说明书茶鲜叶中茶儿茶素制备工艺
技术领域
本发明涉及一种茶鲜叶中茶儿茶素制备工艺。
背景技术
茶叶(CamelliaSinensis(L.)O.Kuntze)起源于我国，流传于世界。茶作为饮料，长年饮用有益于身心健康。茶叶中所含有的茶儿茶素、茶氨酸及茶多糖，等功效成分具有提神清心、去腻减肥、生津止渴、降火明目、止痢除湿、促进人体产生具有解毒作用的谷胱甘肽S-转移酶(http://www.bioon.com/biology/Class18/310219.shtml)，等药理作用，并对心脑血管病、糖尿病、癌症，等现代疾病有一定预防及治疗作用。绿茶(干茶)中的儿茶素一般高于7%(w/w)，是茶叶重要的风味与保健因子，故可看作茶叶品质等级的重要指标。茶儿茶素类成分在绿茶中主要以表型构象存在（如EC，EGC，ECG，EGCG），并含有一定量的差向异构体(如C，GC，CG，GCG)。茶儿茶素(包括顺式与反式结构)在药理功效上具有抗氧化、抗炎症、抗癌与保护心脑血管的作用(涂云飞,毛志方,朱跃进,等.中国茶叶加工,2009,(2):32-34.)。
目前，茶儿茶素市售产品通常利用水或乙醇水溶液从干茶中制备的茶多酚进一步精制分离所得。茶儿茶素的精制纯化制备主要采用吸附树脂富集技术及液相色谱层析技术。吸附材料分离法是利用固体分离材料与茶儿茶素类物质间的各种相互作用进行富集而得到分离的一种方法。大孔树脂(PS)交联N-Methyl-N-p-Vinylbenzylacetamide(PMVBA)，N-Methyl-N-p-Vinylbenzylurea(PMVBU)和N-Methylacrylamide(PMA)制成的三种树脂(JianhanHuang,KelongHuang,SuqinLiu,etal.JournalofColloidandInterfaceScience,2007,315(2):407-14.)运用于吸附水溶液中茶多酚—儿茶素，吸附结果表明PMVBU大于PMVBA大于PMA。其吸附等温线与吸附焓具有相同的顺序。并且大孔吸附树脂poly(styrene-divinylbenzene)(PS-DVB)能够同时吸附茶多酚—儿茶素与咖啡碱，茶多酚—儿茶素的吸附是由于氢键与疏水键同时作用的结果，而咖啡碱的吸附仅是由于疏水的作用。然而这些树脂对这两种物质的吸附仍具有一定的量，不具有选择性吸附。合成的特异性吸附树脂PVP-DEGMA-TAIC可针对茶多酚—儿茶素的富集(ZhaoRuiying,YanYu,LiMingxian,etal.ReactiveandFunctionalPolymers,2008,3(68):768-774.)。杨文泓(杨文泓,赵长青,高杰,等.用大孔氨甲基聚苯乙烯树脂选择性吸附分离茶多酚和咖啡因.离子交换与吸附,2007,23(6):481-488.)等通过合成的大孔氨甲基聚苯乙烯树脂可实现对茶多酚有更大亲和力，而对咖啡碱较弱的特点，实现茶多酚—儿茶素的纯化。
