茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法 【技术领域】
本发明涉及茶叶深加工技术领域， 具体涉及茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法。背景技术 茶鲜叶是茶树顶端新梢的总称， 经过不同加工后形成不同品质特征的成品茶。茶 鲜叶是形成茶叶品质的物质基础， 茶鲜叶质量的高低和制茶技术的是否合理共同决定了成 品茶得质量。
茶鲜叶中的主要营养成分之一是儿茶素类， 儿茶素又称茶单宁， 和咖啡因同属茶 叶中的两大重要机能性成分， 但是又以儿茶素为茶汤中最主要的成分。儿茶素类属于多元 酚类中的一种， 又称黄烷醇类， 是茶叶中最主要的多元酚类成分， 约占茶中多元酚类成分总 含量的 75~80%。占茶青的 12~26% 儿茶素对人类健康有着积极的作用， 儿茶素包括酯型儿茶素和简单儿茶素， 其主要 成分有： EGCG(epigallocatechin gallate)， EGC(epigallocatechin)， ECG(epicatechin gallate)， EC(epicatechin) 和 catchin。酯型儿茶素是茶鲜叶茶多酚中主要的活性和水溶 性成份， 是儿茶素中含量最高的组分， 占儿茶素的 70% 左右， 其中有两个主要的成分 ： L- 表 型没食子酸儿茶素没食子酸酯 （L-EGCG） 和 L- 表型儿茶素没食子酸酯 （L-ECG） 。酯型儿茶 素是茶鲜叶中最有效的抗氧化多酚， 具有抗氧化、 抗癌、 抗突变等活性。抗氧化活性至少是 维生素 C 的 100 多倍， 是维生素 E 的 25 倍， 能够保护细胞和 DNA 受损害， 这种损害相信与癌 症、 心脏疾病和其他重大疾病有关， 酯型儿茶素的这些功效归结于他们对氧自由基的清除 ( 抗氧化 ) 能力。因此， 酯型儿茶素又被认定是儿茶素中活性最大的一种单体， 也是茶鲜叶 的主要活性成分。
儿茶素有溶剂萃取法、 离子沉淀法和吸附法等多种提取方法。在各种提取工艺过 程中， 溶剂热提取均为必要阶段， 但此工艺提取时间长， 温度高， 茶多酚尤其是儿茶素易于 氧化生成茶色素， 并进一步与体系中咖啡因、 蛋白质生成茶乳酪。
本发明提供一种提高茶鲜叶中酯型儿茶素提取效果的提取方法， 在乙酸乙酯搅拌 提取茶鲜叶酯型儿茶素的过程中， 加入液氮， 使茶鲜叶中酯型儿茶素的提取效果提高。
发明内容 本发明的目的在于提供茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法， 本发明能提高茶鲜叶中 酯型儿茶素的提取效果， 具体技术方案如下。
茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法， 包括如下步骤 ： （1）在 乙 酸 乙 酯 为 萃 取 溶 剂 的 条 件 下， 按 料 液 比 为 1:20-1:40g/mL 的 比 例 把 茶 鲜 叶和乙酸乙酯加入到搅拌器中， 再加入液氮， 使搅拌时温度维持在 0-10 ℃， 搅拌时间为 1-2.5min ； （2） 搅拌结束后用滤纸过滤， 得儿茶素提取液， 定容， 置于 2-10℃冷藏保存。
上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是， 步骤 （1） 之前
还包括采集茶鲜叶， 采集后置于 2-10℃冰箱冷藏备用。
上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是， 步骤 （1） 中， 所 述茶鲜叶为华南农业大学绿茶茶鲜叶， 茶鲜叶中水分质量含量为 67.57%， 干物质占总质量 的 32.43%。
上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是， 步骤 （1） 中， 料 液质量比为 1:35g/mL。
上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是， 步骤 （1） 中所 述搅拌时维持的温度为 5℃。
上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是， 步骤 （1） 中所 述搅拌时间为 2min。
上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是， 步骤 （1） 中， 所 述乙酸乙酯为分析纯乙酸乙酯。
上述的茶鲜叶中酯型儿茶素的提取方法进一步优化的技术方案是， 步骤 （1） 中所 述搅拌速度为 2000~4000 转 / 分。
所述液氮为广州市深华实验仪器设备有限公司的液氮。 本发明用酒石酸亚铁法进行比色法测定茶多酚含量的步骤是 ： 吸取试液 1mL， 注 入 25mL 的容量瓶中， 加蒸馏水 4mL 和酒石酸亚铁溶液 5mL（称取硫酸亚铁 (GB664)1.0g， 酒 石酸钾钠 (GB1288)5.0g， 加水溶解并定至 1L） ， 充分混合， 再加 pH7.5 磷酸盐缓冲液 （a 液 1/15mol/L 的磷酸氢二钠溶液 : 称取磷酸氢二钠 (GB1263)23.877g， 加水溶解并稀释至 1L。 b 液 l/15molL/ 的磷酸二氢钾溶液 : 称取经 110℃烘干 2h 的磷酸二氢钾 (GB1274)9.073g， 加水溶解至 IL。取 a 液 85ml 和 b 液 15mL 混匀， 即得 pH7.5 的缓冲液。 ） 至刻度， 用 lmm 比 色杯， 在波长 540nm 处， 以试剂空白溶液作参比， 测定吸光度 (A)。
茶多酚 (%)=(A×1.957×2)/1000×L1/(L2×M0×m)×100 公式 1 其中 ： L1—— 试液的总质量， mL ； L2—— 测定时的用液量， mL ； M0—— 试样的质量， g； m——试样干物质含量， %； A——试样的吸光度 本发明用 HPLC 快速测定儿茶素提取液酯型儿茶素含量的步骤是 ： 采用 Cl8 色谱柱， 紫 外检测器 （280nm） ， 流动相为水 ： 甲醇 ： 乙酸 =73:23:2， 流速 ： 1.0ml/min 的等度洗脱。进样 量： 20μL。吸取一定量的各儿茶素标准溶液， 混匀后， 得混合标准溶液， 再逐级稀释得到一 系列不同浓度的混合标准溶液。 依上述操作， 分别注人混合标准溶液， 利用外标法得出各儿 茶素标准品的标准曲线。 然后把儿茶素提取液过膜进样， 得出峰面积， 根据各儿茶素标准品 的标准曲线算出儿茶素提取液的酯型儿茶素含量。
