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1、10申请公布号CN104177499A43申请公布日20141203CN104177499A21申请号201310200787122申请日20130527C07K19/00200601C12N15/62200601C12N15/63200601C12N5/10200601A61K35/14200601A61P35/00200601A61P31/20200601A61P1/16200601A61P31/0020060171申请人张鸿声地址200433上海市杨浦区大学路243号903室72发明人张鸿声74专利代理机构深圳市君胜知识产权代理事务所44268代理人王永文杨宏54发明名称一种嵌合抗原受体。
2、、编码基因、表达载体及其应用57摘要本发明公开一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体包括依次串联的单链可变区片段、用于连接单链可变区片段到细胞膜上的CD8跨膜区、CD3胞内信号区，第一共刺激分子配体和第二共刺激分子配体；所述CD3胞内信号区与所述第一共刺激分子配体之间串联有2A短肽，所述第一共刺激分子配体与所述第二共刺激分子配体之间串联有2A短肽。本发明所提供的嵌合抗原受体通过采用2A短肽将嵌合抗原受体与两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。51IN。
3、TCL权利要求书1页说明书5页序列表4页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表4页附图2页10申请公布号CN104177499ACN104177499A1/1页21一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次串联的单链可变区片段、CD8跨膜区、CD3胞内信号区，第一共刺激分子配体和第二共刺激分子配体；所述CD3胞内信号区与所述第一共刺激分子配体之间串联有第一2A短肽，所述第一共刺激分子配体与所述第二共刺激分子配体之间串联有第二2A短肽。2根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一和第二共刺激分子配体分别为TNF类配体、IG超。
4、家族分子或者细胞因子中的一种；所述TNF类配体包括41BBL、OX40L、CD70、LIGHT和CD30L；所述IG超家族分子为CD80和CD86；所述细胞因子包括IL2、IL3、IL6、IL7、IL11、IL12、IL15、IL21或GMCSF。3根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，第一共刺激分子配体为CD80，第二共刺激分子配体为41BBL。4根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一2A短肽的氨基酸序列为EGRGSLLTCGDVEENPGP；第二2A短肽的氨基酸序列为APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP。5一种编码基因，其特征在于，所述编码基因用于表达如。
5、权利要求1所述的嵌合抗原受体。6根据权利要求5所述的编码基因，其特征在于，用于编码第一2A短肽的核苷酸序列如SEQNO7所示；用于编码第二2A短肽的核苷酸序列如SEQNO8所示。7一种如权利要求5所述编码基因的应用，其特征在于，将所述编码基因用于修饰免疫细胞。8一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中装载有如权利要求5所述的编码基因。9根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒。权利要求书CN104177499A1/5页3一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体、编码基。
6、因、表达载体及其应用。背景技术0002嵌合抗原受体CHIMERICANTIGENRECEPTOR，CAR由单克隆抗体的单链可变区片段SINGLECHAINVARIABLEFRAGMENT,SCFV和T细胞的信号区连接组成。嵌合抗原受体根据胞内的信号区数量可分为三代。第一代嵌合抗原受体胞内部分只含有一个CD3胞内信号区，因此，所修饰的免疫细胞不能有效激活而且作用时间较短。第二代嵌合抗原受体在CD3胞内信号区前增加了一个共刺激分子受体信号区，如CD28、41BB、OX40等，虽然临床表现比第一代嵌合抗原受体无论杀伤活性还是作用时间都有显著的改进，但仍不能满足临床的需要。在此基础上，胞内部分又增加一。
7、个共刺激分子信号区，即形成第三代嵌合抗原受体。但第三代嵌合抗原受体由于将三个信号分子线性串联起来，容易被低亲和力的非特异性抗原激活，甚至出现自我激活，从而发生非抗原特异性的激活而导致细胞毒副作用并引起机体的免疫排斥反应。0003因此，现有技术还有待于改进和发展。发明内容0004鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用，旨在解决现有嵌合抗原受体所存在的问题。0005本发明的技术方案如下一种嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括依次串联的单链可变区片段、来源于CD8的跨膜区、CD3胞内信号区，第一共刺激分子配体CML1和第二共刺激分子配体CML2；。
8、所述CD3胞内信号区与所述第一共刺激分子配体之间串联有第一2A短肽，所述第一共刺激分子配体与所述第二共刺激分子配体之间串联有第二2A短肽。0006所述的嵌合抗原受体，其中，所述第一和第二共刺激分子配体分别为TNF类配体、IG超家族分子或者细胞因子中的一种；所述TNF类配体包括41BBL、OX40L、CD70、LIGHT和CD30L；所述IG超家族分子为CD80和CD86；所述细胞因子包括IL2、IL3、IL6、IL7、IL11、IL12、IL15、IL21或GMCSF。0007所述的嵌合抗原受体，其中，第一共刺激分子配体为CD80，第二共刺激分子配体为41BBL。0008所述的嵌合抗原受体，其。
