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1、10申请公布号CN104109191A43申请公布日20141022CN104109191A21申请号201410312268922申请日20140702C07K14/32200601C07K1/36200601C07K1/30200601C07K1/34200601C07K1/1820060171申请人北京龙科方舟生物工程技术有限公司地址100193北京市海淀区圆明园西路2号72发明人谯仕彦74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅陈晓庆54发明名称一种枯草菌素抗菌肽分离纯化方法57摘要本发明公开了一种抗菌肽分离纯化方法。本发明公开的一种枯草菌素抗菌肽的分离纯化方法，包。
2、括如下步骤将枯草芽孢杆菌发酵液离心得上清液1；再将所得的上清液1调节PH至4555，静置，得酸性沉淀后的样品；将酸性沉淀后的样品离心得上清液2；将上清液2滤膜过滤，得过滤液。采用本发明公开的方法可以分离纯化得到纯度995以上的枯草菌素抗菌肽。51INTCL权利要求书2页说明书13页附图11页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书13页附图11页10申请公布号CN104109191ACN104109191A1/2页21一种枯草菌素抗菌肽的分离纯化方法，包括如下步骤将枯草芽孢杆菌发酵液离心得上清液1；再将所得的上清液1调节PH至4555，静置，得酸性沉淀后的样品；将酸。
3、性沉淀后的样品离心得上清液2；将上清液2滤膜过滤，得过滤液；将过滤液进行阴离子交换层析，得穿透液和平衡液，将穿透液和平衡液进行第一次疏水层析，280NM检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1；将样品1进行阳离子交换层析，280NM检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品2；将样品2进行第二次疏水层析，280NM检测并收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3，将样品3超滤换液得到枯草菌素抗菌肽；所述枯草芽孢杆菌发酵液购自中农颍泰生物技术有限公司。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵液离心的条件为1500018000RPM，304。
4、5MIN，连续离心23次，具体为12000RPM，连续离心2次。3根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述上清液1调节PH至50；所述PH用冰醋酸调节；所述静置的时间为12H，具体为1H。4根据权利要求13任一所述的方法，其特征在于所述酸性沉淀后的样品离心的条件为1500018000RPM，2030MIN，连续离心23次，具体为12000RPM，连续离心2次。5根据权利要求14任一所述的方法，其特征在于所述滤膜为045UM滤膜。6根据权利要求15任一所述的方法，其特征在于所述阴离子交换层析的柱填料为CAPTOQ；所述阴离子交换层析的层析柱为BPG140/500；所述阴离子交换层析的方法为用。
5、含有50MMTRIS、1MNACL的水溶液和50MMTRIS的水溶液交替处理层析柱，再上样过滤液，收集穿透液，上样完毕后，用50MMTRIS水溶液平衡，得平衡液，将平衡液与穿透液合并；所述过滤液按照3G/L的载量进行上样；所述阴离子交换层析中平衡的体积为12个柱体积，具体为15个柱体积。7根据权利要求16任一所述的方法，其特征在于所述第一次疏水层析的柱填料为BUTYLHP；所述第一次疏水层析的层析柱为BPG100/500；所述第一次疏水层析的方法为用超纯水洗脱，再用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液平衡，平衡完毕，再将阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液上样，上样完毕，。
6、用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液继续平衡，平衡完毕，用PH50的50MMNAACHAC的缓冲液进行洗脱，280NM检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1；所述超纯水洗脱的体积为23个柱体积，具体为2个柱体积；所述第一次疏水层析中用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液平衡的体积为35个柱体积，具体为5个柱体积；所述阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液按照10G/L的载量进行上样。8根据权利要求17任一所述的方法，其特征在于所述阳离子交换层析的柱填料为CAPTOSPIMPRES；权利要求书CN104109191A2/2页3。
