编码GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达GPC3嵌合抗原受体蛋白的T淋巴细胞.pdf

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1、10申请公布号CN104140974A43申请公布日20141112CN104140974A21申请号201310164725X22申请日20130508C12N15/62200601C12N15/63200601C12N15/867200601C12N7/01200601C12N5/10200601C07K19/00200601A61K35/14200601A61K48/00200601A61P35/0020060171申请人上海益杰生物技术有限公司地址200032上海市桂平路333号6号楼300室72发明人李宗海高慧萍蒋华石必枝王华茂李克桑王红阳杨胜利顾健人54发明名称编码GPC3嵌合抗原。

2、受体蛋白的核酸及表达GPC3嵌合抗原受体蛋白的T淋巴细胞57摘要编码表达于人T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体SCFVGPC3。51INTCL权利要求书1页说明书13页序列表47页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书13页序列表47页附图3页10申请公布号CN104140974ACN104140974A1/1页21编码表达于人T淋巴细胞表面的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外。

3、结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体SCFVGPC3。2权利要求1所述的核酸，其中跨膜区选自包含CD8或CD28的跨膜区和铰链区的序列。3权利要求1或2的核酸，其中胞内信号区选自CD3，FCRI，CD28，CD137，CD134的胞内信号区序列，及其组合。4权利要求3的核酸，其中所述嵌合抗原受体蛋白是选自包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区的如下顺序连接的嵌合抗原受体蛋白SCFVGPC3CD8CD3，SCFVGPC3CD8CD137CD3，SCFVGPC3CD28ACD28BCD3，SCFVGPC3CD28ACD28BCD137CD。

4、3，及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28A代表CD28分子的跨膜区，CD28B代表CD28分子的胞内信号区。5权利要求1的核酸，选自编码具有SEQIDNO2225之一序列的嵌合抗原受体蛋白的核酸。6权利要求1的核酸，具有SEQIDNO1821之一的序列。7包含权利要求16之一所述的核酸的载体。8权利要求7所述的载体，该载体来自慢病毒质粒PWPTEGFP，并具有如SEQIDNO2730之一的核酸序列。9包含权利要求7或8所述载体的病毒。10一种基因修饰的T淋巴细胞，其被转导有权利要求16之一的核酸或权利要求7或8所述的载体或权利要求9所述的病毒。11一种转基因T淋巴细胞，其表面表达一种嵌。

5、合抗原受体，所述嵌合抗原受体由SEQIDNO1821之一的核酸编码表达。12一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQIDN02225之一。权利要求书CN104140974A1/13页3编码GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达GPC3嵌合抗原受体蛋白的T淋巴细胞技术领域0001本发明涉及肿瘤细胞治疗领域，更具体地，涉及对特异性表达GPC3的上皮来源的肿瘤的转基因T淋巴细胞治疗领域。背景技术0002磷脂酰肌醇蛋白多糖3GLYPICAN3，GPC3，又称DGSX，GTR22，MXR7，OCI5，SDYS，SGB，SGBS或SGBS1是一种细胞表面蛋。

6、白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70KDA左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶FURIN剪切产生40KDA左右的可溶性的能够进入血液的氨基端N末端肽和30KDA左右含有2个硫酸乙酰肝素HS糖链的膜结合的羧基端C末端肽。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇GPI锚依附在细胞膜上。0003GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而GPC3的表达在肝腺癌，胆管细胞癌，肝转移癌和12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出。。

7、此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。考虑到GPC3在肝细胞肝癌，黑色素瘤等肿瘤中特异性的高表达，其被认为是肿瘤免疫治疗的一个候选靶标。0004利用抗GPC3抗体进行肝癌检测和利用抗GPC3抗体的抗体依赖的ADCC或补体依赖的CDC细胞毒性研究方案已有报道。一般用于治疗的抗体识别的是GPC3蛋白的C末端。然而，抗体治疗存在着抗体在体内血液循环中半衰期的限制，一般来说，半衰期大多在23天以内。因此，持续给药和/或增大给药剂量是肿瘤抗体治疗所要求的，这导致患者治疗成本的增加，以及某些情况下，甚至不得已终结治疗。另外，治疗性抗体作为异源蛋白，还有可能在体。

