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1、10申请公布号CN104120096A43申请公布日20141029CN104120096A21申请号201410261781X22申请日20140612CGMCCNO821520130918C12N1/20200601C02F3/28200601C02F3/34200601C12R1/29200601C02F101/3220060171申请人浙江省环境保护科学设计研究院地址310007浙江省杭州市西湖区天目山路109号72发明人王慧荣徐佳佳梅荣武韦彦斐李明智任旭峰74专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司33224代理人胡红娟54发明名称一种小单孢菌菌株及其应用57摘要本发明公开了一种小单。
2、胞菌菌株及其应用，小单胞菌菌株命名为MICROMONOSPORAAURANTIACA，中文名为桔橙小单孢菌，株号为ZHY15，分离自生产萜烯树脂的污水处理厂的活性污泥，保藏号为CGMCCNO8215，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的小单胞菌菌株应用于萜烯的降解，效果较好，尤其对蒎烯的降解效果显著；本发明放电小单孢菌菌株还应用于萜烯化合物合成废水处理中，对萜烯类化合物合成废水具有较好的处理效果；还用于苯系类化合物化工废水处理中。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表3页19中华人民共和国国家。
3、知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表3页10申请公布号CN104120096ACN104120096A1/1页21一种小单胞菌菌株，其特征在于，命名为MICROMONOSPORAAURANTIACA，保藏号为CGMCCNO8215。2一种如权利要求1所述小单胞菌菌株在降解萜烯中的应用。3根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述萜烯为蒎烯。4根据权利要求3所述的应用，其特征在于，降解所述蒎烯的方法如下取对数生长期的所述小单胞菌菌株，离心收集菌体，无菌水洗涤，无菌水重悬后调OD600到15，得新鲜菌液；将所述新鲜菌液接种至含有蒎烯为唯一碳源的无机盐液体培养基中，摇瓶培养。5根。
4、据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述摇瓶培养在2830摇瓶培养4550小时。6根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述无机盐液体培养基中蒎烯的浓度为180200MG/L。7一种如权利要求1所述小单孢菌菌株在萜烯类化合物合成废水处理中的应用。8一种如权利要求1所述小单孢菌菌株在苯系类化合物化工废水处理中的应用。权利要求书CN104120096A1/7页3一种小单孢菌菌株及其应用技术领域0001本发明涉及一株小单胞放线菌降解萜烯化合物的技术领域，具体涉及到菌的富集培养、筛选、分离及菌株底物谱的验证、处理萜烯化合物合成废水的工艺方法。背景技术0002萜烯类化合物作为重要的化工中间体，广泛用于木。
5、材加工、香料制造、制药、化工等行业。这些行业生产过程中所产生的废水含有大量的有机物质，COD高、毒性大、难生化降解，属于典型的高浓度难降解有机废水。0003萜烯类化合物结构多样，大多萜烯类化合物具有挥发性，在大气中形成气溶胶粒子，易造成呼吸道疾病，危害人们的身体健康。有些萜烯类化合物具有较强的还原性，会与大气中的臭氧、羟基等自由基发生反应，形成光化学烟雾，破坏臭氧层TEMPERATUREDEPENDENCEOFTHERANGEBETWEEN243KAND303KPHYSICALCHEMISTRYCHEMICALPHYSICS,2009,111323232328。所以萜烯类化合物合成废水如果处理。