7、所述阳离子交换层析的层析柱为BPG100/500；所述阳离子交换层析的方法为用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液洗脱，再用PH50的50MMNAACHAC缓冲液平衡，平衡完毕，将样品1上样，分段收集穿透，检测其是否含有目的抗菌肽，继续用PH50的50MMNAACHAC缓冲液平衡，平衡完毕，用PH50的含有50MMNAACHAC，1MNACL的水溶液洗脱，280NM收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品2；所述阳离子交换层析中用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液洗脱的体积为35个柱体积，具体为5个柱体积；所述阳离子交换层析中再用P。
8、H50的50MMNAACHAC缓冲液平衡的体积为35个柱体积，具体为5个柱体积；所述样品1按照10MG/ML的载量进行上样。9根据权利要求18任一所述的方法，其特征在于所述第二次疏水层析的柱填料为BUTYLHP；所述第二次疏水层析的层析柱为BPG100/500；所述第二次疏水层析的方法为超纯水洗脱，再用PH50的50MMNAACHAC，15MNACL水溶液平衡，平衡完毕，将样品2上样，上样完毕，用PH50的50MMNAACHAC，15MNACL水溶液继续平衡，平衡完毕，用超纯水进行洗脱，280NM收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3；所述第二次疏水层析中超纯水洗脱的体积为23。
9、个柱体积，具体为2个柱体积；所述第二次疏水层析中再用PH50的50MMNAACHAC，15MNACL水溶液平衡体积为35个柱体积，具体为5个柱体积；所述样品2按照10G/L的载量进行上样。10根据权利要求19任一所述的方法，其特征在于所述超滤换液是利用CENETRAMATE超滤系统进行的，具体是用1KD的超滤膜包将样品3浓缩一倍，之后用吐温20补足至原体积，继续浓缩一倍，重复数次；所述鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰的方法为高效液相色谱法，是将洗脱峰和枯草菌素抗菌肽标准品在相同的条件下进行高效液相检测，根据保留时间是否一致进行鉴定；所述枯草菌素抗菌肽标准品是将枯草芽孢杆菌发酵液按照专利号为20111。
10、03924559的发明公开的方法分离得到。权利要求书CN104109191A1/13页4一种枯草菌素抗菌肽分离纯化方法技术领域0001本发明涉及一种抗菌肽分离纯化方法；特别涉及一种枯草菌素抗菌肽分离纯化方法，属于生物技术领域。背景技术0002随着社会的进步和人民生活质量的提高，食品安全性问题越来越受到人们的关注。特别是近年来国内外发生的，如禽流感、口蹄疫、瘦肉精、多宝鱼、溶血性大肠杆菌及水饺中金黄色葡萄球菌等诸多食品安全事件，再一次警示我们，动物性产品的安全已经到了必须解决的时刻。而抗生素及药物在动物性产品中的残留和耐药性是引起动物性食品安全的主要原因之一。世界卫生组织WHO2002年即提出“。
11、在食用动物中减少抗生素使用的全球原则”。欧盟、日本、韩国等发达国家已经禁止抗生素在饲料中使用，对动物治疗用抗生素也有严格的限制。美国已经提出2014年将全面禁止饲料中使用抗生素。国内江苏、辽宁等省市已经率先提出禁止在饲料中添加抗生素的试点。0003抗菌肽AMP是一类由动植物和微生物机体经诱导产生的、具有杀菌活性并与机体先天性免疫紧密相关的特定功能的小分子多肽。经过近四十年的研究，已有1500种肽被证实具有高效的抗菌活性和免疫调节活性，并在医药、食品、农业等领域得到广泛应用。在国外，医药上有多黏菌素主要是多黏菌素B和E和短杆菌肽SGRAMICIDINS治疗耐药铜绿假单胞菌和不动杆菌引起的感染、达。