与现有技术相比， 本发明具有以下优点 ： （1） 本方法采用液氮低温提取酯型儿茶素， 解决了高温提取是酯型儿茶素易被多酚氧 化酶和过氧化氢氧化的问题。
（2） 氮气作为惰性气体可以很好的隔绝空气中的氧气， 起到保鲜作用可减缓酯型 儿茶素的氧化反应。
本发明提取条件温和易于控制， 步骤简单， 所需设备少， 提取时间短， 易于操作， 成 本较低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的实施作进一步详细说明， 但本发明的实施不限于此。
实施例 1 ： 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 35 的比例把茶鲜叶和蒸馏水加入到不 锈钢搅拌器当中， 再加入液氮， 使搅拌温度维持在 5℃， 搅拌时间为 2min， 搅拌速度为 4000 转 / 分。
对比例 1 ： 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 35 的比例把茶鲜叶和蒸馏 水加入到不锈钢搅拌器当中， 不加入液氮， 搅拌时间为 2min， 搅拌速度为 4000 转 / 分。
分别对实施例 1 和对比例 1 所得的两种提取液过滤， 得儿茶素提取液， 用蒸馏水定 容。
分别用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例 1 和对比例 1 的儿茶素提取液的茶多 酚含量， 根据公式 1， 得出液氮提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为 20.75%。不加液 氮提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为 7.75%， 少了 13%。
分别用 HPLC 快速测定法测定实施例 1 和对比例 1 的儿茶素提取液的酯型儿茶素 含量， 得出液氮提取茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 9.83%。 不加液氮提取茶鲜 叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 5.75%， 少了 4.08%。
实施例 2 ： 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 35 的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不 锈钢搅拌器当中， 再加入液氮， 使搅拌温度维持在 5℃， 搅拌时间为 2min， 搅拌速度为 4000 转 / 分。
对比例 2 ： 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 35 的比例把茶鲜叶和蒸馏 水加入到不锈钢搅拌器当中， 加入液氮， 使搅拌温度维持在 5℃， 搅拌时间为 2min， 搅拌速 度为 4000 转 / 分。
分别对实施例 2 和对比例 2 所得的两种提取液过滤， 得儿茶素提取液并分别用蒸 馏水和乙酸乙酯定容。
分别用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例 2 和对比例 2 的儿茶素提取液的茶多 酚含量， 根据公式 1， 得出液氮蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为 20.75%。 液氮乙酸乙酯提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为 23.06%， 提高了 2.31%。
分别用 HPLC 快速测定法测定实施例 2 和对比例 2 的儿茶素提取液的酯型儿茶素 含量， 得出液氮蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 9.83%。 液氮乙酸乙 酯提取茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 10.96%， 提高了 1.13%。
实施例 3 ： 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 35 的比例把茶鲜叶和蒸馏水加入到不锈 钢搅拌器当中， 在加入液氮， 使搅拌温度维持在 5℃， 搅拌时间为 2min， 搅拌速度为 4000 转 / 分。
对比例 3 ： 称取新鲜茶鲜叶， 按照料液比 (W:V， g/mL)1 ： 35， 提取温度 80℃， 用蒸馏 水水浴提取， 提取时间为 20min。
分别对实施例 3 和对比例 3 所得的两种提取液过滤， 得儿茶素提取液并分别用蒸 馏水定容。分别用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例 3 和对比例 3 的儿茶素提取液的茶多 酚含量， 根据公式 1， 得出蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为 20.21%。液氮 蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的茶多酚含量为 20.75%， 提高了 0.54%。
分别用 HPLC 快速测定法测定实施例 3 和对比例 3 的儿茶素提取液的酯型儿茶素 含量， 得出蒸馏水提取茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 7.03%。 液氮蒸馏水提取 茶鲜叶的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 9.83%， 提高了 2.83%。
实施例 4 ： 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 40 的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不 锈钢搅拌器当中， 再加入液氮， 使搅拌温度维持在 5℃， 搅拌时间为 2min， 搅拌速度为 4000 转 / 分。
对实施例 4 所得的提取液过滤， 得儿茶素提取液， 用乙酸乙酯定容。
用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例 4 的儿茶素提取液的茶多酚含量， 根据公 式 1， 得出实施例 4 的儿茶素提取液的茶多酚含量为 21.23%。