张盛(张盛,刘仲华,黄建安,等.茶叶科学,2002,22(2):125-130)等亦较为广泛的考察了目前市售的大孔吸附树脂(苯乙烯系列及丙烯酸系列，涉及D101、D14、D16、DM130、D3520、AB-8、X-5、NKA、NKA-9、NKA-Ⅱ、H103)对于小叶种及大叶种茶多酚中儿茶素的富集效果。除NKA-Ⅱ与D14树脂在大叶儿茶素粗品中解吸率较高外(>80%,w/w)，其余树脂对茶多酚中儿茶素吸附高保留率使得其解析率均较低；而且D14、DM130、AB-8、X-5、和D3520树脂对原料中杂质的吸附量要大于对儿茶素组分的吸附。另外，钟世安(钟世安,贺国文,涂秋云,等.离子交换与吸附,2007,23(5):392-399.)等亦比较了5种树脂对茶多酚的吸附性能，发现AB-8>PA>HPD600>NKA-9>NKA-II。对于HP-600(仉燕崃.大连理工大学硕士学位论文,2006年度)大孔吸附树脂，如以10%的乙醇洗脱主要收集为EGCG，提高乙醇浓度至45%时可洗脱收集ECG，从而实现两者的有效分离。聚丙烯酸系列(EP1767097)如AmberliteXAD-7、AmberchromCG-71，或聚酰胺类(杨性民,刘青梅,高海月,等.中国食品学报,2006,6(5):77-80.;王传金,魏运洋,朱广军,等.应用化学,2007,24(4):443-447.;唐课文,周春山,钟世安,等.光谱学与光谱分析,2003,23(1):143-145.)亦可运用于茶多酚—儿茶素组分的纯化，其吸附与解吸后可制备高纯度的EGCG单体。
文献亦报道了D202,XDA-1,D201,D900,LSA-7,HP-20的吸附效果(龚志华,黄甜,庞月兰,等.湖南农业大学学报(自然科学版),2010,36(1):87-90)，其中HP-20的效果较理想。中国专利(CN1075397C)公开了一种采用粗孔硅胶担载聚酰胺吸附水提茶提液后，再用85%的乙醇洗脱，得率在90%以上。另外，朱斌与陈晓光(朱斌,陈晓光.食品与机械,2009,25(4):83-85.)利用二次柱层析制备了高纯度的EGCG，其原料为市售商品茶多酚，先用聚酰胺柱层析预分离EGCG后，再用硅胶柱制备得98%的纯度。同时中压硅胶柱层析(杨磊,高彥华,祖元刚,等.林产化学与工业,2007,27(2):100-104.)采用乙酸乙酯/石油醚/甲酸(6:4:1)亦可以实现连续纯化茶叶中的EGCG及ECG，其纯度可达98%的产品，回收率亦在80%以上。儿茶素中的EGCG与ECG分离纯化还可通过反相C18液相色谱(林丹,李春苗,鲜殊,等.天然产物研究与开发,2013,25(1):92-95.)；或价格昂贵的葡聚糖凝胶SephadexLH-20(黄静.合肥工业大学硕士学位论文,2004年度)作为分离介质，以无水乙醇作为洗脱剂时可以有效的将两者分离，纯度均在80%以上。
随着我国科学技术的进步，分离与纯化领域也已掀起了“绿色革命”，诸如利用天然的木质纤维素进行改性制备吸附性材料(梁慧玲,梁月荣,陆建良,等.浙江大学学报(农业与生命科学版),2006,32(6):665-670)进行茶多酚—茶儿茶素吸附、减压膜蒸馏或渗透汽化技术(CN1164583C)、超临界CO2萃取(CN1088053C;CN1109010C)与膜分离技术(CN1148365C)，等，一定程度上降低了工厂中纯化过程中所使用的有机溶剂(如，二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷)所带来的潜在危害。另外，还有人尝试先将儿茶素酚羟基进行酯类转化(Wo-07-041891)降低其极性后，利用溶剂萃取，进一步采用酸水解制得高纯度儿茶素产品。上述技术中存在如下问题：(1)与茶儿茶素共存的酯溶性茶色素永久性吸附于纯化茶儿茶素的合成树脂、反相液相色谱填料等，造成柱头材料污染，进样口易堵塞，填料寿命缩短，且废弃的填料无法再利用而造成环境污染；(2)木质纤维素材料经酸碱活化易造成环境污染；(3)合成的有机树脂存在使用过程中降解的产物有毒；(4)超临界CO2应用于茶儿茶素纯化，生产成本投入高，产品得率低，不具备工业化放大前景；(5)凝胶填料SephadexLH-20虽然分离效率好，但材料成本昂贵。