12、托霉素治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、链球菌以及肠球菌引起的皮肤感染、GLUTOXIM/NOV002治疗结核病和非小细胞肺癌和恩夫韦地治疗艾滋病四种药品进入市场，另有十几个药品进入临床试验阶段。作为食品防腐剂的乳链菌肽NISIN已经在50多个国家被广泛应用；将抗菌肽基因转入农作物,是培育作物抗病新品种的有效途径。该技术已在马铃薯、水稻和烟草等育种中得到应用。00041998年，美国人PAIK等JBIOLCHEM从枯草芽孢杆菌中分离到一种对金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS，蜡样芽孢杆菌BACILLUSCEREUS和化脓链球菌STREPTOCOCCUSPYOGENES有很好抗。
13、菌作用的物质，该物质含有37个氨基酸，耐热，对酸碱较稳定，其结构与NISIN非常相似，命名为SUBLANCIN168，并认为是一种新的羊毛硫抗生素。目前，分离该枯草芽孢杆菌发酵液中的抗菌肽，一般采用高效液相色谱法、反相液相色谱等，目前还没有产业化分离纯化枯草菌素抗菌肽的方法。发明内容0005本发明的目的是提供一种抗菌肽分离纯化方法。0006本发明提供一种枯草菌素抗菌肽的分离纯化方法，包括如下步骤将枯草芽孢杆菌发酵液离心得上清液1；再将所得的上清液1调节PH至4555，静置，得酸性沉淀后的样品；将酸性沉淀后的样品离心得上清液2；将上清液2滤膜过滤，得过滤液；将过滤液进行阴离子交换层析，得穿透液和。
14、平衡液，将穿透液和平衡液进行第一次疏水层析，280NM检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1；将样品1进行阳离子说明书CN104109191A2/13页5交换层析，280NM检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品2；将样品2进行第二次疏水层析，280NM检测并收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3，将样品3超滤换液得到枯草菌素抗菌肽；0007所述枯草芽孢杆菌发酵液购自中农颍泰生物技术有限公司。0008上述方法中，所述发酵液离心的条件为1500018000RPM，3045MIN，连续离心23次，具体为12000RPM，连续离心2次。0。
15、009上述任一所述的方法中，所述上清液1调节PH至50；0010所述PH用冰醋酸调节；0011所述静置的时间为12H，具体为1H。0012上述任一所述的方法中，所述酸性沉淀后的样品离心的条件为1500018000RPM，2030MIN，连续离心23次，具体为12000RPM，连续离心2次。0013上述任一所述的方法中，所述滤膜为045UM滤膜。0014上述任一所述的方法中，所述阴离子交换层析的柱填料为CAPTOQ；0015所述阴离子交换层析的层析柱为BPG140/500；0016所述阴离子交换层析的方法为用含有50MMTRIS、1MNACL的水溶液和50MMTRIS的水溶液交替处理层析柱，再上。
16、样过滤液，收集穿透液，上样完毕后，用50MMTRIS水溶液平衡，得平衡液，将平衡液与穿透液合并；0017所述过滤液具体是按照3G/L的载量进行上样；0018所述阴离子交换层析中平衡的体积为12个柱体积，具体为15个柱体积。0019上述任一所述的方法中，所述第一次疏水层析的柱填料为BUTYLHP；0020所述第一次疏水层析的层析柱为BPG100/500；0021所述第一次疏水层析的方法为用超纯水洗脱，再用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液平衡，平衡完毕，再将阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液上样，上样完毕，用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液继。
17、续平衡，平衡完毕，用PH50的50MMNAACHAC的水溶液进行洗脱，280NM检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1；0022所述超纯水洗脱的体积为23个柱体积，具体为2个柱体积；0023所述第一次疏水层析中用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液平衡的体积为35个柱体积，具体为5个柱体积；0024所述阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液具体是按照10G/L的载量进行上样。0025上述任一所述的方法中，所述阳离子交换层析的柱填料为CAPTOSPIMPRES；0026所述阳离子交换层析的层析柱为BPG100/500；0027所述阳离子交换层析的方法为。
