说明书用于处理纤维素材料的改进的内切葡聚糖酶
产生本发明的工作已经接受了来自欧盟第七框架计划(European Community’s Seventh Framework Programme)FP7/2007-2013在239341号拨款协议下的资助。
技术领域
本发明涉及通过酶转化由木质纤维素材料生产可发酵糖。可发酵糖例如可用于生产生物乙醇或用于其它用途。特别地，本发明涉及新型多肽、编码它们的多核苷酸及含有所述多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用真菌内切葡聚糖酶或含有所述酶的酶制剂处理纤维素材料的方法。本发明又还涉及所述多肽和含有所述多肽的酶制剂的用途及其制备方法。
背景技术
有限的化石燃料资源、由其释放出的越来越多的二氧化碳的量以及引起的温室现象提出了如下的需求：使用生物质作为可再生且清洁的能源。生物质资源可广泛分类为基于农业或林业的生物质资源，包含来源于农业和木材工业的二次来源；废物来源；和城市固体废物。一种有前景的可选技术是由木质纤维素材料生产生物燃料，即(生物)乙醇。在运输领域中，生物燃料暂时是唯一的选择，其能够将CO2排放量降低一个数量级。乙醇可用于现有的车辆和配送系统中，且因此不需要昂贵的基础设施投资。来源于木质纤维素可再生原料的糖也可用作可替代油基化学品的各种化学产品的原料。
木质纤维素原料包含用于包括生物乙醇的各种生物燃料的丰富的碳水化合物来源。在植物中的大多数碳水化合物是木质纤维素的形式，其基本上由纤维素、半纤维素和木质素组成。木质纤维素可经由发酵、 接着水解成可发酵糖而转变成生物乙醇及其它化学产品。在传统的由木质纤维素生产乙醇的方法中，木质纤维素材料首先进行化学或物理预处理，以使纤维素成分更易于水解。随后，使纤维素成分水解以获得可通过酵母菌发酵成乙醇并蒸馏以获得纯乙醇的糖。作为可用作固体燃料的主要副产品而获得木质素。
由纤维素和木质纤维素生物质生产生物燃料的一个障碍是细胞壁的坚韧性和以难获得性聚合物形式存在的糖单体，这些糖单体需要大量的加工来生产可通常用于通过发酵生产醇的微生物所利用的糖单体。酶水解被视为用于将纤维素生物质转变成可发酵糖的最有前景的技术。然而，酶水解仅极少数在工业规模下使用，且特别是在使用诸如木材或农业废物的高度木质化的材料时，该技术并不令人满意。酶步骤的成本是该方法的主要经济因素之一。已经作出尝试来改进纤维素材料的酶水解的效率(Badger 2002)。
WO 2001060752描述用于将固体木质纤维素生物质转变成可燃性燃料产品的连续方法。在通过湿式氧化或蒸汽闪爆预处理之后，生物质被部分地分离成纤维素、半纤维素和木质素，随后使用一种或多种糖酶使其经受部分水解(EC 3.2)。
WO 2002024882涉及通过用如下的酶混合物处理预处理的木质纤维素底物而将纤维素转变成葡萄糖的方法，该酶混合物包含：纤维素酶，和通过灭活其纤维素结合域(CBD)获得的改性纤维二糖水解酶I(CBHI)。
US 20040005674 A1描述可在木质纤维素底物上直接使用的新型酶混合物，由此可避免在预处理过程期间形成有毒的废产物，且可节约能量。协同酶混合物含有纤维素酶和诸如木聚糖酶、木质酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶或葡糖醛酸糖苷酶或其任意组合的辅助酶。纤维素酶被视为包括内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶。US 20050164355描述用选自内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶的一种或多种纤维素分解酶且在至少一种表面活性剂存在下降解木质纤维素材料的方法。也可使用另外的酶，诸如半纤维素酶、酯酶、过氧化物酶、蛋白酶、漆酶或其混合物。与缺乏表面活性剂的情况相比较，表面活性剂的存在增加木质纤维素材料的降解。
WO 2011080317描述用真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶处理纤维素材料的方法。该酶可用于各种工业应用中，特别是用于生产生物燃料，其中在中等温度至高温下由木质纤维素材料生产可发酵糖是有利的。
