),52.4(CH3),44.3(CH2),43.7(CH2),43.6(CH2),42.5(CH2),42.0(CH2),41.6(CH2)；MS:m/z＝484[M+Na]+；HRMS：对于C22H24O6N3ClNa计算484.1246，测得484.1246(0.0ppm)。
(o)N-[2-[4-(金刚烷-1-羰基)哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]-2-氯-乙酰胺(6o)
通过快速色谱法使用乙酸乙酯作为洗脱液纯化按照一般方法获得的粗物质。C19H28ClN3O3；产率36％；白色固体；熔点201-202℃；M＝381.90g/mol；IR(ATR)：ν＝3305(m),2904(m),1687(s),1648(s),1599(s),1560(m),1451(m),1414(m-s),1223(s),1011(s)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.60(as, 1H),4.11(d,J＝4.2Hz,2H),4.08(s,2H),3.74-3.70(m,4H),3.67-3.63(m,2H),3.43-3.39(m,2H),2.06(as,3H),1.99(d,J＝2.6Hz,6H),1.79-1.68(m,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ176.3(Cq),166.3(Cq),166.2(Cq),45.4(CH2),44.8(CH2),44.7(CH2),42.5(CH2),42.4(CH2),41.9(Cq),41.6(CH2),39.2(3CH2),36.7(3CH2),28.5(3CH)；MS:m/z＝404[M+Na]+；HRMS：对于C19H29O3N3Cl计算382.1892，测得382.1896(1.1ppm)。
(p)2-氯-N-[2-[4-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]-乙酰胺(6p)
通过快速色谱法(洗脱液：AcOEt)进一步纯化按照上述的一般方案获得的粗物质，以得到标题衍生物。C20H25ClN4O4S；产率80％；黄绿色固体；熔点68-69℃；M＝452.95g/mol；IR(ATR)：ν＝3314(w),2938(w),1648(s),1454(m),1436(m),1141(s),938(m-s),786(s)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.59(d,J＝8.5Hz,1H),8.35(d,J＝8.7Hz,J＝1H),8.20(dd,J＝7.4Hz,J＝1.3Hz,1H),7.56(d,J＝7.4Hz,1H),7.53(d,J＝7.5Hz,1H),7.49(as,1H),7.19(d,J＝7.5Hz,1H),4.02(s,2H),4.00(d,J＝4.2Hz,2H),3.70-3.66(m,2H),3.47-3.43(m,2H),3.24-3.18(m,4H),2.89(s,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.2(Cq),165.9(Cq),152.1(Cq),132.1(Cq),131.4(CH),131.0(CH),130.4(Cq),130.2(Cq),128.5(CH),123.3(CH),119.3(CH),115.6(CH),45.5(2CH3),45.5(CH2),45.4(CH2),44.3(CH2),42.4(CH2),41.8(CH2),41.4(CH2)；MS:m/z＝475[M+Na]+；HRMS：对于C20H26O4N4SCl计算453.1358，测得453.1358(0.0ppm)。
(q)4-(2-溴乙酰基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(6q)
在惰性气氛以及-78℃下，将溴乙酰溴(53.7mmol，1eq.)缓慢地加入到 Boc-哌嗪(53.7mmol，1eq.)和TEA(59.1mmol，1.1eq.)在DCM(150ml)中的溶液。在-78℃搅拌反应混合物3个小时，用DCM(75ml)稀释，并用水洗涤。用硫酸镁干燥回收的有机层，并在真空下蒸发溶剂。用二乙醚进一步研磨获得的粗产物，过滤，并在真空下干燥，以获得期望的乙酰化化合物。C11H19BrN2O3；产率78％；白色固体；熔点243-244℃；M＝307.18g/mol；IR(KBr)：ν＝2965(m),1689(s),1632(s),1417(s),1246(s),1167(s),1023(m)；cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ3.87(s,2H),3.61-3.57(m,2H),3.55-3.47(m,4H),3.46-3.41(m,2H),1.46(s,9H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ165.5(Cq),154.5(Cq),80.5(Cq),46.6(2CH2),40.9(2CH2),28.4(3CH3),25.7(CH2)；
(r)4-(2-乙酰氨基乙酰基)哌嗪-1-羧酸苯甲酯(6r)