18、用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液洗脱，再用PH50的50MMNAACHAC缓冲液平衡，平衡完毕，将样品1上样，分段收集穿透，检测其是否含有目的抗菌肽，继续用PH50的50MMNAACHAC缓冲液平衡，平衡完毕，用PH50的含有50MMNAACHAC，1MNACL的水溶液洗脱，280NM收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品2；0028所述阳离子交换层析中用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液洗脱的体积为35个柱体积，具体为5个柱体积；说明书CN104109191A3/13页60029所述阳离子交换层析中再用PH50的50MMN。
19、AACHAC缓冲液平衡的体积为35个柱体积，具体为5个柱体积；0030所述样品1具体是按照10MG/ML的载量进行上样。0031上述任一所述的方法中，所述第二次疏水层析的柱填料为BUTYLHP；0032所述第二次疏水层析的层析柱为BPG100/500；0033所述第二次疏水层析的方法为超纯水洗脱，再用PH50的50MMNAACHAC，15MNACL水溶液平衡，平衡完毕，将样品2上样，上样完毕，用PH50的50MMNAACHAC，15MNACL水溶液继续平衡，平衡完毕，用超纯水进行洗脱，280NM收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3；0034所述第二次疏水层析中超纯水洗脱的体积。
20、为23个柱体积，具体为2个柱体积；0035所述第二次疏水层析中再用PH50的50MMNAACHAC，15MNACL水溶液平衡体积为35个柱体积，具体为5个柱体积；0036所述样品2具体是按照10G/L的载量进行上样。0037上述任一所述的方法中，所述超滤换液是利用CENETRAMATE超滤系统进行的，具体是用1KD的超滤膜包将样品3浓缩一倍，之后用吐温20补足至原体积，继续浓缩一倍，重复数次；0038所述鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰的方法为高效液相色谱法，是将洗脱峰和枯草菌素抗菌肽标准品在相同的条件下进行高效液相检测，根据保留时间是否一致进行鉴定；0039所述枯草菌素抗菌肽标准品是将枯草芽孢杆菌。
21、发酵液按照专利号为2011103924559的发明公开的方法分离得到。0040所述高效液相的检测条件具体如下0041高效液相色谱柱型号ZORBAX300SBC846150MM，5UM,保护柱芯ZORBAX300SBC84PACK46125MM，5UM；0042检测波长280NM；0043柱温25；0044流动相A体积百分含量为01TFA的水溶液；B含有体积百分含量80乙腈、0085TFA的水溶液；0045流速1ML/MIN；0046洗脱方法从第0MIN到第1MIN，流动相中A的体积百分含量为80，流动相中B的体积百分含量为20；从第1MIN到第15MIN，流动相中A的体积百分含量由80线性下降。
22、至47，流动相中B的体积百分含量由20线性上升至53；从第15MIN到第17MIN，流动相为B；从第17MIN到第23MIN，流动相中A的体积百分含量为80，流动相中B的体积百分含量为20。0047采用本发明提供的方法可以分离纯化得到纯度995以上的枯草菌素抗菌肽。附图说明0048图1为PH沉淀实验路线图。0049图2为实施例2中发酵液滤膜过滤前后的280NM高效液相检测图谱。0050图3为实施例2中PH梯度沉淀后上清的280NM高效液相检测图谱。说明书CN104109191A4/13页70051图4为实施例2中发酵液PH50沉淀前后样品的变化。0052图5为实施例2中CAPTOQ纯化图谱。0。
23、053图6为实施例2中CAPTOQ280NM高效液相检测图谱。0054图7为实施例2中过滤液经CAPTOQ纯化前后样品的变化。0055图8为实施例3中CAPTOS纯化图谱。0056图9为实施例3中BUTYLHP纯化图谱。0057图10为实施例4中CAPTOSPIMPRES中间纯化图谱。0058图11为实施例4中CAPTOSPIMPRES中间纯化高效液相检测图谱。0059图12为实施例4中CAPTOS中间纯化图谱。0060图13为实施例4中CAPTOS中间纯化高效液相检测图谱。0061图14为实施例5中BUTYLHP精制纯化图谱。0062图15为实施例5中BUTYLHP精制高效液相检测图谱。00。