与此同时，我国茶资源丰富，特别是大量夏秋茶鲜叶由于滋味欠佳，难以被加工成供消费者喜爱的茶饮料。又鉴于人们崇尚天然产品，从而这一天然资源常被用来制备茶多酚产品。所采用的步骤通常为将采摘的茶鲜叶经杀青、揉捻、干燥后(便于贮藏)，结合萃取与树脂纯化所得。但目前市售茶多酚产品既含有难溶于水的脂溶性色素成分，又含有水溶性色素，而无色的茶儿茶素含量偏低。导致目前茶多酚色素偏多的原因可能归于(1)梗叶未分离的茶梗中色素；(2)揉捻后的茶叶经120℃高温干燥后多酚类发生了一定的氧化；(3)金属提取罐中铁质元素络合部分茶多酚；(4)水溶性色素随有效成分同时被萃取。本发明基于采摘的茶鲜叶(不经干燥)直接通过乙酸乙酯等有机溶剂萃取纯化制备酯型茶儿茶素(CN1534034A;CN102304115A)以及乙酯乙酯可以富集茶儿茶素(姜绍通,潘丽军,黄树新.农业工程学报,1997,(4):202-206)的事实，提出了茶鲜叶经杀青钝酶、粉碎，利用一定水饱和乙酸乙酯动态萃取。萃取有机相再与水平衡后，利用石油醚促使茶儿茶素由有机上相转入水相，达到茶儿茶素与脂溶性色素类成分(如叶绿素，叶黄素类)分离的目的。再进一步利用与SephadexLH-20结构相仿，且安全、廉价、易生物降解的不溶性低取代羟丙基纤维素(约10%取代度，市售价约48元/kg)富集茶儿茶素进行精制，从而实现高效、环保、节能的目标，产品质量高。
发明内容
本发明旨在从经济、生态效益及夏秋茶资源有效利用的角度，提出一种茶鲜叶中茶儿茶素富集制备工艺，具体步骤如下。
1.一种茶鲜叶中茶儿茶素制备工艺，其特征在于采用如下步骤实现：
(1)茶园采摘的茶鲜叶高温杀青；
(2)杀青叶粉碎机粉碎至细颗粒；
(3)将粉碎叶和水饱和乙酸乙酯按比例混合，并置于特定温度下萃取茶儿茶素一定时间后，过滤得萃取液；
(4)在上述水饱和乙酸乙酯萃取液中加入一定体积的水和石油醚，并充分震荡混匀后，静置分层取下相水相，待用；
(5)将上述下相进一步与等体积含乙醇的水饱和乙酸乙酯充分震荡混匀后，静置分层取上相，并减压浓缩去除乙醇及乙酸乙酯有机溶剂后，得粗品茶儿茶素；
(6)将上述茶儿茶素粗品溶解于纯水中，上样于不溶于水的低取代度羟丙基纤维素柱，并用含乙酸乙酯的水洗脱吸附的茶儿茶素；
(7)上述茶儿茶素洗脱液与含乙醇的水饱和乙酸乙酯充分震荡混匀后，静置分层取上相，并减压浓缩去除乙醇及乙酸乙酯有机溶剂后，得精制茶儿茶素。
2.根据权利要求1所述的一种茶鲜叶中茶儿茶素制备工艺，其特征在于步骤(3)中特定温度为4℃~50℃。
3.根据权利要求1所述的一种茶鲜叶中茶儿茶素制备工艺，其特征在于步骤(3)中萃取时间为30min~60min。
4.根据权利要求1所述的一种茶鲜叶中茶儿茶素制备工艺，其特征在于步骤(3)中粉碎叶(g)和水饱和乙酸乙酯体积(mL)比例为1:10~1:15。
5.根据权利要求1所述的一种茶鲜叶中茶儿茶素制备工艺，其特征在于步骤(4)中加入水的体积(mL)为水饱和乙酸乙酯萃取液体积(mL)的0.5倍~1.5倍。
6.根据权利要求1所述的一种茶鲜叶中茶儿茶素制备工艺，其特征在于步骤(4)中加入石油醚的体积(mL)为水饱和乙酸乙酯萃取液体积(mL)的0.5倍~1.0倍。