在惰性气氛以及-78℃下，将乙酰溴(1.1eq.)缓慢地加入到相应的胺(0.36mmol，1eq.)和TEA(1.5eq.)在DCM(5ml)中的溶液。在-78℃搅拌反应混合物2个小时，用DCM(50ml)稀释，然后用氯化氢(水溶液0.1M，3×50ml)洗涤。用硫酸镁干燥回收的有机层，并在真空下蒸发溶剂，以产生粗产物，经该粗产物在二乙醚中进一步研磨，以获得期望的乙酰化衍生物。C16H21N3O4；产率90％；白色固体；熔点134-135℃；M＝319.36g/mol；IR(ATR)：ν＝3356(m),2919(s),1681(m),1657(s),1636(s),1563(m),1420(m),1229(s),1120(m),1068(m),1023(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.39-7.33(m,5H),6.56(as,1H),5.15(s,2H),4.06(d,J＝3.8Hz,2H),3.64-3.59(m,2H),3.56-3.50(m,4H),3.45-3.40(m,2H),2.05(s,3H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ170.3(Cq),166.9(Cq),155.2(Cq),136.4(Cq),128.8(2CH),128.5(CH),128.3(2CH),67.8(CH2),44.3(CH2),43.7(CH2),43.6(CH2),41.9(CH2),41.5(CH2),23.2(CH3)；MS:m/z＝342[M+Na]+；HRMS：对于C16H22O4N3计算320.1605，测得320.1608(1.0ppm)。
制备二甲基锍盐(G)
将二甲硫醚(2.5mmol，10eq.)加入到先前获得的溴代-乙酰化化合物(0.25mmol，1eq.)在甲醇(5ml)中的溶液。密封反应容器，并在室温剧烈搅拌所述混合物48个小时。蒸发溶剂，将残余物溶于水(15ml)，并用乙酸乙酯(3×20ml)洗涤。冷冻干燥回收的水层，以产生作为固体的最终的二甲基锍溴化物盐。(a)[2-[[2-(4-苄氧基羰基哌嗪-1-基)-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]-二甲基-锍溴化物(7a)
C18H26BrN3O4S；产率83％；白色固体/吸湿的；M＝460.39g/mol；IR(ATR)：ν＝2919(w),1681(s),1642(s),1427(m),1223(s),1123(w),1020(w),762(w),695(w)cm-1；1H NMR(250MHz,DMSO3)δ7.38-7.32(m,5H),5.10(s,2H),4.47(s,2H),4.08(d,J＝5.4Hz,2H),3.53-3.40(m,8H),2.94(s,6H)；13C NMR(63MHz,DMSO3)δ166.2(Cq),163.2(Cq),154.4(Cq),136.7(Cq),128.4(2CH),127.9(CH),127.6(2CH),66.4(CH2),46.4(CH2),43.7(CH2),43.4(CH2),43.1(CH2),41.1(CH2),41.0(CH2),24.5(2CH3)；MS：m/z＝380[M-Br]+；HRMS：对于C18H26O4N3S计算380.1639，测得380.1638(0.1ppm)。
(b)[2-[[2-[4-[(4-甲氧基羰基苯基)甲氧基羰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]-氨基]-2-氧代-乙基]-二甲基-锍溴化物(7b)
C20H28BrN3O6S；产率94％；浅米色固体/吸湿的；M＝518.42g/mol；IR(ATR)：ν＝3211(w),2913(w),1694(s),1645(s),1423(m-s),1407(m),1278(m-s),1220(m-s),1102(m),1017(m),753(m)cm-1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ8.90(t,J＝5.4Hz,1H),7.96(d,J＝8.4Hz,2H),7.51(d,J＝8.4Hz,2H),5.19(s,2H),4.48(s,2H),4.09(d,J＝5.4Hz,2H),3.85(s,3H),3.86-3.38(m,8H),2.94(s,6H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ166.3(Cq),166.0(Cq),163.2(Cq), 154.2(Cq),142.3(Cq),129.3(2CH),129.0(Cq),127.4(2CH),65.7(CH2),52.2.(CH3),46.4(CH2),43.7(CH2),43.4(CH2),43.2(CH2),41.1(CH2),41.0(CH2),24.5(2CH3)；MS:m/z＝438[M]+；HRMS：对于C20H28O6N3S计算438.1693，测得438.1693(0.1ppm)。
(c)二甲基-[2-[[2-[4-(2-萘基甲氧基羰基)哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]锍溴化物(7c)
C22H28BrN3O4S；产率47％；浅米色固体/吸湿的；M＝510.44g/mol；IR(ATR)：ν＝2910(w),1678(s),1639(s),1463(m),1427(s),1223(s),817(w),747(m)cm–1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ8.88(t,J＝4.9Hz,1H),7.86-7.80(m,4H),7.51-7.43(m,3H),5.29(s,2H),5.05(s,2H),4.12(d,J＝5.3Hz,2H),3.61-3.41(m,8H),3.32(s,6H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ166.3(Cq),163.3(Cq),154.5(Cq),134.3(Cq),132.7(Cq),132.6(Cq),128.1(CH),127.8(CH),127.6(CH),126.5(CH),126.4(CH),126.3(CH),125.8(CH),66.6(CH2),46.5(CH2),43.8(CH2),43.4(CH2),43.2(CH2),41.2(CH2),41.1(CH2),24.6(2CH3)；MS:m/z＝430[M-Br]+；HRMS：对于C22H28O4N3S计算430.1795，测得430.1793(0.5ppm)。