24、63图16为实施例6中发酵液离心后的上清的高效液相色谱检测。0064图17为实施例6中过滤液的高效液相色谱检测。0065图18为实施例6中CAPTOQ穿透液的高效液相色谱检测。0066图19为实施例6中BUTYLHP捕获纯化图谱。0067图20为实施例6中BUTYLHP洗脱峰高效液相色谱检测。0068图21为实施例6中CAPTOSPIMPRES中间纯化图谱。0069图22为实施例6中CAPTOSPIMPRES洗脱峰高效液相色谱检测。0070图23为实施例6中BUTYLHP精制纯化图谱。0071图24为实施例6中BUTYLHP精制洗脱峰高效液相色谱检测。0072图25为实施例6中枯草菌素抗菌肽的。
25、分离纯化工艺。具体实施方式0073下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0074下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0075CENETRAMATE超滤系统购自PALL公司。0076BPG140/500购自GEHEALTHCARE。0077BPG100/500购自GEHEALTHCARE。0078枯草芽孢杆菌发酵液购自中农颍泰生物技术有限公司，由200L发酵罐按照常规方法发酵枯草芽孢杆菌菌株BF168枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILISBF168已于2013年01月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，地址北。
26、京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNO7200获得。0079CAPTOS、BUYTLHP、CAPTOSPIMPRES、CAPTOQ购自GEHEALTHCARE。0080实施例1、层析纯化工艺参数的优化0081一、CAPTOS纯化工艺参数的优化0082利用DOEDESIGNOFEXPERIMENT的设计，实验得到不同PH、COND的组合测定CAPTOS动态载量值，然后用分析软件UNICORN62预测此种填料在设计的参数范围内是说明书CN104109191A5/13页8否可以达到预期的载量。0083设计方案如表1所示。0084表1DOE设计。
27、方案0085PH值CONDMS/CM4044584012458504458501200860087以按照专利号为2011103924559，发明名称为“一种分离天蚕素抗菌肽的方法”公开的方法分离得到的抗菌肽纯品为初始样品，采用表1设计的缓冲液平衡并结合样品，以10流穿停止上样上样时紫外吸收值和达到这个吸收值的10之后就停止上样，计算载量将10流穿之后洗脱下来的样品进行高效液相检测，算得的数值。0088二、BUYTLHP疏水层析的优化0089设计方案如表2所示。0090表2设计方案00910092以按照专利号为2011103924559，发明名称为“一种分离天蚕素抗菌肽的方法”公开的方法分离得到。
28、的抗菌肽纯品为初始样品，采用表2设计的缓冲液平衡并结合样品，以10流穿停止上样，计算载量。0093三、实验结果0094CAPTOS纯化工艺参数的优化结果如表3所示。0095表3CAPOS优化结果说明书CN104109191A6/13页90096BUYTLHP纯化工艺参数的优化结果如表4所示。0097表4BUTYLHP优化结果00980099从实验结果可知，CAPTOS离子交换填料，电导和PH会对其有影响，但是BUYTLHP疏水填料，电导对其影响不大。0100表3和表4表明，在优化层析参数后的CAPTOS及BUTYLHP对于抗菌肽纯品的载量均在20MG/ML以上，消除了该填料前期实验对抗菌肽低吸。
29、附的疑虑，可以考虑如何优化工艺，以提高发酵液在纯化过程中的柱载量。0101实施例2、前处理工艺的优化0102一、过滤试验0103在前期离心处理12000RPM离心15MIN后过程中，样品中还是有大量的颗粒物质，将发酵液采用045UM的膜过滤，以提高样品的洁净度。0104二、PH沉淀实验0105根据前期在抗菌肽等电点实验中的实验现象，即抗菌肽未沉淀，而杂质大量沉淀的现象，设计PH沉淀实验如图1所示。0106三、CAPTOQ吸附杂质实验0107根据CAPTOS吸附发酵液和纯品时载量的差异，调节样品电导至80左右，通过CAPTOQ填料吸附杂质，在紫外280NM峰处起开始收集流穿抗菌肽，以提高后期纯化。
30、的载量。说明书CN104109191A7/13页100108四、实验结果0109一过滤试验0110将发酵液滤膜过滤前后的样品进行如下高效液相检测，结果如图2所示。0111高效液相型号AGLILENT1260带有四元梯度泵及多波长检测器；0112柱子型号ZORBAX300SBC846150MM，5UM,保护柱芯ZORBAX300SBC84PACK46125MM，5UM；0113检测波长280NM，254NM，214NM；0114温度25；0115流动相A体积百分含量为01TFA的水溶液；B含有体积百分含量80乙腈、0085TFA的水溶液；0116流速1ML/MIN0117样品洗脱方法如下所示01。