9、中，所述第一2A短肽的氨基酸序列为EGRGSLLTCGDVEENPGP；第二2A短肽的氨基酸序列为APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP。0009一种编码基因，其中，所述编码基因用于表达如上所述的嵌合抗原受体。0010所述的编码基因，其中，用于编码第一2A短肽的核苷酸序列如SEQNO7所示；用于编码第二2A短肽的核苷酸序列如SEQNO8所示说明书CN104177499A2/5页4一种如上所述编码基因的应用，其中，将所述编码基因用于修饰免疫细胞。0011一种表达载体，其中，所述表达载体中装载有如上所述的编码基因。0012所述的表达载体，其中，所述表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺。
10、相关病毒、质粒等表达载体。所述质粒包括普通质粒和微环质粒。0013有益效果本发明所提供的嵌合抗原受体通过采用2A短肽将嵌合抗原受体与两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。因此，采用此嵌合抗原受体编码基因修饰的免疫细胞，在增强杀伤活性的同时也增强了与靶抗原结合的特异性。采用所述编码基因修饰的免疫细胞可用于肿瘤治疗，也可用于乙肝和其他慢性传染病治疗。附图说明0014图1为本发明实施例2中构建携带有嵌合抗原受体基因的慢病毒载体的示意图。0015图2为本发明实施例2中携带嵌合抗原受。
11、体基因的慢病毒载体的单/双酶切鉴定结果图。0016图3为本发明实施例3中瞬时转染慢病毒载体的293T细胞中CD3的表达检测结果图。0017图4为本发明实施例4中经嵌合抗原受体基因修饰后的免疫细胞对靶细胞的杀伤活性检测结果图。具体实施方式0018本发明提供一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。0019本发明所提供的一种嵌合抗原受体，携带有两个共刺激分子配体，并分别通过两个不同的2A短肽将两个共刺激分子配体与所述嵌合抗原受体连接在同一载体上。所述。
12、共刺激分子配体可以为41BBL、OX40L、CD70、LIGHT、CD30L、CD80、CD86、IL2、IL3、IL6、IL7、IL11、IL12、IL15、IL21或GMCSF等。由于通过采用不同的2A短肽将嵌合抗原受体与两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。0020本发明中，以CD80和41BBL为例，提供一种新型嵌合抗原受体SUPERCAR，其结构为SCFVCD8CD32ACD802A41BBL。具体地，所述嵌合抗原受体是由单链可变区片段SINGLECHAINVAR。
13、IABLEFRAGMENT,SCFV，用于连接SCFV到细胞膜上的CD8跨膜区，CD3胞内信号区，第一共刺激分子配体CD80和第二共刺激分子配体41BBL依次串联组成，其中，所述单链可变区片段主要包括VH和VL片段。其中，SCFVCEA的氨基酸序列依次包括信号前导区、CEA的VH片段、LINKERGGGGS3和VL片段。所述CD3胞内信号区与所述CD80之间串联有第一2A短肽，所述CD80与所述41BBL之间串联有第二2A短肽。2ACD802A41BBL基因的氨基酸序列依次包括T2A片段（即第一2A短肽）、CD80片段、说明书CN104177499A3/5页5F2A片段（即第二2A短肽）、41。
14、BBL片段。其氨基酸序列如下表1所示。0021表1本发明的技术方案中，通过采用2A短肽将嵌合抗原受体与CD80、41BBL两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。0022本发明的技术方案中，用于编码所述嵌合抗原受体的基因序列，其核苷酸序列如SEQNO110所示。其中包括编码SCFV、CD8、CD3、2ACD802A41BBL的各片段基因说明书CN104177499A4/5页6序列。根据需要，还可以在所述嵌合抗原受体的基因序列的两端添加酶切位点，用于连接于表达载体上。0023本。
15、发明中还提供用于携带有所述嵌合抗原受体基因的表达载体及其构建方法，其构建方法如下体外合成SCFV、CD8、CD3、2ACD802A41BBL的各片段基因序列，利用连接酶将各基因片段依次连接，形成完整的SCFVCD8CD32ACD802A41BBL基因片段分子；将所述SCFVCD8CD32ACD802A41BBL基因片段连接到表达载体中，获得携带有SUPERCAR基因的慢病毒载体。0024本发明中构建的新型嵌合抗原受体SUPERCAR的慢病毒载体，将两个共刺激分子配体的基因通过2A短肽的基因片段连接到嵌合抗原受体基因上，使得共刺激分子配体和嵌合抗原受体表达同时表达于免疫细胞表面。而一旦结合到靶细。
16、胞上的抗原，形成细胞突触，免疫细胞表面的CD80和41BBL共刺激分子配体则迅速迁移到该位点，从而有效的激活免疫细胞。因此，本发明中还提供所述嵌合抗原受体的编码基因的应用，将所述编码基因用于修饰免疫细胞。经过本发明构建的嵌合抗原受体编码基因修饰的免疫细胞在增强杀伤活性的同时也增强了与靶抗原结合的特异性。采用所述SUPERCAR编码基因修饰的免疫细胞可用于肿瘤治疗，也可用于乙肝和其他慢性传染病治疗。0025以下通过实施例对本发明作进一步说明。0026实施例1以靶向癌胚抗原CARCINOEMBRYONICANTIGEN,CEA为例，通过体外合成、分子克隆方法获得CEA特异性的SCFVCEACD8C。
17、D32ACD802A41BBL基因片段。其中，SCFVCEA基因的核苷酸序列依次包括信号前导区、CEA的VH片段、LINKERGGGGS3和VL片段，其核苷酸序列如SEQNO14所示。CD8跨膜区基因的核苷酸序列如SEQNO5所示。CD3信号区基因的核苷酸序列如SEQNO6所示。2ACD802A41BBL基因的核苷酸序列依次包括T2A片段、CD80片段、F2A片段、41BBL片段，其核苷酸序列如SEQNO710所示。0027实施例2将所述SCFV（CEA）CD8CD32ACD802A41BBL的基因片段导入慢病毒载体PRRL，得到携带SUPERCAR基因的慢病毒载体将所述SCFVCD8CD32。