(d)[2-[[2-[4-[(6-甲氧基羰基-2-萘基)甲氧基羰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]-二甲基-锍溴化物(7d)
C24H30BrN3O6S；产率81％；白色固体；熔点125-126℃；M＝568.48g/mol；IR(ATR)：ν＝3320(w),2980(w),1712(m),1675(m),1639(s),1433(m),1287(m),1232(s),1199(m),1126(m),759(w)cm-1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ8.88(t,J＝5.4Hz,1H),8.65(s,1H),8.16(d,J＝8.6Hz,1H),8.08-7.99(m,3H),7.62(dd,J＝8.5Hz,J＝1.6Hz,1H),5.30(s,2H),4.43(s,2H),4.10(d,J＝5.4 Hz,2H),3.92(s,3H),3.56-3.40(m,8H),2.91(s,6H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ166.3(Cq),166.3(Cq),163.2(Cq),154.3(Cq),137.3(Cq),134.9(Cq),131.6(Cq),130.4(CH),129.7(CH),128.5(CH),127.1(Cq),126.5(CH),125.9(CH),125.2(CH),66.3(CH2),52.3(CH3),46.5(CH2),43.7(CH2),43.4(CH2),43.3(CH2),41.1(CH2),41.1(CH2),24.6(2CH3)。MS:m/z＝488[M]+；HRMS：对于C24H30O6N3S计算488.1850，测得488.1841(1.8ppm)。
(e)[2-[[2-[4-(金刚烷-1-羰基)哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]-二甲基-锍溴化物(7e)
C21H34BrN3O3S；产率98％；白色固体；熔点157-158℃；M＝488.48g/mol；IR(ATR)：ν＝3417(w),2901(m-s),2844(w),1645(s),1612(s),1445(w),1408(m),1241(m),1214(m),1008(s)cm-1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ8.87(t,J＝5.3Hz,1H),4.42(s,2H),4.08(d,J＝5.3Hz,2H),3.65-3.54(m,4H),3.48-3.38(m,4H),2.90(s,6H),1.98(as,3H),1.92-1.86(m,6H),1.74-1.62(m,6H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ174.6(Cq),166.2(Cq),163.2(Cq),46.5(CH2),44.5(2CH2),44.2(CH2),41.7(CH2),41.0(CH2),40.9(Cq),38.4(3CH2),36.0(3CH2),27.9(3CH),24.6(2CH3)；MS:m/z＝408[M-Br]+；HRMS：对于C21H34O3N3S计算408.2315，测得408.2317(0.4ppm)。
(f)[2-[[2-[4-(1-金刚烷基甲氧基羰基)哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]-二甲基-锍溴化物(7f)
C22H36BrN3O4S；产率67％；浅米色固体/吸湿的；M＝518.51g/mol；IR(ATR)：ν＝3414(w),2895(s),2844(m),1669(s),1642(s),1466(m),1423(m-s),1220(s)cm–1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ8.89(t,J＝5.3Hz,1H),4.46(s,2H),4.08(d,J＝5.4Hz,2H),3.62(s,2H),3.54-3.40(m,8H),2.93(s,6H),1.94 (as,3H),1.71-1.58(m,6H),1.50(as,6H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ166.3(Cq),163.2(Cq),154.8(Cq),74.3(CH2),46.4(CH2),43.7(CH2),43.3(CH2),43.0(CH2),41.1(CH2),41.0(CH2),38.7(3CH2),36.4(3CH2),33.1(Cq),27.4(3CH),24.6(2CH3)；MS:m/z＝438[M-Br]+；HRMS：对于C22H36O4N3S计算438.2421，测得438.2419(0.5ppm)。
(g)[2-[[2-[4-[2-(1-金刚烷基)乙氧基羰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]-二甲基-锍溴化物(7g)