6、不当排放，将导致严重的环境污染，因此必须对该类废水加大处理力度。0004其中具有环烯烃结构的蒎烯C10H16是单萜类物质的典型代表，它进入大气后，直接危害人类健康，并与大气中的臭氧、羟基等自由基发生反应，形成光化学烟雾，破坏臭氧层。目前已报道的对蒎烯有降解作用的微生物主要有假单胞菌一株蒎烯降解菌的分离鉴定及降解特性研究中国环境科学，2011,314622630，芽孢杆菌DEGRADATIONOFPINENEBYBACILLUSPALLIDUSBR425BIODEGRADATION,1998,95337341，曲霉菌BIOCONVERSIONOFALPHAPINENETOVERBENONEBYR。
7、ESTINGCELLSOFASPERGILLUSNIGERAPPLIEDMICROBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY,2000,533335337，诺卡氏菌KROPPENSTEDTBACTERIALDEGRADATIONOFNATURALRUBBERAPRIVILEGEOFACTINOMYCETESFEMSMICROBIOLLETT1997，1505179188，戈登氏菌GORDONIAPOLYISOPRENIVORANSSPNOV,ARUBBERDEGRADINGACTINOMYCETEISOLATEDFROMANAUTOMOBILETYREINTJSYSTBACTERIOL19。
8、99,49417851791等。0005虽然在ACTINOMYCES和MICROMONOSPORA里都有报道对萜烯化合物降解的菌株BIODEGRADATIONOFCIS1,4POLYISOPRENERUBBERSBYDISTINCTACTINOMYCETESMICROBIALSTRATEGIESANDDETAILEDSURFACEANALYSISAPPLENVIRONMICROBIOL,2000,66416391645，但是海洋小单孢菌MICROMONOSPORAMARINE对萜烯化合物能够降解尚无报道。发明内容0006本发明提供了一种小单胞菌菌株及其应用，该小单孢菌具有较广的降解底物谱，对萜。
9、烯化合物合成废水具有较好的处理效果。0007一种小单胞菌菌株，命名为MICROMONOSPORAAURANTIACA，中文名为桔橙小单孢菌，株号为ZHY15，保藏号为CGMCCNO8215。说明书CN104120096A2/7页40008本发明的桔橙小单孢菌MICROMONOSPORAAURANTIACAZHY15保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年9月18日。0009所述桔橙小单孢菌MICROMONOSPORAAURANTIACAZHY15分离自生产萜烯树脂的污水处理厂的活性污泥。0010所述桔橙小单。
10、孢菌ZHY15的分离培养基成分如下0011无机盐培养基MMG/LK2HPO43H2O06G，KH2PO4015G，NANO3225G，NH4CL286G，MGCL2006G，CACL20006G，FESO47H2O0003G；微量元素母液5MLZNCL288MG/L，MNCL260MG/L，KI10MG/L，NA2MOO4100MG/L，H3BO450MG/L，PH为7072；121灭菌20MIN，添加一定浓度的蒎烯为唯一碳源。0012所述桔橙小单孢菌ZHY15生长LB培养基成分如下蛋白胨10G/L，酵母浸出粉5G/L，NACL10G/L，葡萄糖1G/L，PH7072；0013本发明还提供了一。
11、种所述小单胞菌菌株在降解萜烯化合物合成废水中的应用，尤其是在萜烯降解中的应用。0014本发明的小单胞菌菌株应用于萜烯的降解，效果较好，尤其对蒎烯的降解效果显著。0015本发明的小单胞菌菌株应用于蒎烯降解的方法如下0016取对数生长期的桔橙小单孢菌ZHY15菌株，离心收集菌体，无菌水洗涤，无菌水重悬后调OD600到15，得新鲜菌液；将所述新鲜菌液接种至含有蒎烯为唯一碳源的无机盐液体培养基中，摇瓶培养。0017优选地，所述摇瓶培养在2830摇瓶培养4550小时；进一步优选为在30摇瓶培养48小时。0018优选地，所述无机盐培养基中蒎烯的浓度为180200MG/L，进一步优选地，所述无机盐培养基中蒎。
12、烯的浓度为200MG/L。0019摇瓶培养时的转速优选为180RPM。0020摇瓶中优选盛装100ML培养基，每次接种3ML重悬后的新鲜菌液。0021通过气相色谱分析蒎烯的降解率，本发明的菌株对蒎烯的降解率可达到85以上。0022所述无机盐液体培养基MM的成分为G/LK2HPO43H2O06G，KH2PO4015G，NANO3225G，NH4CL286G，MGCL2006G，CACL20006G，FESO47H2O0003G；微量元素母液5MLZNCL288MG/L，MNCL260MG/L，KI10MG/L，NA2MOO4100MG/L，H3BO450MG/L，PH为7072；121灭菌20M。