已经纯化并表征了来自许多细菌和真菌来源的纤维素酶。研究最深且应用最广泛的真菌来源的纤维素分解酶已经从里氏木霉(Trichoderma reesei)(无性型红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))得到。还公开了来自了解不多的真菌的纤维素酶。Hong等(2003a和2003b)表征了在酵母菌中生产的耐热子囊菌的EG和CBHI。Tuohy等(2002)描述了来自适度嗜热的真菌埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的三种形式的纤维二糖水解酶。这些埃默森篮状菌纤维二糖水解酶的序列和详细生物化学表征已经显示与里氏木霉和白腐真菌(P.chrysosporium)的纤维二糖水解酶相当的性质。另一嗜热真菌白马兰诺菌(Melanocarpus albomyces)的纤维素酶包括至少两种内切葡聚糖酶(Cel45A和Cel7A)和一种纤维二糖水解酶(Cel7B)。这些酶已经被克隆并对于它们的pH和温度特性进行了表征(Miettinen-Oinonen等，2004)。WO 2007071818描述通过包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和任选来源于嗜热子囊菌(Thermoascus auranticus)、嗜热枝顶孢菌(Acremonium thermophilium)或嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilium)的木聚糖酶的酶进行的木质纤维素材料的酶转化。US 7,892,812描述包含内切葡聚糖酶的纤维素组合物及其在工业应用中，例如在木质纤维素生物质的糖化中的用途。这些纤维素酶来自真菌嗜角质金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)，其已经被确认为嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)(Visser等，2011)。
Cel7家族的内切葡聚糖酶(EGs fam 7)例如公开在US 5,912,157中，该专利涉及丝菌属内切葡聚糖酶和其同源物及其在清洁剂、纺织和纸浆中的用途。US 6,071,735描述在碱性条件下展示出高内切葡聚糖酶活性的纤维素酶。论述了作为清洁剂、在纸浆和纸及纺织应用中的用途。US 5,763,254公开了来自腐质霉属(Humicola)的菌株、镰刀菌属(Fusarium)的菌株和丝菌属的菌株的降解纤维素/半纤维素的且具有与里氏木霉的A区同源的碳水化合物结合模块的酶。
WO 2004078919公开了来自绳状青霉(Penicillium funiculosum)的纯化的糖基水解酶家族7(Cel7A)酶，当用内切葡聚糖酶配制且在预处理的玉米秸上试验时，其证明高水平的特定性能。
Haakana等(2004)描述来自白马兰诺菌的编码纤维素酶Cel45A、Cel7A和Cel7B的三种基因的克隆和测序。这些纤维素酶在生物石磨中适用，与里氏木霉相比较，具有较低的返染(backstaining)。WO 9714804公开了来自白马兰诺菌的Cel7A家族酶及其在纺织和清洁剂工业中的应用。Voutilainen等(2008)描述来自如下嗜热真菌的新型GH7家族纤维二糖水解酶：嗜热枝顶孢菌、嗜热子囊菌和嗜热毛壳菌，其在不溶性聚合底物上具有活性并参与纤维素水解中的限速步。
US 5,393,670描述编码里氏木霉内切葡聚糖酶I的DNA、载体和转化的宿主。
存在对于降解纤维素底物、特别是木质纤维素底物的新方法和增强该降解的效率的新型酶和酶混合物的持续需求。还存在对于如下酶和方法的需求，它们是多用途的且不仅在中等温度下工作，而且在高温下工作，因此增加反应速率且使得能够使用产生高糖和乙醇浓度的高生物质稠度。该方法可产生显著的能量和投资成本节约。高温还降 低在水解期间的污染风险。本发明旨在满足这些需求中的至少一部分。
发明内容
本发明的一个目的在于提供具有内切葡聚糖酶活性的新型多肽和编码所述多肽的多核苷酸。所述新型多肽可具有改进的比活性和/或改进的热稳定性。所述新型多肽还可具有多用途应用。本发明的另一目的在于提供如下的新型酶和酶制剂，其增强纤维素降解的效率。特别地，本发明的目的在于提供具有内切葡聚糖酶活性的新型酶。本发明的另一目的在于提供用改进的酶或酶制剂处理纤维素材料的方法。
通过从嗜热枝顶孢菌(Acremonium thermophilium)ALKO4245中获得的GH家族7(Cel7)的新型多肽实现本发明的目的。
本发明提供具有内切葡聚糖酶活性和包含如下氨基酸序列或其具有内切葡聚糖酶活性的片段或变体的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7(EG_A)具有至少57％的同一性或与SEQ ID NO:8(EG_B)具有至少58％的同一性。
本发明还提供分离的多核苷酸，其选自：
a)包含如在SEQ ID NO:5或6中所示的编码序列的多核苷酸；
b)编码根据权利要求1所述的多肽的多核苷酸；
c)编码由a)或b)的多核苷酸编码的多肽的片段的多核苷酸，其中所述片段具有内切葡聚糖酶活性；和
