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1、10申请公布号CN102304123A43申请公布日20120104CN102304123ACN102304123A21申请号201110187923922申请日20110706C07D407/0420060171申请人南京泽朗医药科技有限公司地址210046江苏省南京市栖霞区尧化街道甘家边108号05幢6楼72发明人刘东锋郭琴54发明名称一种制备山荷叶素的方法57摘要本发明公开了一种制备山荷叶素的方法。采用凝胶柱层析和高速逆流色谱法相结合，从南方山荷叶或爵床的醇提物中分离制备山荷叶素。该方法得到的山荷叶素含量可达97以上，具有制备量大、溶剂消耗少、产品纯度高、生产周期短等特点。51INTCL。
2、19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页CN102304129A1/1页21一种制备山荷叶素的方法，其特征在于包括以下步骤取南方山荷叶或爵床的醇提物用95乙醇溶解后上凝胶柱层析，收集含山荷叶素的流分，回收溶剂得山荷叶素粗提物，将山荷叶素粗提物用高速逆流色谱进行进一步分离纯化，最终得到高纯度的山荷叶素单体成分。2根据权利要求1所述的一种制备山荷叶素的方法，其特征在于所述南方山荷叶或爵床的醇提物是以乙醇或甲醇为溶媒，采用加热回流、超声、微波等常用的现有技术提取得到的醇提物。3根据权利要求1所述的一种制备山荷叶素的方法，其特征在于所述凝胶柱层析洗脱条件为二氯甲烷甲醇1。
3、0121梯度洗脱。4根据权利要求1所述的一种制备山荷叶素的方法，其特征在于高速逆流色谱分离的溶剂体系为烷烃脂肪酸酯脂肪醇水组成的溶剂体系，其中烷烃是正己烷、正庚烷或石油醚，脂肪酸值是乙酸乙酯，脂肪醇是甲醇或乙醇，其配比为1（0409）1（0409），以下相为流动相。权利要求书CN102304123ACN102304129A1/3页3一种制备山荷叶素的方法技术领域0001本发明属于中药有效活性成分提取制备领域，涉及一种制备山荷叶素的方法。背景技术0002山荷叶素（DIPHYLLIN）是近期所发现的具有抗肿瘤活性的新结构的天然产物，分子式C21H16O7，分子量380353，属于4苯代2，3萘内酯。
4、类。主要从爵床科、小檗科、芸香科等多种植物中提取分离得到。药理研究表明，DIPHYLLIN具有较好的抗肿瘤活性，对于人鼻咽癌细胞KB的ED503MOL/ML。研究发现DIPHYLLIN类化合物能够作用于细胞分裂周期的S期，GL期，使细胞分裂停留在G1期，对于S期有很强的抑制作用。实验证明，用于HCTLL6细胞时，在24小时内，能够使S期的细胞的比率从70下降到41，而使GL期细胞所占比重由21增加到42，对MCF7细胞也有类似的结果。DIPHYLLIN类化合物具有广泛的生理活性，已引起许多药学家、化学家的广泛关注。0003国内有关制备山荷叶素的方法报道较少，张永利采用醇提、溶剂萃取及各种柱色谱。
5、反复分离纯化得到各单体成分，操作繁琐、样品损失严重，不适合工业生产制备。中国专利（申请号2010105353410）公开了一种乙醇热回流、乙酸乙酯水混合溶剂多级逆流萃取、大孔树脂柱层析、丙酮结晶的方法制备山荷叶素，该方法萃取率低、工艺不稳定。现有技术中，尚无采用高速逆流色谱法分离纯化山荷叶素的工艺报道。发明内容0004本发明的目的是提供一种采用凝胶柱色谱和高速逆流色谱技术结合的方法分离制备山荷叶素，该方法制备量大、生产周期短、工艺稳定、溶剂消耗少、产品纯度高。0005为达到上述目的，本发明采用下列技术方案取南方山荷叶或爵床的醇提物用95乙醇溶解后上凝胶柱层析，收集含山荷叶素的流分，回收溶剂得山。
6、荷叶素粗提物，将山荷叶素粗提物用高速逆流色谱进行进一步分离纯化，最终得到高纯度的山荷叶素单体成分。0006所述南方山荷叶或爵床的醇提物是以乙醇或甲醇为溶媒，采用加热回流、超声、微波等常用的现有技术提取得到的醇提物。0007所述凝胶柱层析洗脱条件为二氯甲烷甲醇10121梯度洗脱。0008高速逆流色谱分离的溶剂体系为烷烃脂肪酸酯脂肪醇水组成的溶剂体系，其中烷烃是正己烷、正庚烷或石油醚，脂肪酸值是乙酸乙酯，脂肪醇是甲醇或乙醇，其配比为1（0409）1（0409），以下相为流动相。0009采用本发明方法制备山荷叶素，制备量大、生产周期短、工艺稳定、溶剂消耗少、产品纯度高。0010下面将结合具体实施例对。
7、本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。说明书CN102304123ACN102304129A2/3页4具体实施方式0011实施例1取南方山荷叶醇提物用95乙醇溶解，上SEPHADEXLH20凝胶柱层析，并用二氯甲烷甲醇混合溶剂梯度洗脱，即用二氯甲烷甲醇体积比分别为101、811、61、41、21的混合溶剂进行洗脱，收集含有山荷叶素的洗脱部分减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，在室温下将溶剂系统正己烷乙酸乙酯甲醇水按体积比105107置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定。