8、内产生过敏反应及针对该治疗性抗体的中和性抗抗体的风险。0005T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于T淋巴细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的上述缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意GRUPPSA，ETALADOPTIVECELLULARTHERAPYCURRTOPMICROBIOLIMMUNOL，2011；34414972。近年来，根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体TCELLRECEPTOR，TCR的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的SCFV与T淋巴细胞受体的CD3或FCRI等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原。

9、受体CHIMERICANTIGENRECEPTOR，CAR，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CART淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物MAJORHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEX，MHC非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。CART淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略SCHMITZM，ETALCHIMERICANTIGENRECEPTORENGINEEREDTCELLSFORIMMUNOTHERAPYOFCANCERJBIOMEDBIOTECHNOL，2010，DOI101155/2010/956304。说明书C。

10、N104140974A2/13页40006嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的SCFV，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序ITAMCD3或FCRI及共刺激信号分子CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。0007胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CART淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接SCFVTMITAM。该种CART可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应ZHANGTETALCHIMERICNKG2DMODIFIEDTCELLSINH。

11、IBITSYSTEMICTCELLLYMPHOMAGROWTHINAMANNERINVOLVINGMULTIPLECYTOKINESANDCYTOTOXICPATHWAYS，CANRES2007，67221102911036。0008随后发展的第二代CART淋巴细胞加入了CD28或CD137又名41BB的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接SCFVTMCD28ITAM或SCFVTM/CD137ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或41BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL2和IFN等细胞因子的水平，同时提高CART在体内的存活周期和抗。

12、肿瘤效果DOTTIGETALCD28COSTIMULATIONIMPROVESEXPANSIONANDPERSISTENCEOFCHIMERICANTIGENRECEPTORMODIFIEDTCELLSINLYMPHOMAPATIENTSJCLININVEST，2011，121518221826。0009近些年发展的第三代CART淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接SCFVTMCD28CD137ITAM或SCFVTMCD28CD134ITAM，进一步提高了CART在体内的存活周期和其抗肿瘤效果CARPENITOC，ETALCONTROLOFLARGEESTABLISHEDTUMORX。

13、ENOGRAFTSWITHGENETICALLYRETARGETEDHUMANTCELLSCONTAININGCD28ANDCD137DOMAINSPNAS，2009，106933603365。0010尽管CART淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但一些潜在的风险亦需要考虑。比如，由于某些/种正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CART淋巴细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。如，针对肾细胞癌患者肿瘤细胞上表达的抗原碳酸酐酶IXCAIX是第一个用于临床的CART淋巴细胞过继治疗的案例，也是第一个报道含CAR细胞的脱靶效应的案例。病人在多次输入CART淋巴细胞后出现24级肝毒性。。

14、分析原因为肝胆管上皮细胞低表达CAIX，原临床试验被迫中断同时排除了病人治疗效果的任何评价STOTERGETALTREATMENTOFMETASTATICRENALCELLCARCINOMAWITHAUTOLOGOUSTLYMPHOCYTESGENETICALLYRETARGETEDAGAINSTCARBONICANHYDRASEIXFIRSTCLINICALEXPERIENCEJCLINONCOL，2006，2413E20E22；NGOMC，ETALEXVIVOGENETRANSFERFORIMPROVEDADOPTIVEIMMUNOTHERAPYOFCANCERHUMANMOLECULAR。