31、18从第0MIN到第1MIN，流动相中A的体积百分含量为80，流动相中B的体积百分含量为20；从第1MIN到第15MIN，流动相中A的体积百分含量由80线性下降至47，流动相中B的体积百分含量由20线性上升至53；从第15MIN到第17MIN，流动相为B；从第17MIN到第23MIN，流动相中A的体积百分含量为80，流动相中B的体积百分含量为20。0119图2中，深色是发酵液滤膜过滤后的检测曲线，浅色是过滤前的发酵液的检测曲线。0120下述实施例中的抗菌肽的回收率、纯度、含量和柱子的载量均是将枯草菌素抗菌肽标准品枯草芽孢杆菌发酵液按照专利号为2011103924559，发明名称为“一种分离天蚕。
32、素抗菌肽的方法”公开的方法分离得到进行上述高效液相检测，根据高效液相检测图谱中样品的目标物的峰面积与标准品的峰面积大小计算得出的。0121二PH沉淀实验0122PH梯度沉淀后上清进行高效液相检测条件同步骤一，结果如图3所示。0123图3中，1为调节PH53时的检测曲线，2为调节PH53PH65时的检测曲线，3为调节PH53PH65PH85时的检测曲线，4为调节PH53PH65PH85PH11时的检测曲线。0124样品经PH50沉淀过程变化如图4所示。0125图4中，左管为PH50沉淀前的样品，右管为PH50沉淀后的样品。0126三CAPTOQ吸附杂质实验0127CAPTOQ纯化图谱如图5所示。。
33、0128图5中深色曲线为紫外吸收图谱，浅色为电导图谱。0129CAPTOQ吸附后的高效液相检测条件同步骤一图谱如图6所示，其中1是浓缩2倍后的发酵液的高效液相检测结果，2是CAPTOQ吸附后在紫外280NM峰处高效液相检测结果CAPTOQ12，3是CAPTOQ吸附后在紫外280NM峰处高效液相检测结果CAPTOQ11。0130经CAPTOQ纯化前后对比如图7所示。0131图7中，左管为CAPTOQ纯化前的样品，右管为CAPTOQ纯化后的样品。0132四前处理相关数据如表5所示。说明书CN104109191A108/13页110133表5前处理数据01340135通过前处理系列实验，发酵液样品在。
34、纯度上提高了7倍。0136实施例3、层析工艺的优化0137一、第一步纯化工艺的确定0138一CAPTOS捕获0139将CAPTOS15ML装柱XK16/20，先用50MMNAACHAC，1MNACL，PH50的洗脱缓冲液洗脱5个柱体积，再用PH50的50MMNAACHAC，平衡5个柱体积，平衡完毕，开始上CAPTOQ穿透样品，按载量10MG/ML载量上样，分段收集穿透液，280NM、254NM、214NM液相监测穿透液是否有目的抗菌肽，按照10穿透量停止上样按照10MG/ML的载量进行上样，在流穿10时停止上样，用PH50的50MMNAACHAC平衡，平衡完毕，用50MMNAACHAC，1MN。
35、ACL，PH50洗脱缓冲液洗脱。收集280NM处的洗脱峰，将各洗脱峰进行高效液相色谱检测条件同实施例2中步骤四中一所示，将鉴定含有目的抗菌肽的峰合并，做为下一步纯化的样品。0140二BUTYLHP捕获0141BUTYLHP15ML填料装柱XK16/20，先用超纯水洗10个柱体积，再用50MMNAACHAC，15MNACL，PH50平衡缓冲液平衡5个柱体积，平衡完毕，将已调整好离子强度电导在100120的CAPTOQ收集的穿透样品，按载量10MG/ML载量上样，分段收集穿透液，液相监测穿透液是否有目的抗菌肽，按照10穿透量停止上样，上样完毕，用50MMNAACHAC，15MNACL，PH50的平。
36、衡缓冲液平衡，平衡完毕，用50MMNAACHAC，PH50的洗脱缓冲液洗脱。收集洗脱峰，将各洗脱峰进行高效液相色谱检测条件同实施例2中步骤四中一所示，将鉴定含有目的抗菌肽的峰合并，做为下一步纯化的样品。0142二、实验结果0143CAPTOS纯化图谱如图8所示。0144图8中，曲线1代表紫外线280NM处收集到的抗菌肽图谱，曲线2代表电导率图谱。0145BUTYLHP纯化图谱如图9所示。0146图9中，曲线1代表紫外线280NM处收集到的抗菌肽图谱，曲线2代表电导率图谱。0147具体试验结果如表6所示。0148表6第一步纯化工艺的数据0149说明书CN104109191A119/13页1201。