d)包含与a)或b)的多核苷酸的核苷酸序列具有简并性的核苷酸序列的多核苷酸；
或这种多核苷酸的互补链。
本发明还涉及如下的载体，其包含所述多核苷酸和包含所述载体的宿主细胞。在本发明中还包括具有保藏编号DSM 25492、DSM 25493、DSM 25657、DSM 25658、DSM 25655和DSM 25656的大肠杆菌菌株。
本发明的另一目的在于提供一种生产所述具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，和在能够表达所述多肽的条件下培育所述宿主细胞，及任选回收和纯化所述多肽。
本发明的其它目的为包含所述新型多肽中的至少一种的酶制剂及所述酶制剂和多肽在生物燃料、生物质水解、淀粉、纺织、清洁剂、纸浆和纸、食品、饲料或饮料工业中的用途。
本发明还提供用内切葡聚糖酶或包含所述内切葡聚糖酶的酶制剂处理纤维素材料的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)使所述纤维素材料与所述内切葡聚糖酶或包含所述内切葡聚糖酶的酶制剂反应；
ii)获得至少部分地水解的纤维素材料。
在从属权利要求中提出本发明的具体实施方式。将从以下附图、详述和实施例中清楚地得出本发明的其它目的、细节和优点。
适用于所述方法的新型内切葡聚糖酶能够在中等温度至高温下、特别是与在纤维素或木质纤维素材料的水解中使用的其它酶组合来水解纤维素材料。
从嗜热枝顶孢菌ALKO4245中获得的内切葡聚糖酶特别地可用于水解和降解纤维素材料。这些酶在宽温度范围内在动力学上非常有效，且尽管它们在标准水解温度下具有高活性，然而它们在高温下也非常有效。这使得它们对于改变在常规温度下和在高温下进行的纤维素底物水解方法是非常适合的。在常规的水解和发酵分开的方法中，酶水解的温度通常高于发酵的温度。在所述水解中使用热稳定酶提供潜在的益处，例如在高温下的较高反应速率、由于酶的较高比活性和稳定 性降低酶荷载，增加对于方法构造的灵活性和减小污染风险。与嗜温酶相比较，热稳定酶的一般稳健性还增加酶在工业过程中的可循环性。
附图说明
在下文中，将借助于优选的实施方式参考所附的附图更详细地描述本发明，其中：
图1示意性显示在里氏木霉原生质粒转化中使用用来过度生产重组嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG/Cel7蛋白(EG_A和EG_B)、嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG/Cel7+里氏木霉EGI/Cel7B_连接子-CBM(EG_A+EGI-CBM和EG_B+EGI-CBM)和嗜热枝顶孢菌ALKO4245EG/Cel7+里氏木霉CBHI/Cel7A_连接子CBM(EG_A+CBHI-CBM和EG_B+CBHI-CBM)融合蛋白的表达组件。嗜热枝顶孢菌ALKO4245cel7/egl基因(egl_A和egl_B)和cel7/egl-CBM融合基因嗜热枝顶孢菌ALKO4245cel7/egl+里氏木霉cel7B/egl1_连接子-CBM(egl_A+egl1-CBM和egl_B+egl1-CBM)及嗜热枝顶孢菌ALKO4245cel7/egl+里氏木霉cel7A/cbh1_连接子-CBM(egl_A+cbh1-CBM和egl_B+cbh1-CBM)处于里氏木霉cel7A/cbh1启动子(p cbh1)的控制之下且通过使用里氏木霉cel7A/cbh1终止子序列(t cbh1)确保转录的终止。包括作为转化标记物的amdS基因。
图2显示对来自蒸汽闪爆的玉米纤维用包含本发明的EG/Cel7内切葡聚糖酶的酶混合物进行水解的结果。对玉米纤维底物使用不同的酶混合物全部以0.5mg蛋白/g固体总量的剂量在37℃和55℃下在高干物质条件下水解。在实施例5中更详细地描述酶混合物、基础酶混合物(混合物1)和包含EG_A和EG_B的组合物的组成。在48小时水解时间之后对来自五个不同试管的样品取样且通过HPLC定量，其中测定葡萄糖的浓度。示出葡萄糖的浓度。
图2A显示对蒸汽闪爆的玉米纤维在37℃下用基础酶混合物(混合物1)、补充以EG_A(混合物1_EG_A)或EG_B(混合物1_EG_B)进行的水解的结果。
图2B显示对蒸汽闪爆的玉米纤维在55℃下用基础酶混合物(混合 物1)、补充以EG_A(混合物1_EG_A)进行的水解的结果。
图3显示对来自蒸汽闪爆的玉米纤维用包含本发明的EG_A+EGI-CBM和EG_B+EGI-CBM融合蛋白的酶混合物进行的水解的结果。对玉米纤维底物使用不同的酶混合物以0.5mg蛋白/g固体总量的剂量在37℃下在低干物质条件和高干物质条件两者下和在55℃下在高干物质条件下水解。在实施例5中更详细地描述酶混合物、基础酶混合物(混合物1)和包含EG_A+EGI-CBM和EG_B+EGI-CBM的组合物的组成。在48小时水解时间之后对来自五个不同试管的样品取样且通过HPLC定量，其中测定葡萄糖的浓度。示出葡萄糖的浓度。