C23H38BrN3O4S；产率75％；浅米色固体/吸湿的；M＝532.53g/mol；IR(ATR)：ν＝2895(m-s),2847(w),1684(s),1423(s),1226(s),1020(w)cm–1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ8.89(t,J＝5.3Hz,1H),4.47(s,2H),4.09-4.03(m,4H),3.50-3.38(m,8H),2.93(s,6H),1.91(as,3H),1.69-1.57(m,6H),1.49(as,6H),1.37(t,J＝7.3,2H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ166.2(Cq),163.2(Cq),154.6(Cq),61.2(CH2),46.4(CH2),43.7(CH2),43.3(CH2),43.0(CH2),42.4(CH2),41.9(3CH2),41.1(CH2),41.0(CH2),36.5(3CH2),31.3(Cq),27.9(3CH),24.6(2CH3)；MS:m/z＝452[M-Br]+；HRMS：对于C23H38O4N3S计算452.2578，测得452.2575(0.6ppm)。
(h)[2-[[2-[4-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]-二甲基-锍溴化物(7h)
C22H31BrN4O4S2；产率76％；浅黄色固体；熔点98-99℃；M＝559.54g/mol；IR(ATR)：ν＝3475(m),2992(w),1672(s),1648(s),1345(s),1153(s),1144(s),935(s),795(s),713(s)cm–1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ8.79(t,J＝5.4Hz,1H),8.54(d,J＝8.5Hz,1H),8.30(d,J＝8.7Hz,1H),8.14(dd,J＝7.4Hz,J＝1.1Hz,1H),7.68(dd,J＝8.5Hz,J＝7.4Hz,1H),7.63(dd,J＝8.5Hz,J＝7.7 Hz,1H),7.28(d,J＝7.3Hz,1H),4.38(s,2H),4.01(d,J＝5.3Hz,2H),3.55-3.43(m,4H),3.18-3.05(m,4H),2.87(s,6H),2.83(s,6H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ166.2(Cq),163.2(Cq),151.5(Cq),132.4(Cq),130.5(CH),130.2(CH),129.6(Cq),129.2(Cq),128.3(CH),123.8(CH),118.9(CH),115.4(CH),46.5(CH2),45.3(CH2),45.2(CH2),45.1(2CH3),43.7(CH2),41.0(CH2),40.9(CH2),24.5(2CH3)；MS:m/z＝479[M]+；HRMS：对于C22H31O4N4S2计算479.1781，测得479.1779(0.5ppm)。
(i)[2-[[(1S)-2-(4-苄氧基羰基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]-二甲基-锍溴化物(7j)
C19H28BrN3O4S；浅米色固体/吸湿的；产率78％；M＝474.41g/mol；IR(ATR)：ν＝2986(w),1694(s),1636(s),1420(s),1220(s),1020(m),759(m),698(m)cm-1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ9.07(d,J＝7.3Hz,1H),7.39-7.32(m,5H),5.10(s,2H),4.78(p,J＝6.6Hz,1H),4.40(s,2H),3.51-3.46(m,8H),2.90(s,3H),2.89(s,3H),1.21(d,J＝6.9Hz,3H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ169.8(Cq),162.4(Cq),154.4(Cq),136.7(Cq),128.4(2CH),127.9(CH),127.7(2CH),66.4(CH2),46.6(CH2),45.3(CH),44.5(CH2),43.6(CH2),43.2(CH2),41.3(CH2),24.7(CH3),24.6(CH3),17.6(CH3)；MS:m/z＝394[M-Br]+；HRMS：对于C19H28O4N3S计算394.1795，测得394.1800(1.3ppm)。
(j)[2-[[2-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]-二甲基-锍溴化物(7m)
C15H28BrN3O4S；浅黄色固体/吸湿的；产率48％；M＝426.37g/mol；IR(ATR)：ν＝3429(w),2974(w),1672(s),1645(s),1408(s),1460(w),1363(m),1232(m),1163(m-s),1107(w)cm-1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ8.87(t,J＝ 5.4Hz,1H),4.43(s,2H),4.08(d,J＝5.4Hz,2H),3.45-3.32(m,8H),2.91(s,6H),1.41(s,9H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ166.2(Cq),163.2(Cq),153.8(Cq),79.2(Cq),46.5(2CH2),43.8(CH2),41.2(CH2),41.0(2CH2),28.0(3CH3),24.6(2CH3)；MS:m/z＝346[M]+；HRMS：对于C15H28O4N3S计算346.1795，测得346.1797(0.6ppm)。