15、GENETICS，2011，R1R7。另外，CAR中过多的共刺激信号会降低效应细胞激活所需的阈值，使得基因修饰的T淋巴细胞在低水平抗原或没有抗原触发的条件下也可能会被活化，导致大量细胞因子的释放以致可能引发所谓的“细胞因子风暴”。这种信号外漏SINGNALLEAKAGE会导致脱靶细胞毒性，从而产生非特异性的组织损伤。例如，在采用针对HER2的第三代CAR临床治疗一个具有肝和肺转移的晚期结肠癌患者的过程中由于正常肺组织中低表达HER2而引发所谓的“细胞因子风暴”致病人猝死MORGANRA，ETALREPORTOFASERIOUSADVERSEEVENTFOLLOWINGTHEADMINISTRA。

16、TIONOFT说明书CN104140974A3/13页5CELLSTRANSDUCEDWITHACHIMERICANTIGENRECEPTORRECOGNIZINGERBB2MOLECULARTHERAPY，2010，184843851。0011因此，本领域存在着对克服上述缺陷的编码GPC3嵌合抗原受体蛋白的淋巴细胞肿瘤治疗方案的强烈需求。发明内容0012本发明的第一方面涉及编码一种表达于T淋巴细胞表面的GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸，其表达的嵌合抗原受体蛋白使得表达该受体的T淋巴细胞针对高表达GPC3的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。所述GPC3嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区。

17、，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体SCFVGPC3。上述嵌合抗原受体蛋白的胞外结合区通过CD8铰链区与CD8或者CD28的跨膜区相连接，跨膜区后紧接胞内信号区。0013本发明的核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括CDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的编码嵌合抗原受体蛋白氨基酸序列的核酸密码子可以是简并的，即编码同一氨基酸序列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对应氨基酸的简并核酸密码子是本领域公知的。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发。

18、明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。0014本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50，较佳地至少70，更佳地至少80，最佳地至少90或至少95相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指1在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如02SSC，0。

19、1SDS，60；或2杂交时加有变性剂，如50V/V甲酰胺，01小牛血清/01FICOLL，42等；或3仅在两条序列之间的相同性至少在90以上，更好是95以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO2225之一所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。0015特异性识别人GPC3的C末端表位的单克隆抗体已被公开在例如，中国专利文献CN101186650A中外制药株式会社，此外据文献ADVANCESINLIVERCANCERANTIBODYTHERAPIESAFOCUSONGLYPICAN3ANDMESOTHELIN，BIODRUGS2011OCTOBER1；255275284。

20、其他已知特异性识别C末端表位的单克隆抗体包括GC33和HGC33也分别被报道，其针对GPC3的抗原决定簇位于C端524563位氨基酸残基，同时被报道的还包括GPC3C02和1G12等单克隆抗体。这些被公开的单克隆抗体可以用于制备本发明的核酸所编码的嵌合抗原受体蛋白中的单链抗体部分。其他识别GPC3的C末端表位的单克隆抗体也可以合适的方式运用于本发明。0016单链抗体SCFVGPC3可以根据上述公开的GPC3单克隆抗体的序列通过基因工程方法或化学合成方法制备。本发明中使用的术语“单链抗体SCFV片段”指的是通过如下说明书CN104140974A4/13页6定义的抗体片段，其是包含通过接头LINK。

21、ER连接的重链可变区VH和轻链可变区VL的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。SCFV的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。本发明使用的单链抗体可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，SAMBROOK，分子克隆实验手册，COLDSPRINGHARBORLABORATORY1989NY。所指的修饰优选在核酸水平上进行。上述单链抗体还可以包括其衍生物。。

22、本发明中“抗体的衍生物”包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如BIACORE系统中使用的表面等离子共振技术来增加与GPC3抗原表位结合的噬菌体抗体的效率SCHIER，人抗体杂交瘤71996，97105；MALMBORG，免疫学方法杂志1831995，713。还包括，例如WO89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，EPA10239400和WO90/07861中描述的人源化抗体产生的方法，WO91/10741，WO94/02602和WO96/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法所产生的抗体的衍生物。0017本发明的术语“特异性识别”的意思是本发明的双。

