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1、10申请公布号CN104178496A43申请公布日20141203CN104178496A21申请号201310200002022申请日20130527C12N15/29200601C12N15/52200601C12N15/63200601C12N15/74200601C12N15/82200601A01H5/00200601C12R1/0120060171申请人南开大学地址300071天津市南开区卫津路94号72发明人李明刚郝军凤乔坤艳马超马百成王宇李宠张耀方马志华姬艳丽董震屠培培李晓丹54发明名称植物低磷应答调控单元及表达载体构建技术57摘要本发明描述了一种植物低磷应答调控单元PSSP。
2、HR135SSIZ1表达载体PX6PHR135SSIZ1的构建技术。该表达载体的构建方法是，从拟南芥中克隆得到SIZ1基因，将35S启动子插入到SIZ1基因的上游，构建35SSIZ1表达单元，将该表达单元插入植物表达载体PX6，构建载体PX635SSIZ1，再将PHR1基因插入该载体中，得到表达载体PX6PHR135SSIZ1。用表达载体PX6PHR135SSIZ1转化农杆菌GV3101，得到同时含有PHR1基因和SIZ1基因的工程农杆菌菌株NK314。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表4页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表4页附图。
3、3页10申请公布号CN104178496ACN104178496A1/1页21一种羽扇豆中编码转录因子的基因PHR1，其特征在于，能够编码调节植物磷饥饿应答的转录因子，该基因总长1230BP，编码409个氨基酸。2一种拟南芥中编码类泛素化SUMOE3连接酶的基因SIZ1，其特征在于，能够SUMO化PHR1，提高PHR1的活性，从而更进一步提高PHR1对磷饥饿应答因子的调节作用，该基因总长2658BP，编码885个氨基酸。3一种低磷应答调控单元表达载体，其特征在于该表达载体包含SIZ1基因和PHR1基因，具体是指抗生素选择标记删除型植物表达载体PX6PHR135SSIZ1。4一种工程农杆菌菌株，。
4、其特征在于，是将植物表达载体PX6PHR135SSIZ1转化农杆菌GV3101所获得的工程农杆菌菌株NK314。5一种含有植物表达载体PX6PHR135SSIZ1的工程农杆菌的构建方法，其特征在于，通过PCR扩增和酶切连接的方法获得SIZ1基因和PHR1基因，将其依次克隆到PX6质粒中构建植物表达载体PX6PHR135SSIZ1，并转化农杆菌GV3101。6一种如权利要求4所述工程农杆菌菌株的用途，其特征在于，用其转化不同植物可获得能高效利用土壤中磷元素的转基因植物。权利要求书CN104178496A1/4页3植物低磷应答调控单元及表达载体构建技术技术领域0001本发明涉及一种植物低磷应答调控。
5、单元及表达载体构建技术，属生物技术领域。背景技术0002磷元素是植物生长发育不可或缺的营养元素之一，它不仅是生物体内ATP、核酸、磷脂分子的组成成分，而且在能量转换和新陈代谢调节等方面发挥着十分关键的作用。但是，磷主要以H2PO4和HPO42可溶的形式被植物吸收，这部分磷元素被称为“有效磷”。在土壤中，虽然磷元素含量较高，但大部分磷元素被CA2、FE2、AL3固定或以有机态磷形式存在，无法被植物直接吸收利用，从而造成土壤速效磷匮乏SMITHFW，MUDGESR，RAEAL，ETALPHOSPHATETRANSPORTINPLANTSPLANTANDSOIL，2003，248127183。000。
