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1、10申请公布号CN104098696A43申请公布日20141015CN104098696A21申请号201310117461222申请日20130407C07K16/22200601C12N15/1320060171申请人中美华世通生物医药科技（武汉）有限公司地址430075湖北省武汉市东湖国家高新区高新大道666号光谷生物城B34栋申请人张发明席甘72发明人张发明席甘54发明名称一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体57摘要本发明涉及抗体工程领域，公开了一种新型抗人血管内皮生长因子（HUVEGF）的单克隆抗体。具体的，本发明提供了重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。该单克隆抗体具有与人VEGF。
2、特异结合的特性。本发明还提供了编码该抗体的DNA分子及该抗体的制备方法。51INTCL权利要求书1页说明书2页序列表7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书2页序列表7页10申请公布号CN104098696ACN104098696A1/1页21一种抗VEGF的单克隆抗体，其特征在于它具有含有如下氨基酸序列的三个高变区的重链可变区CDRH1（SEQIDNO1TYGMS），CDRH2（SEQIDNO2ISNGGSYTFYPDSVKG），CDRH3（SEQIDNO3HGSVTTRGFDY）。2根据权利要求1所述的抗VEGF的单克隆抗体，其特征在于它还/或具有含有如下氨。
3、基酸序列的三个高变区的轻链可变区CDRL1（SEQIDNO4KASQSVSNDVV），CDRL2（SEQIDNO5YASNRYT），CDRL3（SEQIDNO6LQDYSSPFT）。3根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆单体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。4根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于其重链氨基酸序列如SEQIDNO7所示。5根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于其轻链氨基酸序列如SEQIDNO8所示。6根据权利要求1或2所述的单克隆抗体的DNA序。
4、列，其特征在于其重链核苷酸序列如SEQIDNO9所示；其轻链核苷酸序列如SEQIDNO10所示。权利要求书CN104098696A1/2页3一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体技术领域0001本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种识别人血管内皮生长因子（HUVEGF）表位的鼠单克隆抗体，更具体的，设计该单克隆抗体的重链和轻链可变区的三个高变区氨基酸序列。背景技术00021971年FOLKMAN首先观察到当肿瘤体积超过12MM3，需要新血管的形成来维持生长，从而最早提出肿瘤生长是血管依赖性的，并指出抗血管生成是控制肿瘤生长的新途径。已有研究表明，几乎所有实体瘤的生长和转移都依赖于肿瘤新血管的生成。0。
5、0031989年FERRARAN发现了血管内皮生长因子VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR，VEGF，后来被证明是目前发现的最重要的血管形成因子之一，在肿瘤的血管生长中发挥着重要作用。对肿瘤的浸润和转移有重要影响，在肿瘤的血管发生过程中发挥极其重要的作用。VEGF既可以用于肿瘤治疗的理想靶点，也可以作为进行肿瘤诊断和判断预后的标志物。0004VEGF是相对分子质量3400042000的高度糖基化碱性同源二聚体糖蛋白，其编码基因位于染色体的6Q213，全长14KB，含有8个外显子和7个内含子，可形成9种异构体，主要包括VEGF121、VEGF165、VEGF189和VE。
6、GF206。其中多数组织以表达VEGF165为主。0005GENETECH公司针对VEGF的人源化单克隆抗体阿瓦斯丁自2004年上市以来被证明对于转移性直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤均有显著的抑制效果。2006年，其优化后的抗体片段雷珠被美国FDA批准用于治疗老年黄斑变形，成为治疗老年性黄斑病变、糖尿病引起的眼底病的首选药。0006由于VEGF及其受体的多样性，不同抗原表位或者不同亲和力的VEGF抗体可能有不同的肿瘤生长抑制效果。因此研究不同的VEGF抗体将有助于VEGF抗体药物的升级。发明内容0007本发明的目的是提供一种抗人血管内皮生长因子（HUVEGF）的单克隆抗体，能够特异性的识别。
7、HUVEGF，对HUVEGF有很高的亲和力。0008本发明提供了一种针对HUVEGF的鼠源单克隆抗体。0009本发明还提供了优选的VEGF抗体重链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序列CDRH1（SEQIDNO1TYGMS），CDRH2（SEQIDNO2ISNGGSYTFYPDSVKG），CDRH3（SEQIDNO3HGSVTTRGFDY）。0010本发明还提供了优选的VEGF抗体轻链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序列CDRL1（SEQIDNO4KASQSVSNDVV），CDRL2（SEQIDNO5YASNRYT），CDRL3（SEQIDNO6LQDYSSPFT）。说明书CN104098696。
8、A2/2页40011本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。具体实施方式0012为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。0013实施例1小鼠单克隆抗体的制备和筛选1小鼠的免疫将VEGF165蛋白溶解在LPBS，取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂SIGMA混匀乳化，取8周龄的BALB/C雌鼠，皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋自溶液与弗氏不完全佐剂SIGMA混匀乳化，在小鼠的皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周，进行第三、。
9、四次免疫。第四次免疫后3天，取脾脏进行细胞融合。00142细胞融合从免疫小鼠内收获脾细胞，将具有较高活性SP2/0骨髓瘤细胞分别与该脾细胞悬液按110100比例混合，加入聚乙二醇使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基进行细胞培养。00153阳性克隆的筛选待融合的细胞培养至第510天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株，命名为165。00164单克隆抗体可。
10、变区序列的获得利用TRIZOLINVITROGEN法提取杂交瘤细胞株165的总RNA，然后用OLIGODT引物和SUPERSCRIPTREVERSETRANSCRIPTASELNVITROGEN反转录成CDNA。经PCR扩增获得抗体重链和轻链的DNA片段，连于克隆载体，挑取克隆进行测序。说明书CN104098696A1/7页5序列表中美华世通生物医药科技武汉有限公司一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体110PATENTINVERSION3315PRT重裢可变区CDR11THRTYRGLYMETSER15217PRT重裢可变区CDR22THRILESERASNGLYGLYSERTYRTHRPHET。