用 HPLC 快速测定法测定实施例 4 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量， 得出实施例 4 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 9.23%。 实施例 5 ： 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 40 的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不 锈钢搅拌器当中， 加入液氮， 使搅拌温度维持在 5℃， 搅拌时间为 2min， 搅拌速度为 4000 转 / 分。
对实施例 5 所得的提取液过滤， 得儿茶素提取液， 用乙酸乙酯定容。
用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例 5 的儿茶素提取液的茶多酚含量， 根据公 式 1， 得出实施例 5 的儿茶素提取液的茶多酚含量为 19.23%。
用 HPLC 快速测定法测定实施例 5 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量， 得出实施例 5 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 8.92%。
实施例 6 ： 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 35 的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不 锈钢搅拌器当中， 再加入液氮， 使搅拌温度维持在 5℃， 搅拌时间为 1min， 搅拌速度为 4000 转 / 分。
对实施例 6 所得的提取液过滤， 得儿茶素提取液， 用乙酸乙酯定容。
用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例 6 的儿茶素提取液的茶多酚含量， 根据公 式 1， 得出实施例 6 的儿茶素提取液的茶多酚含量为 18.23%。
用 HPLC 快速测定法测定实施例 6 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量， 得出实施例 6 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 7.92%。
实施例 7 ： 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 35 的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到 不锈钢搅拌器当中， 再加入液氮， 使搅拌温度维持在 5℃， 搅拌时间为 2.5min， 搅拌速度为 4000 转 / 分。
对实施例 7 所得的提取液过滤， 得儿茶素提取液， 用乙酸乙酯定容。
用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例 7 的儿茶素提取液的茶多酚含量， 根据公
式 1， 得出实施例 7 的儿茶素提取液的茶多酚含量为 22.75%。
用 HPLC 快速测定法测定实施例 7 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量， 得出实施例 7 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 10.54%。
实施例 8 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 35 的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不 锈钢搅拌器当中， 加入液氮， 使搅拌温度维持在 10℃， 搅拌时间为 2min， 搅拌速度为 4000 转 / 分。
对实施例 8 所得的提取液过滤， 得儿茶素提取液， 用乙酸乙酯定容。
用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例 8 的儿茶素提取液的茶多酚含量， 根据公 式 1， 得出实施例 8 的儿茶素提取液的茶多酚含量为 22.34%。
用 HPLC 快速测定法测定实施例 8 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量， 得出实施例 8 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 10.12%。
实施例 9 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 35 的比例把茶鲜叶和乙酸乙酯加入到不 锈钢搅拌器当中， 再加入液氮， 使搅拌温度维持在 0℃， 搅拌时间为 2min， 搅拌速度为 4000 转 / 分。 对实施例 9 所得的提取液过滤， 得儿茶素提取液， 用乙酸乙酯定容。
用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例 9 的儿茶素提取液的茶多酚含量， 根据公 式 1， 得出实施例 8 的儿茶素提取液的茶多酚含量为 20.34%。
用 HPLC 快速测定法测定实施例 9 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量， 得出实施例 9 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 9.12%。
实施例 10 称取新鲜茶鲜叶， 按料液比 (W:V， g/mL) 为 1 ： 35 的比例把茶鲜叶和蒸馏水加入到不锈 钢搅拌器当中， 在加入液氮， 使搅拌温度维持在 5℃， 搅拌时间为 2min， 搅拌速度为 2000 转 / 分。
对实施例 10 所得的提取液过滤， 得儿茶素提取液， 用蒸馏水定容。
用酒石酸亚铁法进行比色法测定实施例 10 的儿茶素提取液的茶多酚含量， 根据 公式 1， 得出实施例 10 的儿茶素提取液的茶多酚含量为 15.75%。
用 HPLC 快速测定法测定实施例 10 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量， 得出实施 例 10 的儿茶素提取液的酯型儿茶素含量为 7.12%。
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