13、IN，添加蒎烯为唯一碳源。0023同时，本发明的桔橙小单孢菌ZHY15具有较广的降解谱，在无机盐培养基中分别添加200MG/L的不同底物苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、石油醚、环己烷、正己烯、环己烯、十四烷、二十八烷、甲基乙基酮等工业中常见的污染物作为唯一碳源，对有机物均有不同程度的降解。0024本发明还提供了一种所述小单孢菌菌株在萜烯类化合物合成废水处理中的应用，对萜烯类化合物合成废水具有较好的处理效果。0025处理方法如下说明书CN104120096A3/7页500261挑取桔橙小单孢菌ZHY15菌株接种在100ML液体LB培养基中，35,180转/分振荡培养至对数生长期，离。
14、心收集菌体，用无菌水洗涤3次，重悬至OD600到15，获得新鲜菌液；00272取生产萜烯树脂企业污水处理厂的活性污泥和污水处理厂的出水，活性污泥按照重量分数为30的量投加到所取出水中，将新鲜菌液接种至活性污泥与出水的混合液中，搅拌培养。0028优选地，30，180RPM培养48H，静置去除上清液后再添加至与第一次同样体积的出水，30，180RPM培养48H，最后测定水样中COD的去除情况。0029步骤2中所取出水中COD为500600MG/L。0030步骤2中重悬后的菌液的接种量为13。0031采用本发明菌株处理后的出水COD的降解率达30以上，随着接种量的增加降解率升高。0032本发明还提供。
15、了一种所述小单孢菌菌株在苯系类化合物化工废水处理中的应用。0033处理方法如下00341挑取菌株ZHY15单菌落接种在100ML的液体LB培养基中，35、180转/分振荡培养至对数生长期，获得新鲜菌液。00352采用厌氧一级接触氧化二级接触氧化出水的工艺处理，厌氧反应器内投加处理苯系类化合物化工废水的厌氧污泥，含泥量为10G/L；接触氧化池内以组合填料做载体，在接触氧化池里加入处理苯系类化合物化工废水的好氧池活性污泥5G/L，每天按照5V/V投加新鲜菌液，连续投加一周，进行驯化挂膜。0036在这一周的驯化挂膜过程中进水为该企业污水处理厂调节池的水，COD基本在3500MG/L左右，前3天，HR。
16、T为48H，DO为25MG/L。驯化后4天，HRT为36H，DO为25MG/L。经过一周的驯化后，第八天开始，HRT为24H，DO为25MG/L连续进水。从第三天开始，每天测定出水COD的浓度，对COD的降解率达到90以上。0037本发明的小单孢菌菌株还可以应用于处理生成维生素E的废水处理中，处理方法类似于苯系类化合物化工废水，对此类化工废水的COD降解率在90左右。0038本发明的菌株对化工废水具有较好的处理效果，尤其对石油类废水、含芳烃类废水处理效果较好。0039与现有技术相比，本发明具有如下有益效果0040本发明的菌株具有较广的降解谱，在工业废水处理中，可以使得污水处理成本降低。对于保护。
17、生态环境，保护人民的身体健康具有重要的意义。具体实施方式0041实施例1放线菌桔橙小单孢菌MICROMONOSPORAAURANTIACAZHY15的获得及鉴定0042一、菌株的获得及鉴定00431初筛取生产萜烯树脂的废水处理系统的活性污泥10G，接种在含有200MG/L蒎烯的无机盐液体培养基中，30，160RPM摇床富集培养5天，取1ML富集菌液接种在新的含相同浓度的蒎烯的液体培养基中，再富集2次。然后取1ML菌液用无菌水进行说明书CN104120096A4/7页6梯度稀释，涂布于含200MG/L蒎烯的无机盐培养基上，平板倒置30培养，观察平板上长出单菌落，然后挑取不同形态、颜色的菌落显微镜。
18、观察，将形态相同的菌落在平板培养基上划线分离纯化。0044所述菌株的分离培养基成分如下无机盐液体培养基MMG/LK2HPO43H2O06G，KH2PO4015G，NANO3225G，NH4CL286G，MGCL2006G，CACL20006G，FESO47H2O0003G；微量元素母液5MLZNCL288MG/L，MNCL260MG/L，KI10MG/L，NA2MOO4100MG/L，H3BO450MG/L，PH为7072；121灭菌20MIN，添加一定浓度的蒎烯为唯一碳源。00452复筛将不同形态的单菌落接种在液体LB培养基中培养，培养至对数生长期，用无菌水离心洗涤3次后，调OD600至15。