6、3PHR1是一类保守的MYB类转录因子，可以结合到一些磷饥饿应答基因如ATIPS1，ATRNS1的启动子上促进这些基因的表达，在植物低磷适应调节中发挥中心作用。FRANCOZORRILLA等研究发现，在拟南芥中，PHR1可以通过与磷转运蛋白PHT1家族基因启动子上的PIBS相互作用，调节其表达，进而调节植物对磷的吸收和转运能力。SCHUNMANN等分析了大麦磷转运蛋白PHT11启动子序列，发现其中的PIBS序列发生突变后，低磷胁迫对PHT11的诱导作用明显减弱，这表明PHR1在PHT11的诱导表达中起着重要的作用。BARI等发现在拟南芥PHR1突变体中，MIRNA399的表达在低磷环境下受到明。
7、显的抑制，揭示了PHR1、MIRNA399和PHO2/UBC之间存在着相互关系。综上所述，PHR1可以通过直接或间接的作用调控一些磷转运蛋白和磷饥饿应答基因的表达，以促进植物对磷的吸收利用SCHUNMANNPHD，RICHARDSONAE，VICKERSCE，ETALPROMOTERANALYSISOFTHEBARLEYPHT1；1PHOSPHATETRANSPORTERGENEIDENTIFIESREGIONSCONTROLLINGROOTEXPRESSIONANDRESPONSIVENESSTOPHOSPHATEDEPRIVATIONPLANTPHYSIOLOGY，2004，1364420。
8、54214；BARIR，PANTBD，STITTM，ETALPHO2，MICRORNA399，ANDPHR1DEFINEAPHOSPHATESIGNALINGPATHWAYINPLANTSPLANTPHYSIOLOGY，2006，1413988999。0004近年来的研究表明，SIZ1对植物的低磷适应也具有重要的调节作用。在磷饥饿的情况下，SIZ1可以使PHR1SUMO化来提高PHR1的活性，更进一步提高植物对磷的利用效率。研究发现，PHR1有两个类泛素化修饰位点，有研究者在体外将T7PHR1与酵母的SCAOS1E1、SCUB2E1、SCUBC9E2、SCSMTSUMO和拟南芥的SIZ1E3组。
9、成的混合物进行反应，然后利用抗T7的抗体检测到PHR1被SUMO化修饰，但类泛素化位点突变的PHR1被检测到无SUMO化修饰，表明PHR1可以直接被SIZI识别和修饰，在植物的磷调控网络中，SIZ1位于PHR1的上游，通过调节PHR1的活性来调节下游与磷饥饿应答有关的基因的表达。DUAN等研究证明，在拟南芥SIZ1突变体中，PHR1的下游基因SPX1、SPX2的表达都明显下降DUANK，YIKK，DANGL，ETALCHARACTERIZATIONOFASUBFAMILYOFARABIDOPSISGENESWITHTHESPXDOMAINREVEALSTHEIRDIVERSEFUNCTIONS。
10、INPLANTTOLERANCETOPHOSPHORUSSTARVATIONPLANTJOUMAL，2008，546965975。0005鉴于SIZ1和PHR1对植物低磷应答的调节作用以及它们之间的相互作用，本发明说明书CN104178496A2/4页4通过将PHR1基因和SIZ1基因串联构建成一个独立的调控单元插入表达载体中并转化植物，实现其在植物体内的表达，提高植物体内PHR1的含量并通过SIZ1提高PHR1的活性，从而提高植物对磷的利用效率。经文献检索，目前尚未发现将PHR1基因和SIZ1基因作为独立调控单元构建于同一载体转化植物以提高植物磷吸收利用效率的文献和专利报道。发明内容0006。
11、本发明的目的是00071克隆拟南芥中的SUMO化E3连接酶SIZ1基因。00082构建含有PHR1基因和SIZ1基因的低磷应答调控单元表达载体。00093构建一种含有低磷应答调控单元的植物表达载体和携带该载体的农杆菌。0010本发明的目的是通过以下技术方案实现的0011首先，本发明从拟南芥中克隆得到SUMO化E3连接酶基因SIZ1。0012本发明提供的SIZ1基因的编码序列总长2658BP，编码885个氨基酸，其编码的蛋白质结构由三个结构域组成，分别是N端的PINIT结构域，中部含有锌离子的SPRING结构域和C端的SPCTD结构域。0013SIZ1基因的克隆过程0014根据ATSIZ1基因序。