18、ACD802A41BBL基因片段和慢病毒载体PRRL使用相同的限制性内切酶进行双酶切，回收DNA片段；将回收的DNA片段通过连接酶进行连接。0028同样的，采用相同的方法，构建具有CEA单链抗体基因的第一、二、三代CAR的慢病毒载体，如图1所示，其中，1STGCAR慢病毒载体为第一代嵌合抗原受体，2NDGCARCD28为携带CD28共刺激分子的第二代嵌合抗原受体，2NDGCAR41BB为携带41BB共刺激分子的第二代嵌合抗原受体，3RDGCAR为第三代嵌合抗原受体，SUPERCAR为本发明构建的新型嵌合抗原受体。0029将携带有不同嵌合抗原受体基因的慢病毒载体采用单/双酶切鉴定，其结果如图2和。
19、表2所示。0030表2说明书CN104177499A5/5页7VECTORNAMEENZYMEDIGESTIONPRODUCTSKBENZYMEDIGESTIONPRODUCTSKB11STGCARXHOI/SPEI215/636STUI091/127/63322NDGCARCD28XHOI/SPEI227/636STUI127/73632NDGCAR41BBXHOI/SPEI227/636STUI091/127/64543RDGCARXHOI/SPEI240/636STUI127/15/5985SUPERCARXHOI/SPEI150/164/636STUI013/02/068/318/53。
20、实施例3将上述构建的携带不同CAR基因的慢病毒载体瞬时转染293T细胞，48H后，裂解细胞，采用WESTERNBLOT方法检测CD3胞内信号区的表达，结果如图3所示。其中，1转染空载体的293T细胞；2转染1STGCAR载体的细胞；3转染2NDGCARCD28载体的细胞；4转染2NDGCAR41BB载体的细胞；5转染3RDGCAR载体的细胞；6转染SUPERCAR载体的细胞。293T细胞本身不表达CD3，转染后，可检测到符合预期大小的CD3胞内信号区，大小正确，说明转染后的重组慢病毒载体在人源细胞中正确表达。0031实施例4将转染重组慢病毒载体的免疫细胞与CEA阳性的肺癌细胞共培养，检测其杀伤。
21、活性。发现SUPERCAR修饰的免疫细胞对靶肿瘤细胞的杀伤率明显高于其它类型的受体修饰的免疫细胞，具体结果如图4所示。其中，1STGCAR表达第一代嵌合抗原受体的免疫细胞；2NDGCARCD28表达携带有CD28共刺激分子的第二代嵌合抗原受体的免疫细胞；2NDGCAR41BB表达携带有41BB共刺激分子的第二代嵌合抗原受体的免疫细胞；3RDGCAR表达第三代嵌合抗原受体的免疫细胞；CD80CAR表达携带有CD80共刺激分子配体的嵌合抗原受体的免疫细胞；41BBLCAR表达携带有41BBL共刺激分子配体的嵌合抗原受体的免疫细胞；SUPERCAR表达本发明构建的新型嵌合抗原受体的免疫细胞。0032。
22、综上所述，本发明所构建的SUPERCAR，将嵌合抗原受体通过2A短肽连接CD80和41BBL两个共刺激分子配体，从而使其修饰的免疫细胞不但具有较高的杀伤活性，也具有较高的抗原特异性。0033应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。说明书CN104177499A1/4页8上海雅科生物科技有限公司一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用10166DNA人工序列编码信号前导区的基因序列1ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCC。
23、AGCATTCCTCCTG60ATCCCA662357DNA人工序列编码VH片段的基因序列2GAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGTGTTGTGCAACCTGGCCGGTCCCTGCGCCTG60TCCTGCTCCGCATCTGGCTTCGATTTCACCACATATTGGATGAGTTGGGTGAGACAGGCA120CCTGGAAAAGGTCTTGAGTGGATTGGAGAAATTCATCCAGATAGCAGTACGATTAACTAT180GCGCCGTCTCTAAAGGATAGATTTACAATATCGCGAGACAACGCCAAGAACACATTGTTC240CTG。
24、CAAATGGACAGCCTGAGACCCGAAGACACCGGGGTCTATTTTTGTGCAAGCCTTTAC300TTCGGCTTCCCCTGGTTTGCTTATTGGGGCCAAGGGACCCCGGTCACCGTCTCCTCA357345DNA人工序列LINKER（GGGGS）3片段的基因序列3GGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCT454318DNA人工序列序列表CN104177499A2/4页9编码VL片段的基因序列4GACATCCAGCTGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGA。
25、CC60ATCACCTGTAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTTCTGTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCA120GGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACTGGACATCCACCCGGCACACTGGTGTGCCAAGC180AGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCA240GAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAATATAGCCTCTATCGGTCGTTCGGCCAAGGG300ACCAAGGTGGAAATCAAA3185216DNA人工序列编码CD8的跨膜区基因序。
26、列5CCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACCCCGGCGCCCACGATCGCGTCGCAGCCC60CTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG120CTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTT180CTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCAC2166492DNA人工序列编码CD3的胞内信号区基因序列6ATGAAGTGGAAGGCGCTTTTCACCGCGGCCATCCTGCAGGCACA。