11、YRPROASPSERVALLYS151015GLY序列表CN104098696A2/7页6311PRT重裢可变区CDR33HISGLYSERVALTHRTHRARGGLYPHEASPTYR1510411PRT轻裢可变区CDR14LYSALASERGLNSERVALSERASNASPVALVAL151057PRT轻裢可变区CDR25TYRALASERASNARGTYRTHR1569PRT轻裢可变区CDR36序列表CN104098696A3/7页7LEUGLNASPTYRSERSERPROPHETHR157228PRTMUSMUSCULUS7LEUGLUVALLYSLEUMETGLUSERGLY。
12、GLYASPLEUVALLYSPROGLY151015GLYSERLEULYSLEUSERCYSALAALASERGLYPHETHRPHESERTHR202530TYRGLYMETSERTRPVALARGGLNTHRPROASPLYSARGLEUGLUTRP354045VALALATHRILESERASNGLYGLYSERTYRTHRPHETYRPROASPSER505560VALLYSGLYARGPHETHRILESERARGASPASNALALYSASNSERLEU65707580TYRLEUGLNMETSERSERLEULYSSERASPASPTHRALAMETPHETYR859095C。
13、YSALAARGHISGLYSERVALTHRTHRARGGLYPHEASPTYRTRPGLY100105110序列表CN104098696A4/7页8GLNGLYTHRLEUVALTHRVALSERALAALASERTHRLYSGLYPROSER115120125VALPHEPROLEUALAPROSERSERLYSSERTHRSERGLYGLYTHRALA130135140ALALEUGLYCYSLEUVALLYSASPTYRPHEPROGLUPROVALTHRVAL145150155160SERTRPASNSERGLYALALEUTHRSERGLYVALHISTHRPHEPROALA16。
14、5170175VALLEUGLNSERSERGLYLEUTYRSERLEUSERSERVALVALTHRVAL180185190PROSERSERSERLEUGLYTHRGLNTHRTYRILECYSASNVALASNHIS195200205LYSPROSERASNTHRLYSVALASPLYSLYSVALGLUPROLYSSERCYS210215220ASPGLNTHRSER2258216PRTMUSMUSCULUS8序列表CN104098696A5/7页9GLULEUASPILEVALMETTHRGLNSERPROLYSPHELEULEUVALSER151015ALAGLYASPARGVA。
15、LTHRLEUTHRCYSLYSALASERGLNSERVALSER202530ASNASPVALVALTRPTYRGLNGLNLYSPROGLYARGSERPROASNLEU354045LEUILETYRTYRALASERASNARGTYRTHRGLYVALPROASPARGPHE505560THRGLYSERGLYTYRGLYTHRASPPHETHRPHETHRILESERTHRVAL65707580GLNALAGLUASPLEUALAVALTYRPHECYSLEUGLNASPTYRSERSER859095PROPHETHRPHEGLYSERGLYTHRLYSLEUGLUILELYSARG。
16、THRVAL100105110ALAALAPROSERVALPHEILEPHEPROPROSERASPGLUGLNLEULYS115120125SERGLYTHRALASERVALVALCYSLEULEUASNASNPHETYRPROARG130135140GLUALALYSVALGLNTRPLYSVALASPASNALALEUGLNSERGLYASN145150155160序列表CN104098696A6/7页10SERGLNGLUSERVALTHRGLUGLNASPSERLYSASPSERTHRTYRSER165170175LEUSERSERTHRLEUTHRLEUSERLYSALAASP。
17、TYRGLULYSHISLYS180185190LEUTYRALACYSGLUVALTHRHISGLNGLYLEUARGSERPROVALTHR195200205LYSSERPHEASNARGGLYGLUCYS2102159684DNAMUSMUSCULUS9CTCGAGGTGAAGCTGATGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA60CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAG120ACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAATGGC。
18、GGTAGTTACACCTTC180TATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTT240TACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGACGACACAGCCATGTTTTACTGTGCAAGACAC300GGCAGTGTGACTACGAGGGGGTTTGATTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCT360GCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT420GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTC。
19、AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG480序列表CN104098696A107/7页11TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC540TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAG600ACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAG660CCCAAATCTTGTGACCAAACTAGT68410658DNAMUSMUSCULUS10GAGCTCG。
20、ATATTGTGATGACCCAGTCTCCCAAATTCCTGCTTGTATCAGCAGGAGACAGG60GTTACCTTAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTGGTTTGGTACCAACAG120AAGCCAGGGCGGTCTCCTAACCTGCTGATATACTATGCATCCAATCGCTACACTGGAGTC180CCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATATGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCACTGTG240CAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGTCTACAGGATTATAGCTCTCCATTCAC。
21、GTTC300GGCTCGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC360CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAAC420TTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC480TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC540CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAACTCTACGCCTGCGAAGTCACCCAT600CAGGGCCTGAGATCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTTCTAGA658序列表CN104098696A11。