23、特异性抗体不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。0018嵌合抗原受体的跨膜区可以选自CD8或CD28等蛋白的跨膜区。CD8或CD28是T淋巴细胞表面的天然标记物。人CD8蛋白是个异二聚体，由或者两条链组成。在本发明的一个实施方案中，跨膜区选自CD8或者CD28的跨膜区。此外，CD8铰链区HINGE是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区被用于将嵌合抗。

24、原受体CAR的靶点识别结构域SCFV和胞内信号区连接起来。0019胞内信号区可以选自CD3，FCRI，CD28，CD137，CD134蛋白的胞内信号区，及其组合。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3亚单位又称CD3ZETA，简称Z含有3个ITAM基序，该基序是TCRCD3复合体中重要的信号转导区。CD3Z是截短的不具有ITAM基序的CD3序列，在本发明实践中一般作为阴性对照的构建。FCRI主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3类似。此外如前所述，CD28，CD137，CD134是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作。

25、用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL2和IFN等细胞因子的水平，同时提高CART淋巴细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。0020本发明的核酸所编码的GPC3嵌合抗原受体蛋白可以选自按如下方式顺序连接的嵌合抗原受体蛋白0021SCFVGPC3CD8CD3，0022SCFVGPC3CD8CD137CD3，0023SCFVGPC3CD28ACD28BCD3，0024SCFVGPC3CD28ACD28BCD137CD3，0025及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28A代表CD28分子的跨膜区，CD28B代说明书CN104140974A5/13页7表CD28分子的胞内信号区。上述。

26、各种抗GPC3嵌合抗原受体统称为SCFVGPC3CAR。0026在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸具有如SEQIDNO1821所述的序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的核酸是编码具有如SEQIDNO2225之一的嵌合抗原受体蛋白的核酸。0027本发明的第二方面包括包含上述编码表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸的载体。在一个具体实施方案中，本发明使用的载体是一种慢病毒质粒载体PPWTEGFP。该质粒属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白GAG/POL、编码REV蛋白的包装质粒PSPAX2；编码VSVG蛋白的包膜质粒PMD2G；及空载体PPWTEGFP，其。

27、可以用于重组引入目的核酸序列，即编码CAR的核酸序列。空载体PPWTEGFP其本身为后续试验中的MOCK中由延长因子1ELONGATIONFACTOR1，EF1启动子调控增强型绿色荧光蛋白ENHANCEDGREENFLUORESCENTPROTEIN，EGFP的表达。而包含编码CAR的目的核酸序列的重组表达载体PWPTEGFPF2ACAR是通过由来自口蹄疫病毒FOODANDMOUTHDISEASEVIRUS，FMDV的核糖体跳跃序列RIBOSOMALSKIPPINGSEQUENCE2A简称F2A实现EGFP与CAR的共表达的。在一个具体实施方案中，本发明的载体具有如SEQIDNO2730之一的。

28、核酸序列。0028本发明的第三方面包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其他转导T淋巴细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。0029在本发明的一个实施方案中，所述病毒是包含上述PWPTEGFPF2ACAR重组载体即含有SCFVGPC3CAR的慢病毒。0030本发明的第四方面包括一种转基因T淋巴细胞，其被转导有本发明的核酸或被转导有本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔。

29、法和转座子法。近期AMAXA公司研发的NUCLEOFECTOR核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子SLEEPINGBEAUTYSYSTEM或PIGGYBAC转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高，将NUCLEOFECTOR转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道DAVIESJK，ETALCOMBININGCD19REDIRECTIONANDALLOANERGIZATIONTOGENERATETUMORSPECIFICHUMANTCELLSFORALLOGENEICCELLTHERAPYOFBCELLMALIGNANCIESCANCERR。

30、ES，2010，7010OF110，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因T淋巴细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本发明的表面表达嵌合抗原受体的转基因T淋巴细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果亦称细胞毒性。因此本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上。