(k)4-[2-[[2-(1,3,4,5-四甲基咪唑-1-鎓-2-基)硫烷基乙酰基]氨基]-乙酰基]-哌嗪-1-羧酸苄基酯溴化物(7s)
C23H32BrN5O4S；浅米色固体/吸湿的；产率79％；M＝554.50g/mol；IR(ATR)：ν＝3402(w),3192(w),2922(w),1696(s),1645(s),1423(s),1226(s),1026(w)cm-1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ8.35(t,J＝5.3Hz,1H),7.38-7.32(m,5H),5.10(s,2H),3.96(d,J＝5.4Hz,2H),3.77(s,6H),3.68(s,2H),3.50-3.39(m,8H),2.29(s,6H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ167.0(Cq),166.6(Cq),154.4(Cq),136.7(Cq),135.9(Cq),129.2(Cq),128.4(2CH),127.9(CH),127.6(2CH),66.4(CH2),43.7(CH2),43.3(CH2),43.1(CH2),41.0(CH2),40.7(CH2),36.8(CH2),33.5(2CH3),8.8(2CH3)；MS:m/z＝474[M]+；HRMS：对于C23H32O4N5S计算474.2170，测得474.2161(1.8ppm)。
制备乙烯基磺酰胺的一般方法(H)
在惰性气氛下，于-60℃将三乙胺(1.1eq.)加入到2-氯乙基-磺酰氯(0.3mmol，1eq.)在DCM(6mL)中的溶液。在加入相应的胺(1.1eq.)和三乙胺(1.1eq.)之前，于-60℃搅拌混合物2小时，然后在0℃另外搅拌反应2小时。通过加入HCl(水溶液，0.1N，20mL)来淬灭反应，并用DCM(3×20mL)萃取。用硫酸镁干燥回收的有机层，并在减压下蒸发溶剂。通过快速色谱法(洗脱液：乙酸乙酯)进一步纯化粗物质，以得到期望的乙烯基磺酰胺。
(a)4-[2-(乙烯基磺酰基氨基)乙酰基]哌嗪-1-羧酸苄基酯(8a)
C16H21N3O5S；产率53％；无色粘性油，静置时变成发白的固体；熔点66-67℃；M＝367.42g/mol；IR(ATR)：ν＝3220(w),2865(w),1694(s),1648(s),1423(m),1326(w),1223(s),1141(m),1123(m),762(m),729(m),695(m)cm-1；1H NMR(250MHz,CDCl3)δ7.41-7.30(m,5H),6.51(dd,J＝16.5Hz,J＝9.8Hz,1H),6.25(d,J＝16.5Hz,1H),5.95(d,J＝9.8Hz,1H),5.44(t,J＝4.2Hz,1H),5.15(s,2H),3.84(d,J＝4.4Hz,2H),3.68-3.62(m,2H),3.57-3.50(m,4H),3.41-3.28(m,2H)；13C NMR(63MHz,CDCl3)δ165.9(Cq),155.1(Cq),136.3(Cq),135.5(CH),128.8(2CH),128.5(CH),128.3(2CH),127.2(CH2),67.8(CH2),44.3(CH2),43.9(CH2),43.7(CH2),43.6(CH2),42.2(CH2)；MS：m/z＝390[M+Na]+；HRMS：对于C16H22O5N3S计算368.1275，测得368.1280(1.4ppm)。
(b)N-[2-[4-(金刚烷-1-羰基)哌嗪-1-基]-2-氧代-乙基]乙烯磺酰胺(8e)
C19H29N3O4S；产率49％；白色固体；熔点159-160℃；M＝395.52g/mol；IR(ATR)：ν＝3232(w),2895(m),2850(w),1645(m-s),1612(m-s),1402(m-s),1320(m),1232(m-s),1153(s),1011(m-s),984(m),738(m)cm-1；1H NMR(250MHz,DMSO)δ7.35(t,J＝5.5Hz,1H),6.71(dd,J＝16.6Hz,J＝10.0Hz,1H),6.03(d,J＝16.6Hz,1H),5.94(d,J＝10.0Hz,1H),3.82(d,J＝5.6Hz,2H),3.57-3.46(m,4H),3.42-3.38(m,4H),1.97(as,3H),1.89(s,6H),1.73-1.62(m,6H)；13C NMR(63MHz,DMSO)δ174.6(Cq),166.4(Cq),137.0(CH),125.1(CH2),44.5(2CH2),44.3(CH2),43.7(CH2),41.7(CH2),40.9(Cq),38.4(3CH2),36.0(3CH2),27.9(3CH)；HRMS：对于C19H30O4N3S计算396.1952，测得396.1954(0.6ppm)。
实施例2–抑制组织型谷氨酰胺转移酶(TG2)的活性
方法