27、GTTGCCGATTACAGAG60GCACAGAGCTTTGGCCTGCTGGATCCCAAACTCTGCTACCTGCTGGATGGAATCCTCTTC120ATCTATGGTGTCATTCTCACTGCCTTGTTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC180GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGA240GAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCG300AGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTAC。
28、AATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAG360GCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTT420TACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTG480CCCCCTCGCTAA492754DNA人工序列序列表CN104177499A3/4页10编码T2A的基因序列7GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT54872DNA人工序列编码F2A的基因序列8GCACCTG。
29、TGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCC60AACCCAGGGCCC729867DNA人工序列编码CD80的基因序列9ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATACCTCAATTTCTTT60CAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAG120GAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCA180CAAACTCGCATCTACTGGCA。
30、AAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGAC240ATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCC300ATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTGAAG360TATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCT420GACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATA480ATTTG。
31、CTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAA540GAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTTCCCAAGATCCTGAAACTGAGCTCTATGCTGTT600AGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTAT660GGACATTTAAGAGTGAATCAGACCTTCAACTGGAATACAACCAAGCAAGAGCATTTTCCT720GATAACCTGCTCCCATCCTGGGCCATTACCTTAATCTCAGTAAATGGAATTTT。
32、TGTGATA780TGCTGCCTGACCTACTGCTTTGCCCCAAGATGCAGAGAGAGAAGGAGGAATGAGAGATTG840AGAAGGGAAAGTGTACGCCCTGTATAA86710765DNA人工序列序列表CN104177499A104/4页11编码41BBL的基因序列10ATGGAATACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGC60GCTCGCGCCTGCCGCGTACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTG120CTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTT。
33、CCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCC180TCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGAT240CCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTT300CTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTG360ACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTC420TACTATGT。
34、CTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCC480GTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCT540TTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAG600GGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCC660AGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTG720ACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAATAA765序列表CN104177499A111/2页12图1图2说明书附图CN104177499A122/2页13图3图4说明书附图CN104177499A13。