31、述核酸，质粒或病毒的转基因T淋巴细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。0031在一个实施方案中，本发明的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌说明书CN104140974A6/13页8合抗原受体由SEQIDNO1821之一的核酸编码表达。在另一个实施方案中，本发明的转基因T淋巴细胞表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQIDNO2225之一。附图说明0032图1显示的是作为示例的本发明的包含编码CAR序列的慢病毒载体PWPTEGFPF2ACAR的结构示意图。0033图2显示的是作为示例的包含在慢病毒载体中的本发明的CAR的不同区之间连接关系的示意图，其中由核糖体跳跃。

32、序列F2A连接的EGFP和SVFVGPC3特异性嵌合抗原受体。0034图3显示的是MLUI和SALI双酶切鉴定实施例1的慢病毒质粒的核酸电泳图。其中M1是DS2000分子量标记物广州东盛生物科技有限公司；M2是HINDIII标记物广州东盛生物科技有限公司。泳道15分别是00351PWPTEGFPF2AGPC3Z；00362PWPTEGFPF2AGPC3Z；00373PWPTEGFPF2AGPC3BBZ；00384PWPTEGFPF2AGPC328Z；00395PWPTEGFPF2AGPC328BBZ。0040图4显示的是本发明实施例2的病毒感染CTL细胞毒性T淋巴细胞后细胞表达的EGFP的流式。

33、细胞技术检测结果。0041图5显示的是本发明实施例2的表达不同嵌合抗原受体CAR的CTL细胞的体外生长情况。图中显示在病毒感染后第9天，表达不同嵌合抗原受体的CTL细胞体外扩增2040倍。具体实施方式0042下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能理解为用于限制本发明的范围。下面实施例中如未注明具体条件的实验方法，则按照常规条件如SAMBROOK等，“分子克隆实验手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，1989”中所述的条件，而在实施例中明确说明有试剂公司说明书时，则按照说明书所建议的条件进行。0043实施例1表达。

34、本发明核酸编码的嵌合抗原受体蛋白的慢病毒质粒的构建及病毒包装0044下表1解释了本发明示例的嵌合抗原受体各部分的连接顺序，该连接还可参见图2中所示。表10045嵌合抗原受体胞外结合区跨膜区胞内信号区1胞内信号区2ETC描述GPC3ZSCFVGPC3CD8CD3ZETA阴性对照GPC3ZSCFVGPC3CD8CD3ZETA第一代GPC3BBZSCFVGPC3CD8CD137CD3ZETA第二代GPC328ZSCFVGPC3CD28ACD28BCD3ZETA第二代说明书CN104140974A7/13页9GPC328BBZSCFVGPC3CD28ACD28BCD137CD3ZETA第三代00461。

35、核酸片段的扩增00471SCFVGPC3序列的扩增0048SCFVGPC3序列的扩增以本实验室构建的单链双功能抗体核苷酸GPC3/CD3为模板，模板的序列参见中国专利申请201210480326X中的SEQIDNO9。扩增所采用的引物对为上游引物5GATGTTGTGATGACTCAGTCTC3SEQIDNO1和下游引物5GCGCTGGCGTCGTGGTTGAGGAGACGGTGACCAG3SEQIDNO2用于扩增SCFVGPC3；目的扩增条带大小均为746BP。PCR扩增条件为预变性94，4MIN；变性94，40S；退火58，40S；延伸68，40S；进行25个循环，然后总延伸68，10MIN。

36、。PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。00492嵌合抗原受体其他部分的核酸序列0050GPC3嵌合抗原受体蛋白的除SCFVGPC3外其他部分的核酸序列分别以专利申请号为2013101085322中公开的序列SEQIDNO14为模板通过PCR方式获得。具体地，其中如下各种GPC3嵌合抗原受体蛋白除SCFVGPC3外的CAR部分，其中CD8CD3Z和CD28ACD28BCD137CD328BBZ，分别以SCFVEFGRCD8CD3专利申请2013101085322中SEQIDNO1和SCFVEFGRCD28ACD28BCD137CD3专利申请2013101085322中SEQI。