通过生物素X-尸胺整合到N,N’-二甲基酪蛋白中来测量TG转酰胺基活性及抑制剂对活性的影响。在4℃用100μl在50mM Tris-Cl，pH8中的10mg/ml N,N’-二甲基酪蛋白涂布96孔板后，用TBS-0.05％吐温-20(v/v)，pH 7.6和TBS，pH 7.6洗涤板，并将100μl在包含1mM DTT、10mM CaCl2和0.1μM生物素-尸胺的50mM Tris-HCl，pH7.4中的纯化的重组人TG2(400ng/ml Zedira，德国)(组织型谷氨酰胺转移酶)加入到包含适当浓度的抑制剂的涂布孔中。使反应在37℃进行2个小时。然后，在37℃用100μl的封闭缓冲液(3％(w/v)BSA在TBS-吐温，pH 7.6中)封闭30分钟前，将板用TBS-吐温-20(v/v)，pH 7.6洗涤两次，并用TBS，pH 7.6洗涤一次。在封闭后，在封闭缓冲液(1:1000稀释)中用100μl HRP-结合的Extr-Avidin过氧化物酶(Sigma-Aldrich，英国)在37℃孵育孔1个小时。在另一组洗涤后，使用Sigma Fast OPD(溶解于20ml的蒸馏H2O中的片剂)测量TG2活性。通过加入2.5M的H2SO4来显色，并使用酶标仪ELx808TM测量在490nm下的吸光度。所有的抑制剂在加入到测定前，溶于DMSO中，成为100mM的溶液。
为了测定谷氨酰胺转移酶1、谷氨酰胺转移酶3和因子X111a的活性，使用商业微量测定法TG-CovTest(Covalab，Lyon，法国；还参见Perez et al.Anal Biochem.2009；389:150-156)。
结果
表1、表2、表3和表4中显示了组织型谷氨酰胺转移酶的IC50测定的结果。
表1
表2
表3
表4
如表5中显示，进一步测试示例性化合物对其它谷氨酰胺转移酶(TG1、TG3和因子X111a)的活性的作用，揭示了对组织型谷氨酰胺转移酶(TG2)的选择性抑制。
表5
实施例3–细胞透性(Cell Permeability)
该研究显示了不同的抑制剂(取决于R3基团的不同)显示不同的细胞透性。
方法
在完全的内皮生长培养基EGM中生长具有高TG2表达的HUVEC细胞(A novel extracellular role for tissue transglutaminase in matrix-bound VEGF-mediated angiogenesis.Z.Wang,et al,M.Griffin(2013)Cell Death and Disease.Z.Wang Z,et al,M.Griffin.Cell Death Dis.4:e808)。测定法基于TG2的细胞内活化，使用离子霉素以提高细胞内Ca2+水平，并量化在存在和不存在抑制剂时生物素尸胺的细胞内整合。为诱导细胞内TG2活性，在存在或不存在50uM的TG2抑制剂的情况下，用具有包含给定的1μM离子霉素和1mM生物素-尸胺的0.5％FBS的新鲜的生长培养基孵育细胞。在该方案中使用抑制剂EB 1-155、1-159、1-178、1-180、2-16和2-18(化合物结构参见上面的实施例2)。非可透过细胞的抑制剂R281和可透过细胞的抑制剂R283分别用作阴性对照和阳性对照。细胞内活性相对于R281被标准化。在孵育3个小时后，收集培养基中的细胞，成团粒状，用PBS洗涤一次，并再悬浮在匀浆缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA)中，在冰上超声处理。在18,000×g下使细胞膜形成小球15分钟，并使用上清液(胞液部分)进行测定。将在100μl匀浆缓冲液中的50μg总蛋白装填到高蛋白结合的96孔板中，并在4℃孵育过夜。在孵育后，使用200μl封闭缓冲液(5％BSA，0.01％吐温20的硼酸盐溶液、100mM硼酸、20mM硼酸钠和0.7mMNaCl)在37℃封闭板1个小时。然后用漂洗缓冲液(1％BSA，0.01％吐温20的硼酸盐溶液)洗涤每个孔3次。100μlextravidin-HRP溶液(在3％BSA的100mM Tris-HCl，pH 7.4中1:2500稀释的extravidin-HRP和5mM EDTA)加入到每个孔，并在4℃孵育所述板过夜。然后，用50mM Tris-HCl，pH 7.4洗涤所述板四次。使用OPD底物检测信号，并使用3N HCl终止反应，并使用ELISA酶标仪在490nm进行读出。计算Log P值，如图中所示。
结果
结果在图1中显示。
讨论
示例性TGase抑制剂化合物EB 1-155、1-180和2-16全部具有基于丙烯酰胺的弹头，使它们能够进入细胞，并对细胞内TG2活性具有较大的抑制。
示例性TGase抑制剂化合物EB 1-159、1-178和2-18全部具有基于磺酰胺的弹头，阻止它们进入细胞以及影响细胞内TG2活性水平。
因此，通过选择适当的R3基团，本发明的TGase抑制剂化合物可靶向于细胞内或细胞外TG2酶。认为细胞外活性是在纤维化/血管生成疾病状态中更重要的靶标，而且防止抑制剂进入细胞限制了基于细胞内的脱靶/毒性作 用。
实施例4—抑制剂对不同谷氨酰胺转移酶的选择性
该研究证明了不同的抑制剂对不同的谷氨酰胺转移酶呈现不同的选择性。
方法
通过将生物素X-尸胺整合到N,N’-二甲基酪蛋白中来测量TG转酰胺基活性以及抑制剂对活性的作用。在4℃用100μl在50mM Tris-Cl，pH8中的10mg/ml N,N’-二甲基酪蛋白涂布96孔板后，用TBS-0.05％吐温-20(v/v)，pH7.6和TBS，pH 7.6洗涤板，并将在包含1mM DTT、10mM CaCl2和0.1μM生物素-尸胺的50mM Tris-HCl，pH7.4中的100μl纯化的重组人TG2(2μg/ml Zedira，德国)或100μl纯化的重组人FXIIIa(2μg/ml Zedira，德国，通过室温用0.01U牛凝血酶/μg FXIII孵育30分钟预活化)加入到包含适当浓度的抑制剂的涂布孔中。使反应在37℃进行1个小时。然后，在用100μl封闭缓冲液(3％(w/v)BSA在TBS-吐温，pH 7.6中)于37℃封闭30min前，用TBS-吐温-20(v/v)，pH 7.6洗涤板两次，再用TBS，pH 7.6洗涤一次。在封闭后，在37℃在封闭缓冲液(1:1,000稀释)中用100μl HRP-结合的ExtrAvidin过氧化物酶孵育孔1个小时。在另一组洗涤后，使用Sigma Fast OPD(溶解于20ml蒸馏H2O中的片剂)测量TG2活性。通过加入2.5M H2SO4显色，并使用酶标仪ELx808TM测量在490nm的吸光度。在加入至测定前，将所有的抑制剂溶解在DMSO中成100mM的溶液。