19、，接种1ML菌液到含有200MG/L蒎烯的液体无机盐培养基，在30，160RPM培养48H，气相色谱法测定其降解效果，筛选出一株降解效果好的菌株。0046所述菌株生长培养基液体LB培养基成分如下蛋白胨10G/L，酵母浸出粉5G/L，NACL10G/L，葡萄糖1G/L，PH7072；0047步骤2中蒎烯的降解率采用气相色谱分析检测方法0048对摇瓶上方蒎烯气体进行定量分析，色谱柱为HPINNOWAX型毛细管柱30MX032MMX05M，进样口250，检测器FID280，柱温为140，流速1ML/MIN。程序升温40，1MIN，20/MIN至120，60/MIN至180，2MIN。流速1ML/MI。
20、N，进样体积10L。液相中蒎烯经正己烷萃取后采用气相色谱进行定量分析。0049二、菌株的鉴定005016SRDNA序列鉴定0051F275AGAGTTTGATCTGGCTCAG3SEQIDNO10052R14925TACCTTGTTACGACTT3SEQIDNO20053采用上述引物进行PCR扩增，从菌株ZHY15中扩增到16SRDNA基因片段，将所获得16SRDNA克隆到PGEMTEASY载体后送上海基康生物技术有限公司测序。16SRDNA的部分序列如SEQIDNO3所示，在GENBANK登录号为KJ721976。0054与GENBANK中的序列比对发现，菌株ZHY15的16SRDNA序列与。
21、MICROMONOSPORAAURANTIACA菌株序列的同源性为99。0055三、菌株ZHY15的保藏0056通过以上鉴定结果，确认菌株为MICROMONOSPORAAURANTIACA，将其命名为桔橙小单孢菌MICROMONOSPORAAURANTIACAZHY15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏日期为2013年9月18日，保藏号为CGMCCNO8215。0057实施例2菌株ZHY15在无机盐基础液体培养基对不同化合物的降解00581、从平板挑取一环菌接种在液体生长培养基液体LB培养基中，35，160RPM培养至对数生长期，12000RPM离心收集菌体，用。
22、无菌水洗涤3次，无菌水重悬后调OD600到15，接种3ML到分别添加200MG/L各种有机物为唯一碳源的无机盐液体培养基中，在250ML摇瓶中装有100ML培养基，30，180RPM摇床培养48H后，分别取样测定对不同底物的降解率，以不接种的空白为对照。00592、在无机盐培养基中添加的有机污染物是BTEX苯系物苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、石油醚、环己烷、正己烯、环己烯、十四烷、二十八烷、甲基乙基酮、说明书CN104120096A5/7页7蒎烯。00603、有机物的分析检测方法BTEX、石油醚、环己烷、正己烯、环己烯、十四烷、二十八烷等萃取后同样采用气相色谱定量测定，色谱柱为。
23、HPINNOWAX型毛细管柱30MX032MMX05M，进样口250，检测器FID300，柱温为160，流速1ML/MIN，进样体积10L。0061甲基乙基酮采用气相色谱直接测定HPINNOWAX型毛细管柱30MX032MMX05M，进样口250，检测器FID280，柱温为120，流速1ML/MIN，进样体积10L。0062蒎烯的检测方法采用气相色谱对摇瓶上方蒎烯气体进行定量分析，色谱柱为HPINNOWAX型毛细管柱30MX032MMX05M，进样口250，检测器FID280，柱温为140，流速1ML/MIN。程序升温40，1MIN，20/MIN至120，60/MIN至180，2MIN。流速1。
24、ML/MIN，进样体积10L。液相中蒎烯经正己烷萃取后采用气相色谱进行定量分析。0063表1菌株对各种有机物的降解情况0064碳源去除率碳源去除率蒎烯8523石油醚8473苯4576环己烷828甲苯3041正己烯592乙苯4735环己烯7174邻二甲苯4809十四烷8131间二甲苯4644二十八烷6576对二甲苯5493甲乙酮93490065实施例3菌株ZHY15对萜烯树脂生产废水的处理效果0066从平板挑取一环菌接种在液体生长培养基液体LB培养基中，35，160RPM培养至对数生长期，12000RPM离心收集菌体，用无菌水洗涤3次，无菌水重悬后调OD600到15。0067取生产萜烯树脂企业污。