37、50初步确定采用BUTYLHP捕获作为第一步纯化方法。0151实施例4、第二步纯化工艺的确定0152一、第二步纯化工艺0153一CAPTOSPIMPRES中间纯化0154将CAPTOSPIMPRES15ML装柱K16/20，先用50MMNAACHAC，1MNACL，PH50的洗脱缓冲液洗脱5个柱体积，再用50MMNAACHAC，PH50平衡5个柱体积，平衡完毕，开始上BUTYLHP纯化样品，按载量10MG/ML载量上样，分段收集穿透液，280NM、254NM、214NMNM液相监测穿透液是否有目的抗菌肽，50MMNAACHAC，PH50平衡缓冲液平衡。平衡完毕，用50MMNAACHAC，1MN。
38、ACL，PH50洗脱缓冲液洗脱。收集洗脱峰，将各洗脱峰进行高效液相色谱检测条件同实施例2中步骤四中一所示。0155二CAPTOS中间纯化0156CAPTOS15ML填料装柱XK16/20，先用超纯水洗10个柱体积，再用50MM0157NAACHAC，PH50的平衡缓冲液平衡5个柱体积，平衡完毕，将调整好离子强度电导率至46的BUTYLHP洗脱样品上样，分段收集穿透，280NM、254NM、214NMNM液相监测穿透是否有目的抗菌肽，上样完毕，用50MMNAACHAC，1NACL，PH50平衡缓冲液继续平衡，平衡完毕，用50MMNAACHAC，PH50的洗脱缓冲液洗脱。收集洗脱峰，将各洗脱峰进行。
39、高效液相色谱检测条件同实施例2中步骤四中一所示，将鉴定含有目的抗菌肽的峰合并，做为下一步纯化的样品。0158二、实验结果0159CAPTOSPIMPRES中间纯化图谱如图10所示。0160图10中，曲线1代表紫外线280NM处收集到的抗菌肽图谱，曲线2代表电导率图谱。0161CAPTOSPIMPRES中间纯化高效液相检测如图11所示。0162图11中，1是CAPTOSIMPRES洗1，2是CAPTOSIMPRES洗1，3是CAPTOSIMPRES洗3；0163CAPTOS中间纯化图谱如图12所示。0164图12中，深色曲线代表紫外线280NM处收集到的抗菌肽图谱，浅色曲线代表电导率图谱。016。
40、5CAPTOS中间纯化液相检测图谱如图13所示。0166实验结果如表7所示。0167表7第二步纯化数据0168说明书CN104109191A1210/13页130169表7表明，CAPTOSPIMPRES比CAPTOS具有更高的选择性，因此初步确定CAPTOSPIMPRES作为第二步纯化填料。0170实施例5、第三步纯化工艺的确定0171一、BUTYLHP精制0172BUTYLHP15ML填料装柱XK16/20，先用超纯水洗10个柱体积，再用50MMNAACHAC15MNACL，PH50的平衡缓冲液平衡5个柱体积，平衡完毕，将已调整好离子强度电导率为100110CAPTOSPIMPRES洗脱样。
41、品上样，分段收集穿透，280NM液相监测穿透液是否有目的抗菌肽，上样完毕，用50MMNAACHAC，15MNACL，PH5平衡缓冲液继续平衡，平衡完毕，用50MMNAACHAC，PH50的洗脱缓冲液洗脱。收集洗脱峰，将各洗脱峰进行高效液相色谱检测条件同实施例2中步骤四中一所示，鉴定纯度。0173二、实验结果0174BUTYLHP精制纯化图谱如图14所示。0175图14中，曲线1代表紫外线280NM处收集到抗菌肽图谱，曲线2代表电导率图谱。0176BUTYLHP精制液相检测结果如图15所示。0177图15中，1是紫外280NM处收集到抗菌肽图谱，2是紫外254NM处收集到抗菌肽图谱，3是214N。
42、M处收集到抗菌肽图谱。0178实验结果如表8所示。0179表8第三步纯化数据0180纯化步骤选择方法载量柱体积回收率纯度第三步精制BUTYLHP中间纯化5MG/ML15ML809920181根据表8确定采用BUTYLHP作为第三步层析。0182根据实施例3实施例5的结果，确定采用BUTYLHP捕获、CAPTOSPIMPRES、BUTYLHP精制分别作为第一步、第二步、第三部纯化工艺。0183实施例6、抗菌肽纯化工艺的优化0184一、前处理工艺的放大0185一发酵液的离心0186用CQ75JN管式离心机处理枯草芽孢杆菌发酵液样品5060L，12000RPM1500018000RPM均可，离心30。
43、45MIN，连续离心2次23次均可收集离心液上清液，利用高效液相色谱检测抗菌肽含量，条件同实施例2中步骤四中一所示，以便检测纯度及计算最后总的回收率。0187结果如图16所示。0188图16中，1是紫外线280NM处收集到的抗菌肽图谱，2是紫外线254NM处收集到的抗菌肽图谱，3是紫外线214NM处收集到的抗菌肽图谱。说明书CN104109191A1311/13页140189二样品的酸性沉淀0190在离心后的样品上清液中加入冰醋酸，调节PH至504555均可，静置1H12H均可。0191三酸性沉淀后样品的离心0192采用CQ75JN管式离心机处理酸性沉淀后样品，12000RPM15000180。