结果
结果在表6中显示。
表6
化合物参考编号TG2IC50(μm)因子XIII IC50(μm)
EB 1-126>50015.5±6.3
EB 1-127>50023.3±5.5
EB 1-131>50013.5±4.9
注意：误差显示为SD。
讨论
结果证明本发明的化合物对不同的谷氨酰胺转移酶(特别是TG2和因子XIII)呈现不同的选择性。而化合物EB 1-127和1-131(其包含D–苯丙氨酸部分)和EB 1-126(其包含L–苯丙氨酸部分)对组织型谷氨酰胺转移酶(TG2)具有可忽略的抑制作用，它们全部对因子XIII具有非常强的活性。认为对一些化合物观察到的活性差异可能是由于抑制剂核心结构内的氨基酸的变化引起的。这些数据表明本发明的化合物可被“调整”成抑制特定的TG，以便改善特异性和最终的治疗价值。
实施例5—示例性药物制剂
下面的实施例举例说明了本发明的药物剂型，其中活性成分为本发明的化合物。
实施例A：片剂
由上述成分，通过湿法制粒，然后压制，来制备片剂。
实施例B：眼用溶液
实施例C：片剂制剂
通过用聚维酮溶液湿法制粒所述成分，然后加入硬脂酸镁并压制，制备下面的制剂A和B。
制剂A
制剂B
制剂C
通过直接压制混合的成分来制备下面的制剂D和E。制剂E中使用的乳糖是直接压制类型。
制剂D
制剂E
制剂F(控释制剂)
通过用聚维酮溶液湿法制粒(下面的)成分，然后加入硬脂酸镁并压制，来制备所述制剂。
在约6-8个小时的时间内发生药物释放，并在12个小时后完成。
实施例D：胶囊制剂
制剂A
通过混合上面实施例C中的制剂D的成分，并填充到两部分硬明胶胶囊中，制备胶囊制剂。以相似的方式制备制剂B(下文)。
制剂B
制剂C
通过熔融聚乙二醇4000BP，在熔融物中分散活性成分，并将熔融物填充到两部分硬明胶胶囊中，制备胶囊。
制剂D
通过在卵磷脂和花生油中分散活性成分，并将分散液填充到软的有弹性的明胶胶囊中，制备胶囊。
制剂E(控释胶囊)
通过使用挤出机压制成分a、b和c，然后使挤出物滚圆(spheronisation)并干燥，制备下面的控释胶囊制剂。然后，用控释膜(d)涂布所述干燥的小球，并装填到两件式硬明胶胶囊中。
实施例E：可注射制剂
活性成分 0.200g
无菌、无热原的磷酸盐缓冲液(pH7.0)至10ml
将活性成分溶于大部分的磷酸盐缓冲液中(35-40℃)，然后补足体积，并通过无菌微孔过滤器过滤到无菌的10ml琥珀玻璃瓶(1型)，并用无菌瓶塞和顶封密封。
实施例F：肌肉内注射
将活性成分溶于glycofurol。然后，加入苯甲醇并溶解，然后加入水至3ml。然后将混合物通过无菌微孔过滤器过滤，并密封在无菌的3ml玻璃瓶(1型)中。
实施例G：糖浆悬浮液
将苯甲酸钠溶于一部分纯净水中，并加入山梨糖醇溶液。加入活性成分并分散。在甘油中分散增稠剂(可分散纤维素)。混合两种分散液，并用纯净水补足至需要的体积。根据需要通过另外地剪切悬浮液而获得进一步的增稠。
实施例H：栓剂
将五分之一的Witepsol H15以45□C最大值在蒸汽夹套式盘中熔融。将活性成分通过200μm的筛子过筛，并伴随混合加入到熔融的底部，使用装有切割头的silverson，直到获得光滑的分散液。保持混合物在45℃，将剩余的Witepsol H15加入到悬浮液中，并搅拌以确保均匀地混合。使整个悬浮液通过250μm不锈钢丝网，并在连续搅拌下使其冷却至40℃。在38℃至40℃的温度下，将2.02g混合物填充到合适的塑料模具中。使栓剂冷却至室温。
实施例I：阴道栓剂
直接混合上述成分，并通过直接压制得到的混合物来制备阴道栓剂。
参考文献
Bailey,C.D.,and G.V.Johnson.2005.Tissue transglutaminase contributes to disease progression in the R6/2 Huntington's disease mouse model via aggregate-independent mechanisms.J Neurochem.92:83-92.
Collighan,R.J.,and M.Griffin.2009.Transglutaminase 2 cross-linking of matrix proteins:biological significance and medical applications.Amino Acids.36:659-670.
Dafik,L.,and C.Khosla.2011.Dihydroisoxazole analogs for labeling and visualization of catalytically active transglutaminase 2.Chem Biol.18:58-66.
Griffin,M.,R.Casadio,and C.M.Bergamini.2002.Transglutaminases:nature's biological glues.Biochem J.368:377-396.
Griffin,M.,A.Mongeot,R.Collighan,R.E.Saint,R.A.Jones,I.G.Coutts,and D.L.Rathbone.2008.Synthesis of potent water-soluble tissue transglutaminase inhibitors.Bioorg Med Chem Lett.18:5559-5562.