12、列设计上下游引物，提取拟南芥总RNA，运用RTPCR的方法克隆得到预期片段，插入克隆载体PMD19TSIMPLEVECTOR中构建载体PMD19TSIZ1，测序正确。0015其次，本发明提供了一个低磷应答调控单元表达载体，该表达载体包含一个SUMO化E3连接酶基因SIZ1和一个保守的MYB类转录因子基因PHR1。0016在本发明提供的低磷应答调控单元表达载体中，所述的PHR1基因编码的转录因子PHR1在低磷胁迫调节中发挥着中心调节的作用，可以通过多种途径增强植物对磷的转运和吸收；所述的SIZ1基因编码的蛋白SIZ1能够SUMO化PHR1，提高PHR1的活性。因此，该低磷应答调控单元可以更进一步。
13、的提高植物对磷的吸收利用效率。0017低磷应答调控单元表达载体构建过程0018运用PCR的方法克隆得到35S启动子并插入克隆载体PMD19TSIMPLEVECTOR中，构建载体PMD19T35S，通过酶切将35S启动子插入PMD19TSIZ1载体中，构建克隆载体PMD19T35SSIZ1。再将克隆载体PMD1935SSIZ1中的35SSIZ1片段用SPEI单酶切回收后插入植物表达载体PX6中，构建植物表达载体PX635SSIZ1，PCR和酶切鉴定其插入正反向；最后，将植物表达载体PX6PHR1载体中的PHR1基因用ASCI单酶切回收后插入植物表达载体PX635SSIZ1中，构建植物表达载体PX。
14、6PHR135SSIZ1，PCR和酶切鉴定其插入正反向，构建得到低磷应答调控单元表达载体PX6PHR135SSIZ1。0019第三方面，本发明提供了一种农杆菌工程菌株NK314，该菌株是用植物低磷应答调控单元表达载体PX6PHR135SSIZ1转化农杆菌GV3101后获得的工程菌株。0020本发明的有益效果0021构建的植物低磷应答调控单元表达载体PX6PHR135SSIZ1能够在植物体内过表达SIZ1和PHR1，提高植物体内PHR1的含量并通过SIZ1提高PHR1的活性，从而提高植物对磷的利用效率，可以减少磷肥的使用，降低资源的浪费和环境污染，具有很大的应用价说明书CN104178496A3。
15、/4页5值。附图说明0022图1低磷应答调控单元植物表达载体PX6PHR135SSIZ1的构建流程。0023图2SIZ1基因的PCR产物电泳结果。泳道M1KBDNALADDER；泳道1、2PCR产物；泳道3阴性对照。0024图335S启动子PCR扩增产物的电泳结果。泳道1、2PCR扩增产物；泳道M200BPDNALADDER。0025图4载体PMD19T35SSIZ1的鉴定结果。A35S启动子PCR产物电泳结果。泳道M200BPDNALADDER；泳道15PCR产物；泳道6阳性对照；泳道7阴性对照。BSPEI单酶切产物电泳结果。泳道M1KBDNALADDER；泳道1酶切产物；泳道2质粒对照。0。
16、026图5载体PMD19T35SSIZ1中35S启动子插入正反向的鉴定结果。ANCOI和SPEI双酶切电泳结果。泳道M200BPDNALADDER；泳道1、3酶切产物；泳道2、4质粒对照。B35S插入正反向的PCR产物电泳结果35S上游引物和SIZ1基因下游引物。泳道M1KBDNALADDER；泳道1PCR产物。0027图6PX635SSIZ1重组子的鉴定结果。泳道M200BPDNALADDER；泳道16PCR产物；泳道7阴性对照；泳道8阳性对照。0028图7PX635SSIZ1中35SSIZ1片段插入正反向的鉴定结果ASCI和NCOI双酶切。泳道M200BPDNALADDER；泳道1、3、5。