7.根据权利要求1所述的一种茶鲜叶中茶儿茶素制备工艺，其特征在于步骤(5)中含乙醇的水饱和乙酸乙酯指的是按比例1mL水饱和乙酸乙酯添加乙醇的量为0mL~0.3mL。
8.根据权利要求1所述的一种茶鲜叶中茶儿茶素制备工艺，其特征在于步骤(6)中含乙酸乙酯的水指的是饱和乙酸乙酯的水进一步用水稀释至2.5倍~5倍。
本发明的有益效果是避免了茶鲜叶按传统绿茶加工方式加工成干茶，再从干茶中提取精制茶儿茶素的被动局面。同时，水饱和乙酸乙酯不仅可以从茶鲜叶中提取茶多酚—茶儿茶素，而且叶绿素等脂溶性有益色素亦可被提取出来，并且利用石油醚的加入可有效将脂溶性的叶绿素、叶黄素等成分与茶多酚—茶儿茶素有效分开，实现低温高效制备。另一方面，由于所采摘的鲜叶主要为夏秋茶所产的成熟老叶，茶叶中富含有茶多糖类成分，去除茶色素及茶儿茶素的茶叶中所富含的茶多糖可以被进一步提取纯化，且降低了茶多糖从传统粗老茶叶中提取带来的色泽深等问题，从而为茶多糖的高效制备提供了一种方式。因此，本发明方法在茶鲜叶中的茶儿茶素、茶叶绿素、茶多糖的富集制备领域将有广阔的应用前景。
附图说明
图1是浙江大学华家池校区茶园种植的茶叶及采摘的茶鲜叶叶片。
图2是特定温度和时间及萃取次数对茶鲜叶中茶多酚—茶儿茶素萃取影响。
图3是水浴沸煮茶儿茶素单体后酒石酸亚铁显色吸光值变化。
图4是石油醚促使茶多酚—茶儿茶素转入水相的效果。
图5是乙醇对茶儿茶素在乙酸乙酯—水体系中的分配平衡的影响。
图6是两次萃取酯型儿茶素的乙酸乙酯有机相获取效果。
具体实施方式
下述实施例的目的在于进一步举例描述本发明，而不是用来限制本发明。
下述实施例中，所述的茶鲜叶为浙江大学华家池校区茶园中采摘的当年同一品种的成熟叶片(图1)，采摘时间为2014年06月中旬。
下述实施例中，茶儿茶素的显色采用酒石酸亚铁法(QB/T2154-95)。实验时取170μL萃取液，1mL酒石酸亚铁溶液，和3mL缓冲溶液(磷酸二氢钠-氢氧化钠，pH7.5)，充分混合后，采用1cm玻璃比色皿于540nm下进行比色分析(水作为空白对照)。
下述实施例中，产品中茶儿茶素及咖啡碱的测定采用反相高效液相色谱法(ISO14502-2，Determinationofsubstancescharacteristicofgreenandblacktea-Part2:Contentofcatechinsingreentea-Methodusinghigh-performanceliquidchromatography)。高效液色谱仪为Waters1525配备柱温箱、2487紫外可见双通道检测器、717-plus自动进样器、Breeze控制软件。色谱柱为方法中推荐的键合苯酰基的反相C18色谱柱。
下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
取约20g茶鲜叶微波钝酶30秒，打粉机充分粉碎至细颗粒后，取1g粉碎茶鲜叶置于150mL平底三角烧瓶中，利用正交实验分别考察水饱和乙酸乙酯加入体积(A,mL)、萃取温度(B,℃)、萃取时间(C,min)、乙醇添加量(D,mL)对茶儿茶素萃取效率的影响。实验因素水平如下表1所示。
表1正交实验因素水平值
正交实验实施安排顺序及吸光值记录如下表2。萃取结束后，迅速将萃取液通过垫有脱脂棉的漏斗，以乙酸乙酯定容于50mL容量瓶中。萃取液中茶多酚—茶儿茶素定量显色采用酒石酸亚铁法。