44、00RPM均可，离心2030MIN，连续离心2次23次均可。收集离心液上清液，利用高效液相色谱检测抗菌肽含量，条件同实施例2中步骤四中一所示。0193四样品的微滤0194将CENETRASETTE系统安装045UM微滤滤膜，连接配套蠕动泵，用05MNAOH及超纯水按照清洗操作规程处理系统。清洁完毕，将步骤三获得的酸性沉淀样品即离心后的上清液放入进液瓶，开始微滤，收集过滤液，过滤完毕，打空系统，用水和05MNAOH分别处理系统，处理完毕，用03MNAOH保存系统。0195过滤液的高效液相检测条件同实施例2中步骤四中一结果如图17所示。0196五样品的CAPTOQ穿透0197按照标准装柱规程用阴离。
45、子交换层析材料CAPTOQ装填BPG140/500层析柱，用含有50MMTRIS和1MNACL的水溶液和50MMTRIS的水溶液交替处理层析柱，处理完毕，按照3G/L的载量上样步骤四获得的过滤液，收集穿透液，上样完毕，用50MMTRIS水溶液继续平衡15个柱体积12个柱体积均可，收集平衡液合并至穿透液中，液相检测。0198穿透完毕，采用含有50MMTRIS，1MNACL，05MNAOH的水溶液处理柱子1H，再用超纯水冲洗至洗脱液呈中性，用体积百分含量为20的乙醇水溶液冲洗1个柱体积，完毕系统。0199CAPTOQ穿透平衡液合并至穿透液的高效液相检测条件同实施例2中步骤四中一图谱如图18所示。0。
46、200六前处理工艺的放大试验结果如表9所示。0201表9前处理工艺的放大实验结果02020203二、第一步纯化工艺的放大0204一BUTYLHP捕获0205按照标准装柱规程用疏水层析填料BUTYLHP装填BPG100/500层析柱，先用超纯水洗2个柱体积23个柱体积均可，再用平衡缓冲液PH50的含有50MMNAACHAC和15MNACL的水溶液平衡5个柱体积35个柱体积均可，平衡完毕，按照10G/L的载量说明书CN104109191A1412/13页15上样，高效液相监测穿透是否有目的抗菌肽，上样完毕，用平衡缓冲液PH50的含有50MMNAACHAC和15MNACL的水溶液继续平衡，平衡完毕，。
47、用洗脱缓冲液PH50的50MMNAACHAC的水溶液洗脱。280NM检测并收集洗脱峰，将各洗脱峰进行高效液相检测条件同实施例2中步骤四中一，将鉴定含有目的抗菌肽的峰合并，做为下一步纯化的样品。0206BUTYLHP捕获纯化图谱如图19所示。0207图19中，曲线1代表紫外线280NM处收集到抗菌肽图谱，曲线2代表电导率图谱。0208BUTYLHP洗脱峰高效液相检测结果如图20所示。0209图20中，1是紫外线280NM处收集到的抗菌肽图谱，2是紫外线254NM处收集到的抗菌肽图谱，3是紫外线214NM处收集到的抗菌肽图谱。0210二第一步纯化工艺的放大的数据如表10所示。0211表10第一步纯。
48、化工艺的放大实验结果0212纯化步骤载量柱体积回收率纯度BUTYLHP捕获10MG/ML12L85940213三、第二步纯化步骤的放大0214一CAPTOSPIMPRES中间纯化0215按照标准装柱规程用阳离子交换层析材料CAPTOSPIMPRES装填BPG100/500层析柱，先用PH50的含有50MMNAACHAC、15MNACL的水溶液洗脱5个柱体积35个柱体积均可，再用PH50的50MMNAACHAC缓冲液平衡5个柱体积35个柱体积均可，平衡完毕，开始上步骤二得到的BUTYLHP纯化样品，按载量10MG/ML载量上样，分段收集穿透分段收集穿透的目的是检测分段收集样品的纯度即含量，方便以。
49、后直接按照紫外吸收数值直接收集，高效液相监测穿透是否有目的抗菌肽条件同实施例2中步骤四中一，用PH50的50MMNAACHAC平衡缓冲液平衡。平衡完毕，用洗脱液PH50的含有50MMNAACHAC，1MNACL的水溶液洗脱，280NM收集洗脱峰，将其进行高效液相检测条件同实施例2中步骤四中一。0216CAPTOSPIMPRES中间纯化图谱如图21所示。0217图21中，曲线1代表紫外线280NM处收集到抗菌肽图谱，曲线2代表电导率图谱。0218CAPTOSPIMPRES洗脱峰高效液相检测图谱如图22所示。0219图22中，1是紫外线280NM处收集到的抗菌肽图谱，2是紫外线254NM处收集到的抗菌肽图谱，3是紫外线214NM处收集到的抗菌肽图谱。0220二第二步纯化步骤的放大的数据如表11所示。0221表11第二步纯化工艺的放大实验结果02220223四、第三步纯化步骤的放大说明书CN104109191A1513/13页160224一BUTYLHP精制疏水层析的放大0225按照标准装柱规程用BUTYLHP装填BPG100/500层析柱，先用超纯水洗2个柱体积23个柱体积均可，再用平衡缓冲液PH50的50MMNAACHAC，15MNACL水溶液平衡5个柱体积35个柱体积均可，平衡完毕，按照10G/L的载量上样。