25、水处理厂的活性污泥和污水处理厂的出水，出水COD为56344MG/L左右，在500ML的三角瓶内装250ML污水处理厂的出水，活性污泥按照30的量投加，分别接种1、2、3的新鲜菌株，对照不加菌，30，180RPM培养48H，静置，倒掉100ML的上清液，再添加同样体积的出水，30，180RPM培养48H，测定水样中COD的去除情况。试验结果如表20068表2菌株ZHY15对萜烯树脂生产废水的处理效果0069说明书CN104120096A6/7页81接种量2接种量3接种量对照CODMG/L43159403783802449354降解率23428343251124100700071实施例4菌株ZH。
26、Y15对生产维生素E的废水处理的效果0072挑取菌株ZHY15单菌落接种在100ML的液体LB培养基中，35、180转/分振荡培养至对数生长期，获得新鲜菌液。0073采用厌氧一级接触氧化二级接触氧化出水的工艺处理，用2L的圆柱体做反应器，厌氧反应器内投加该企业的厌氧污泥，含泥量为10G/L，接触氧化池内以组合填料做载体，在反应器里加入该企业的好氧池活性污泥5G/L，每天按照5V/V投加菌株ZHY15的新鲜的菌液，连续投加9天。0074在这9天的驯化挂膜过程中进水为该企业调节池的水，COD约在4000MG/L左右，前3天，HRT为48H，DO为25MG/L。驯化3天后，HRT为36H，DO为25。
27、MG/L。第七天开始，HRT为24H，DO为25MG/L。经过9天的驯化后开始连续进水，HRT为24H，DO为25MG/L。从第三天开始，每天测定出水COD的浓度。0075企业采用调节池一级好氧活性污泥二级好氧活性污泥厌氧CASS出水的工艺，出水COD常年基本稳定在1000MG/L左右，从好氧池到出水COD去除率约为75。企业对出水水质的要求COD500MG/L。0076表3菌株ZHY15对生产维生素E的废水处理的效果0077检测时间天第3天第4天第5天第6天第7天第8天出水CODMG/L413373692140676382493554342106去除率89679077898390449111。
28、89470078实施例5菌株ZHY15对含苯环类化工废水的处理效果0079挑取菌株ZHY15单菌落接种在100ML的液体LB培养基中，35、180转/分振荡培养48小时，获得新鲜菌液。0080采用厌氧一级接触氧化二级接触氧化出水的工艺处理，用2L的圆柱体做反应器，厌氧反应器内投加处理该类废水的厌氧污泥，含泥量为10G/L，接触氧化池内以组合填料做载体，在反应器里加入处理该类废水的好氧池活性污泥5G/L，每天按照5V/V投加菌株ZHY15的新鲜的菌液，连续投加一周。0081在这一周的驯化挂膜过程中进水为该企业调节池的水，COD基本在3500MG/L左右，前3天，HRT为48H，DO为25MG/L。
29、。驯化后4天，HRT为36H，DO为25MG/L。经过一周的驯化后，第八天开始，HRT为24H，DO为25MG/L连续进水。从第三天开始，每天测定出水COD的浓度。0082表4菌株ZHY15对含苯环类化工废水处理的效果说明书CN104120096A7/7页90083检测时间天第3天第4天第5天第6天第7天出水CODMG/L3062128860302762904327528去除率912591759135917092130084由以上实施例可见，本发明分离的菌株ZHY15，具有较广的降解谱，菌株不仅对烷烃类物质有较好的降解作用，而且对苯系物也有不同程度的降解。对生产萜烯树脂污水处理厂的出水进行处理，结果表明比对照要提高10以上，接种量3是比对照提高201。对类萜烯化合物维生素E的合成废水处理，COD去除率在89以上，比企业75的去除率提高了至少14。对含苯环类的废水处理，COD基本在300MG/L左右，去除率基本都在91以上。所以该菌株在污水处理中的应用，不仅降低了污水处理的成本，而且对于保护生态环境，保护人民的身体健康具有重要的意义。说明书CN104120096A1/3页100001序列表CN104120096A102/3页1100020003序列表CN104120096A113/3页12序列表CN104120096A12。