37、DNO2为模板，采用上游引物5ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCAC3SEQIDNO3和下游引物5GAGGTCGACCTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTGAAG3SEQIDNO4扩增，PCR扩增条件为预变性94，4MIN；变性94，40S；退火60，40S；延伸68，40S；进行25个循环，然后总延伸68，10MIN。目的条带分别为549BP和816BP，PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。0051另外，CD8CD3DELTADELTAZ，CD8CD137CD3BBZ和CD28ACD28BCD328Z分别通过如下方式获得0052A加1MLTRIZ。

38、OLINVITROGEN公司于1107健康人外周血单个核细胞上海市血液中心提供中裂解细胞后，采用酚氯仿法抽提总RNA，采用IMPROMIITM逆转录试剂盒PROMAGA公司逆转录制备CDNA。以上述制备的CDNA为模板，分别0053I以上游引物5GTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCG3SEQIDNO5和下游引物5GGTGATAACCAGTGACAGGAG3SEQIDNO6扩增获得CD8铰链区跨膜区，PCR扩增条件为预变性94，4MIN；变性94，30S；退火58，30S；延伸68，30S；进行25个循环，然后总延伸68，10MIN。条带理论大小为198BP，扩增产物经琼脂。

39、糖电泳确认与理论大小一致。0054II以上游引物5GTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCG3SEQIDNO5和下游引物5GAGGTCGACCTACGCGGGGGCGTCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTGGTGATAACCAGTG3SEQIDNO7扩增获得CD8铰链区跨膜区DELTAZ即CD8CD3DELTA，PCR扩增条件同上。条带理论大小为261BP，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。0055III以上游引物5TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG3SEQIDNO8和下游引物5GCTGAACTTCACTCTGGAGCGATAGGCTGCGAA。

40、G3SEQIDNO9扩增获得CD28跨膜区胞内信号区片段，PCR扩增条件同上，条带理论大小为219BP，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。说明书CN104140974A8/13页100056IIII以上游引物5AAACGGGGCAGAAAGAAACTC3SEQIDNO10和下游引物5CAGTTCACATCCTCCTTC3SEQIDNO11扩增获得CD137胞内区，PCR扩增条件同上，条带理论大小为126BP，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。0057IIIII以上游引物5CACTGGTTATCACCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGC3SEQIDNO12和下游引物5GAGGT。

41、CGACCTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATG3SEQIDNO13扩增获得CD3ZETA信号区，PCR扩增条件同上，条带理论大小为339BP，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。0058B核酸片段的拼接0059I以上游引物5ACCACGACGCCAGCGCCG3SEQIDNO14和下游引物5CACCCAGAAAATAATAAAG3SEQIDNO15拼接获得CD8铰链区CD28跨膜区，拼接条件CD8铰链区50NGCD28跨膜区50NG预变性94，4MIN；变性94，30S；退火60，30S；延伸68，30S，进行5个循环，然后总延伸68，10MIN，补充DNA聚合酶及上下游引物后。

42、PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性94，4MIN；变性94，30S；退火60，30S；延伸68，30S，进行25个循环，然后总延伸68，10MIN。理论大小为216BP。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。0060II以上游引物5AAACGGGGCAGAAAGAAACTC3SEQIDNO10和下游引物5GAGGTCGACCTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATG3SEQIDNO13拼接扩增获得CD137CD3，即为BBZ，拼接和PCR扩增条件同上。条带理论大小为478BP，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。0061III以上游引物5GTCACCGTCTCCTCAACCAC。

43、GACGCCAGCG3SEQIDNO5和下游引物5GAGGTCGACCTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATG3SEQIDNO13将CD8铰链区跨膜区与BBZ拼接及PCR获得目的片段CD8铰链区跨膜区BBZ胞内区，即CD8CD137CD3，拼接和PCR扩增条件同上。理论大小为691BP。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。0062IIII以上游引物5GTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCG3SEQIDNO5和下游引物5GAGGTCGACCTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATG3SEQIDNO13将CD8铰链区CD28跨膜区胞内区与Z采用同上的拼接和PC。