8、相后，再让仪器以800RPM转动，同时将流动相以23ML/MIN的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到动态平衡后，将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在215NM波长处对流出液连续检测，与山荷叶素标准图谱对应，收集并蒸除溶剂，干燥，得产品，经HPLC检测，其纯度为975。0012实施例2取南方山荷叶醇提物用95乙醇溶解，上SEPHADEXLH20凝胶柱层析，并用二氯甲烷甲醇混合溶剂梯度洗脱，即用二氯甲烷甲醇体积比分别为101、811、61、41、21的混合溶剂进行洗脱，收集含有山荷叶素的洗脱部分减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，在室温下将溶。
9、剂系统正庚烷乙酸乙酯甲醇水按体积比107107置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相后，再让仪器以800RPM转动，同时将流动相以18ML/MIN的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到动态平衡后，将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在215NM波长处对流出液连续检测，与山荷叶素标准图谱对应，收集并蒸除溶剂，干燥，得产品，经HPLC检测，其纯度为977。0013实施例3取南方山荷叶醇提物用95乙醇溶解，上SEPHADEXLH20凝胶柱层析，并用二氯甲烷甲醇混合溶剂梯度洗脱，即用二氯甲烷甲醇体积。
10、比分别为101、811、61、41、21的混合溶剂进行洗脱，收集含有山荷叶素的洗脱部分减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，在室温下将溶剂系统正庚烷乙酸乙酯乙醇水按体积比106109置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相后，再让仪器以850RPM转动，同时将流动相以25ML/MIN的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到动态平衡后，将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在215NM波长处对流出液连续检测，与山荷叶素标准图谱对应，收集并蒸除溶剂，干燥，得产品，经HPLC检测，。
11、其纯度为973。0014实施例4取南方山荷叶醇提物用95乙醇溶解，上SEPHADEXLH20凝胶柱层析，并用二氯甲烷甲醇混合溶剂梯度洗脱，即用二氯甲烷甲醇体积比分别为101、811、61、41、21的混合溶剂进行洗脱，收集含有山荷叶素的洗脱部分减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，在室温下将溶剂系统正己烷乙酸乙酯乙醇水按体积说明书CN102304123ACN102304129A3/3页5比104104置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相后，再让仪器以850RPM转动，同时将流动相以30ML/MI。
12、N的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到动态平衡后，将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在215NM波长处对流出液连续检测，与山荷叶素标准图谱对应，收集并蒸除溶剂，干燥，得产品，经HPLC检测，其纯度为974。0015实施例5取南方山荷叶醇提物用95乙醇溶解，上SEPHADEXLH20凝胶柱层析，并用二氯甲烷甲醇混合溶剂梯度洗脱，即用二氯甲烷甲醇体积比分别为101、811、61、41、21的混合溶剂进行洗脱，收集含有山荷叶素的洗脱部分减压旋转蒸发浓缩，得浓缩液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，在室温下将溶剂系统石油醚乙酸乙酯甲醇水按体积比108108置于分液漏斗中振摇，放置，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相泵入色谱柱中，使柱中充满固定相后，再让仪器以800RPM转动，同时将流动相以22ML/MIN的流速泵入，待流动相从出液端流出且两相在色谱中达到动态平衡后，将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在215NM波长处对流出液连续检测，与山荷叶素标准图谱对应，收集并蒸除溶剂，干燥，得产品，经HPLC检测，其纯度为972。说明书CN102304123A。