17、、7双酶切产物；泳道2、4、6、8质粒对照。0029图8PX6PHR135SSIZ1重组子的鉴定结果。APCR鉴定电泳检测结果。泳道M1KBDNALADDER；泳道1阳性对照；泳道2阴性对照；泳道36PCR产物。BASCI酶切鉴定电泳检测结果。泳道M1KBDNALADDER；泳道1、3、5、8酶切产物；泳道2、3、6、7质粒对照。0030图9载体PX6PHR135SSIZ1中PHR1基因插入正反向的鉴定结果。泳道M1KBDNALADDER；泳道14PCR产物；泳道5阴性对照。0031图10PX6PHR135SSIZ1转化农杆菌GV3101的PCR鉴定结果。泳道M1KBDNALADDER；泳道1。
18、、2PCR产物。具体实施方式0032实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆手册中所述的条件，或按照具体制造厂商所建议的条件。0033实施例10034拟南芥SIZ1基因的克隆。包括如下步骤00351用TRIZOL试剂法提取拟南芥总RNA，反转录得到其CDNA。00362以CDNA为模板PCR克隆得到SIZ1基因图2，将其克隆到PMD19TSIMPLEVECTOR，构建载体PMD19TSIZ1进行测序，测序正确。PCR所用引物是根据拟南芥ATSIZ1基因序列设计的0037P15GAATTCATGGATTTGGAAGCTA。
19、ATTGTAAGGAAAAAC3说明书CN104178496A4/4页60038P25ACTAGTCAAATCTTGTTTAAACTCCGGTGTCT30039上游引物P1添加ECORI酶切位点，下游引物P2添加SPEI酶切位点，均用下划线表示。0040实施例20041一种低磷应答调控单元表达植物载体的构建。包括如下步骤00421PMD19T35S载体的构建。0043将35S启动子图3克隆到PMD19TSIMPLEVECTOR中，构建载体PMD19T35S。所用的PCR引物是根据35S启动子的DNA序列设计的0044P35GAATTCACTAGTCCCACAGATGGTTAG30045P45G。
20、AATTCCGTGTTCTCTCCAAATGAAAT30046上游引物P3添加ECORI和SPEI酶切位点，下游引物P4添加ECORI酶切位点，均用下划线表示。00472PMD19T35SSIZ1载体的构建。0048以PMD19TSIZ1为基本载体，将35S启动子从载体PMD19T35S中用ECORI单酶切后回收，插入载体PMD19TSIZ1中，进行PCR和酶切鉴定图4及其插入正反向的鉴定图5，构建载体PMD19T35SSIZ1。00493PX635SSIZ1载体的构建。0050用SPEI单酶切载体PMD19T35SSIZ1得到35SSIZ1片段，将35SSIZ1片段插入植物表达载体PX6中，。
21、进行PCR鉴定图6及其插入正反向的鉴定图7，构建植物表达载体PX635SSIZ1。00514PX6PHR135SSIZ1载体的构建。0052用ASCI单酶切得到PHR1基因，将PHR1基因插入植物表达载体PX635SSIZ1中，进行PCR和酶切鉴定图8及其插入正反向的鉴定图9，构建植物表达载体PX6PHR135SSIZ1。即为本发明所述的低磷应答调控单元表达载体。0053将上述表达载体PX6PHR135SSIZ1转化农杆菌GV3101，构建同时含有SIZ1基因和PHR1基因的工程菌株NK314。从工程农杆菌中提取质粒进行PCR鉴定图10。说明书CN104178496A1/4页70001序列表CN104178496A2/4页800020003序列表CN104178496A3/4页90004序列表CN104178496A4/4页10序列表CN104178496A101/3页11图1图2图3图4说明书附图CN104178496A112/3页12图5图6图7图8说明书附图CN104178496A123/3页13图9图10说明书附图CN104178496A13。