表2正交实验实施方案
一般情况下，正交实验极差分析可判断各实验因素对实验指标的影响主次，且极差值大小与因素重要性呈正相关。上述实验所获取的吸光值进行极差分析如下(表3)。
表3极差统计分析
上述实验结果表明，各因素的主次顺序分别为B=C>D>A，优化水平组合为：B3C3D2A2。但极差亦表明，B和C对茶鲜叶中茶多酚—茶儿茶素萃取效率最为明显，而A和D在所选用水平范围内几乎可忽略其影响；即萃取温度与萃取时间需作为重点考察因素，进行进一步优化。
实施例2
鉴于乙酸乙酯为低沸点有机溶剂，结合上述实验结果，在茶鲜叶(g)与水饱和乙酸乙酯(mL)的质量体积比为1:10前提下，进一步考察25℃、50℃、萃取时间与萃取次数茶多酚—茶儿茶素萃取效率的影响。图2中A、B、C、D分别代表25℃萃取30min、50℃萃取30min、25℃萃取60min、50℃萃取60min条件下，萃取次数对其吸光值的影响。由图2可看出，30min内提高温度有利于目标物质的溶出，但在60min萃取时间下25℃的萃取液中酒石酸亚铁显色值高于50℃。说明长时间的高温萃取，茶儿茶素会发生部分氧化致使酒石酸亚铁显色值偏低，与我们前期的实验结果相符合，即先将茶儿茶素单体水浴沸煮后其显色吸光值会降低(图3所示)。对比实施例1，茶鲜叶(g)与水饱和乙酸乙酯(mL)的质量体积比为1:10的比例已基本达到1:20的水平，因为在图2中，第1次基本萃取出目标产物。
实施例3
基于上述实施例，取水饱和乙酸乙酯萃取茶鲜叶萃取液1mL，加入水0.5mL~1.5mL，石油醚0.5mL~1mL，充分震荡混匀后取萃取下相中的水溶液进行酒石酸亚铁显色测定吸光值。结果如图4所示，随着水体积的增加水相中茶多酚—茶儿茶素的浓度相应呈比例降低，但1mL的石油醚可促使更多的茶儿茶素转入水相(相比于0.5mL的石油醚)。即固定萃取液和石油醚体积比例的前提下，水体积的增加可使目标产物更多的转入水相中。
同时实验亦选取了市售30%(w/w)、50%(w/w)、90%(w/w)的茶多酚考察乙醇添加量对水饱和乙酸乙酯和水体系萃取效果的影响(图5)。实验在1mL水饱和乙酸乙酯和1mL溶解茶多酚的饱和乙酸乙酯水溶液体系分别添加0.1mL、0.2mL、0.3mL的乙醇，充分震荡混匀后测定下相中咖啡碱及各茶儿茶素浓度。下相中咖啡碱及各茶儿茶素(除ECG略有上升外)随乙醇浓度的增加而降低，说明乙醇增加了咖啡碱及各茶儿茶素在乙酸乙酯相中的溶解度。并且下相等体积一次萃取各酯型茶儿茶素萃取率接近90%(图6)。
实施例4
取60g茶鲜叶叶片，钝酶活并充分粉碎后加入600mL水饱和乙酸乙酯于50℃密封萃取30min后，减压滤纸过滤得滤液约550mL。将其转入2000mL分液漏斗中，加入500mL石油醚和270mL水，震荡充分混匀后分离出水相，并进一步离心(3500rpm)和分离得水相约260mL(水相颜色眼观为橘黄色)。水相进一步加等体积含乙醇的水饱和乙酸乙酯萃取浓缩至干后,水溶解于100mL，上样于装有5g低取代羟丙基纤维素(约10%取代度)玻璃色谱(柱直径2.69cm)，流速4mL/min，加50mL水以同样流速洗脱后，再以200mL稀释5倍的饱和乙酸乙酯的水溶液洗脱，并收集其溶液，以同体积的水饱和乙酸乙酸萃取，浓缩1次，并于80℃真空干燥得茶儿茶素产品0.48g(EGCG占57.35%，ECG占21.42%，咖啡碱占8.67%)。