44、R扩增获得目的片段CD8铰链区CD28跨膜区28Z胞内区，即CD28ACD28BCD3，拼接和PCR扩增条件同上。条带理论大小为706BP，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。006333端带有F2A及CD8信号肽的EGFP核酸片段的获得0064以上游引物5CTTACGCGTCCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3SEQIDNO16和下游引物5CGGCCTGGCGGCGTGGAGCAG3SEQIDNO17扩增慢病毒载体中3端带有F2A及CD8信号肽的EGFP核酸片段，以专利申请2013101085322中公开的PWPTEGFPF2A806Z为。

45、模板，PCR扩增条件为预变性94，4MIN；变性94，40S；退火56，40S；延伸68，50S，进行25个循环，然后总延伸68，10MIN，理论大小为883BP，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。00652核酸片段的拼接0066分别将如前述段落“2嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段CD8CD3，CD8CD137CD3，CD28ACD28BCD3，CD28ACD28BCD137CD3与等摩尔的说明书CN104140974A109/13页11前述段落“3嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的3端带有F2A及CD8信号肽的EGFP核酸片段质量约为50NG及等摩尔的SCFV。

46、GPC3质量约为50NG三片段按图2所示模式拼接并PCR，拼接条件为预变性94，4MIN；变性94，40S；退火60，40S；延伸68，140S，进行5个循环，然后总延伸68，10MIN，补充DNA聚合酶及上游引物5CTTACGCGTCCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3SEQIDNO16和下游引物5GAGGTCGACCTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATG3SEQIDNO13后PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性94，4MIN；变性94，40S；退火60，40S；延伸68，140S，进行25个循环，然后总延伸68，10MIN。扩增。

47、获得EGFPGPC3Z、EGFPGPC3BBZ、EGFPGPC328Z及EGFPGPC328BBZ理论大小分别为2161BP，2278BP，2302BP和2428BP。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。0067在与同上相同的实验条件下，采用上游引物5GATGTTGTGATGACTCAGTCTC3SEQIDNO1和下游引物5GAGGTCGACCTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATG3SEQIDNO13，在不添加3端带有F2A及CD8信号肽的EGFP核酸片段质量约为50NG，可以获得编码GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸GPC3ZSEQIDNO18、GPC3BBZSEQIDNO19、G。

48、PC328ZSEQIDNO20及GPC328BBZSEQIDNO21序列，上述各核酸序列分别编码具有如下氨基酸序列的GPC3嵌合抗原受体蛋白，GPC3ZSEQIDNO22、GPC3BBZSEQIDNO23、GPC328ZSEQIDNO24及GPC328BBZSEQIDNO25。0068此外，分别将如前述段落“2嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段CD8CD3DELTA片段与等摩尔的前述段落“3嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段及等摩尔的SCFVGPC3采用上游引物5CTTACGCGTCCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG。

49、3SEQIDNO16和下游引物5GAGGTCGACCTACGCGGGGGCGTCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTGGTGATAACCAGTG3SEQIDNO7同上条件进行拼接并PCR，扩增获得EGFPGPC3ZSEQIDNO31，理论大小为1858BP，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一。00693慢病毒质粒载体的构建0070作为示例的构建本发明的慢病毒质粒载体使用的载体系统属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白GAG/POL、编码REV蛋白的包装质粒PSPAX2；编码VSVG蛋白的包膜质粒PMD2G及基于空载体PPWTEGFP的编码目的基因CAR的重组表达载体。0071在空载体PPWTEGFP中，延长因子1ELONGATIONFACTOR1，EF1的启动子调控增强型绿色荧光蛋白ENHANCEDGREENFLUORESCENTPROTEIN，EGFP的表达，而在编。