Halim,D.,K.Caron,and J.W.Keillor.2007.Synthesis and evaluation of peptidic maleimides as transglutaminase inhibitors.Bioorg Med Chem Lett.17:305-308.
Han,B.-G.,J.-W.Cho,Y.D.Cho,K.-C.Jeong,S.-Y.Kim,and B.I.Lee.2010.Crystal structure of human transglutaminase 2in complex with adenosine triphosphate.International Journal of Biological Macromolecules.47:190-195.
Hasegawa,G.,M.Suwa,Y.Ichikawa,T.Ohtsuka,S.Kumagai,M.Kikuchi,Y.Sato,and Y.Saito.2003.A novel function of tissue-type transglutaminase:protein disulphide isomerase.Biochem.J.373:793-803.
Huang,L.,J.L.Haylor,Z.Hau,R.A.Jones,M.E.Vickers,B.Wagner,M.Griffin,R.E.Saint,I.G.Coutts,A.M.El Nahas,and T.S.Johnson.2009.Transglutaminase inhibition ameliorates experimental diabetic nephropathy.Kidney Int.76:383-394.
Johnson,T.,M.Fisher,J.Haylor,Z.Hau,N.Skill,R.Jones,R.Saint,I.Coutts,A. El Nahas,and M.Griffin.2008.Transglutaminase inhibition ameliorates tissue scarring and fibrosis:experience in a kidney model.J Am Soc.14:2052.
Klock,C.,X.Jin,K.Choi,C.Khosla,P.B.Madrid,A.Spencer,B.C.Raimundo,P.Boardman,G.Lanza,and J.H.Griffin.2011.Acylideneoxoindoles:A new class of reversible inhibitors of human transglutaminase 2.Bioorg Med Chem Lett.21:2692-2696.
Lindemann,I.,A.Heine,and G.Klebe.2012.Transglutaminase 2 in complex with a novel inhibitor.PDB codes:3S3P,3S3S,3S3J.
Liu,S.,R.A.Cerione,and J.Clardy.2002.Structural basis for the guanine nucleotide-binding activity of tissue transglutaminase and its regulation of transamidation activity.Proc Natl Acad Sci U S A.99:2743-2747.
Mastroberardino,P.G.,C.Iannicola,R.Nardacci,F.Bernassola,V.De Laurenzi,G.Melino,S.Moreno,F.Pavone,S.Oliverio,L.Fesus,and M.Piacentini.2002.'Tissue'transglutaminase ablation reduces neuronal death and prolongs survival in a mouse model of Huntington's disease.Cell Death Differ.9:873-880.
Mishra,S.,and L.J.Murphy.2004.Tissue transglutaminase has intrinsic kinase activity:identification of transglutaminase 2 as an insulin-like growth factor-binding protein-3 kinase.J Biol Chem.279:23863-23868.
Nakaoka,H.,D.M.Perez,K.J.Baek,T.Das,A.Husain,K.Misono,M.J.Im,and R.M.Graham.1994.Gh:a GTP-binding protein with transglutaminase activity and receptor signaling function.Science.264:1593-1596.
Pardin,C.,S.M.Gillet,and J.W.Keillor.2006.Synthesis and evaluation of peptidic irreversible inhibitors of tissue transglutaminase.Bioorg Med Chem.14:8379-8385.
Pardin,C.,J.N.Pelletier,W.D.Lubell,and J.W.Keillor.2008a.Cinnamoyl inhibitors of tissue transglutaminase.J Org Chem.73:5766-5775.
Pardin,C.,I.Roy,W.D.Lubell,and J.W.Keillor.2008b.Reversible and competitive cinnamoyl triazole inhibitors of tissue transglutaminase.Chem Biol Drug Des.72:189-196.
Pinkas,D.M.,P.Strop,A.T.Brunger,and C.Khosla.2007.Transglutaminase 2undergoes a large conformational change upon activation.PLoS Biol.5:e327.
Prime,M.E.,O.A.Andersen,J.J.Barker,M.A.Brooks,R.K.Cheng,I.Toogood-Johnson,S.M.Courtney,F.A.Brookfield,C.J.Yarnold,R.W.Marston,P.D.Johnson,S.F.Johnsen,J.J.Palfrey,D.Vaidya,S.Erfan,O.Ichihara,B.Felicetti,S.Palan,A.Pedret-Dunn,S.Schaertl,I.Sternberger,A.Ebneth,A.Scheel,D.Winkler,L.Toledo-Sherman,M.Beconi,D.Macdonald,I.Munoz-Sanjuan,C.Dominguez,and J.Wityak.2012.Discovery and structure-activity relationship of potent and selective covalent inhibitors of transglutaminase 2 for Huntington's disease.J Med Chem.55:1021-1046.
Verderio,E.A.,T.Johnson,and M.Griffin.2004.Tissue transglutaminase in normal and abnormal wound healing:review article.Amino Acids.26:387-404.