图3A显示对蒸汽闪爆的玉米纤维在37℃下在低干物质条件下且用基础酶混合物(混合物1)、补充以EG_A+EGI-CBM或EG_B+EGI-CBM进行的水解的结果。
图3B显示对蒸汽闪爆的玉米纤维在37℃下在高干物质条件下且用基础酶混合物(混合物1)、补充以EG_B+EGI-CBM进行的水解的结果。
图3C显示对蒸汽闪爆的玉米纤维在55℃下在高干物质条件下且用基础酶混合物(混合物1)、补充以EG_B+EGI-CBM进行的水解的结果。
图4显示来自对蒸汽闪爆的玉米纤维用包含本发明的EG_A+CBHI-CBM和EG_B+CBHI-CBM融合蛋白的酶混合物进行的水解的结果。对玉米纤维底物使用不同的酶混合物以0.5mg蛋白/g固体总量的剂量在37℃下在低干物质条件和高干物质条件两者下和在55℃下在高干物质条件下水解。在实施例5中更详细地描述酶混合物、基础酶混合物(混合物1)和包含EG_A+CBHI-CBM和EG_B+CBHI-CBM的组合物的组成。在48小时水解时间之后对来自五个不同试管的样品取样且通过HPLC定量，其中测定葡萄糖的浓度。示出葡萄糖的浓度。
图4A显示对蒸汽闪爆的玉米纤维在37℃下在低干物质条件下且用基础酶混合物(混合物1)、补充以EG_A+CBHI-CBM或EG_B+CBHI-CBM进行的水解的结果。
图4B显示对蒸汽闪爆的玉米纤维在37℃下在高干物质条件下用 基础酶混合物(混合物1)、补充以EG_A+CBHI-CBM或EG_B+CBHI-CBM进行的水解的结果。
图4C显示对蒸汽闪爆的玉米纤维在55℃下在高干物质条件下且用基础酶混合物(混合物1)、补充以EG_B+CBHI-CBM进行的水解的结果。
序列表
SEQ ID NO:1寡聚核苷酸引物egl9的序列。
SEQ ID NO:2寡聚核苷酸引物egl11的序列。
SEQ ID NO:3使用引物egl9和egl11从嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)中获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO:4使用引物egl9和egl11从嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)中获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO:5嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)egl_A基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)egl_B基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)EG_A基因的推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)EG_B基因的推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9寡聚核苷酸引物egl50的序列。
SEQ ID NO:10寡聚核苷酸引物CBM_1的序列。
SEQ ID NO:11寡聚核苷酸引物CBM_2的序列。
SEQ ID NO:12寡聚核苷酸引物CBM_17的序列。
SEQ ID NO:13寡聚核苷酸引物egl64的序列。
SEQ ID NO:14寡聚核苷酸引物CBM_4的序列。
SEQ ID NO:15寡聚核苷酸引物CBM_5的序列。
SEQ ID NO:16寡聚核苷酸引物CBM_18的序列。
SEQ ID NO:17使用引物egl50和CBM_1从含有全长嗜热枝顶孢 菌ALKO4245egl_A基因的质粒中获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO:18使用引物egl64和CBM_4从含有全长嗜热枝顶孢菌ALKO4245egl_B基因的质粒中获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO:19使用引物CBM_2和CBM_17从含有里氏木霉egl1基因的质粒中获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO:20使用引物CBM_5和CBM_18从含有里氏木霉egl1基因的质粒中获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO:21嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)egl_A+里氏木霉egl1-CBM融合基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)egl_B+里氏木霉egl1-CBM融合基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)EG_A+里氏木霉EGI-CBM融合蛋白的推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)EG_B+里氏木霉EGI-CBM融合蛋白的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO:25嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)egl_A+里氏木霉cbh1-CBM融合基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)egl_B+里氏木霉cbh1-CBM融合基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)EG_A+里氏木霉CBHI-CBM融合蛋白的推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28嗜热枝顶孢菌ALKO4245(CBS 116240)EG_B+里氏木霉CBHI-CBM融合蛋白的推导的氨基酸序列。
发明详述
纤维素是高等植物的主要结构组分。其提供植物细胞以高抗张强度以帮助它们抵抗机械应力和渗透压。纤维素为由通过β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖残基的直链构成的β-1,4-葡聚糖。纤维二糖是纤维素的最小重复单元。在细胞壁中，纤维素被堆叠在各种方向的片层中，它们嵌入半纤维素和木质素的基体中。半纤维素为碳水化合物聚合物的异类 群，其主要含有不同的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖。半纤维素由β-1,4-连接的残基的线性主链组成，其中β-1,4-连接的残基被通常含有乙酰基、葡糖醛酸基、阿拉伯糖基和半乳糖基的短侧链取代。半纤维素可与木质素化学交联。木质素为被不同取代的对羟基苯基丙烷单元的复杂交联聚合物，其提供强度给细胞壁以经受机械应力，且其还保护纤维素免受酶水解。
在此使用的“纤维素”和“纤维素材料”是指包含纤维素、半纤维素和/或木质纤维素作为重要组分的任何材料。纤维素材料的实例包括例如衍生自棉花、亚麻、大麻、黄麻的纺织纤维及如莫代尔(modal)、粘胶(viscose)和莱赛尔(lyocel)的人造纤维素纤维。
“木质纤维素”为纤维素、半纤维素、与苯酚丙醇单元和木质素的聚合物的组合。其在物理上是硬而密且难以透过的，且是生物圈内最丰富的生物化学材料。“木质纤维素材料”是指包含木质纤维素的任何材料。这样的材料例如为：硬木和软木碎片、木浆、木屑及林业和木材工业废料；农业生物质，例如谷草、甜菜废粕、玉米纤维、玉米秸和玉米棒、甘蔗渣、杆、叶、壳、皮等；废物，例如城市固体废物、报纸和办公室废纸、例如谷物的研磨废料；专用能源作物(例如，柳树、白杨、柳枝稷或草芦等)。优选的实例为玉米秸、柳枝稷(switchgrass)、谷草、甘蔗渣和木材衍生材料。
纤维素材料在自然界中被包括生成能够水解碳水化合物聚合物的酶的细菌和真菌的各种生物体降解。降解通常需要不同的纤维素酶依次或同时起作用。含有更复杂的纤维素的底物的降解需要广泛范围的各种酶。例如，半纤维素通过半纤维素酶例如木聚糖酶和甘露糖酶降解。半纤维素酶是水解半纤维素的酶。
“纤维素分解酶”为具有“分解纤维素的活性”的酶，这意味着它们能够将纤维素底物或其衍生物水解成较小的糖。纤维素分解酶因 此包括纤维素酶和半纤维素酶两种。在此使用的纤维素酶包括(1)内切葡聚糖酶(EG EC 3.2.1.4)，其断开(cut)内部β-1,4-糖苷键；(2)外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH，EC 3.2.1.91)，其从结晶纤维素聚合物链的还原或非还原端断开二糖：纤维二糖；(3)β-1,4-葡萄糖苷酶(BG，EC 3.2.1.21)，其将纤维二糖及其它短纤维寡聚糖水解成葡萄糖。CAZY(碳水化合物活性酶)分类体系根据序列相似性将糖基水解酶(GH)合并成家族，已经显示它们反映共用的结构特征。除此之外，纤维素酶可根据它们的原始序列归类为各种糖基水解酶家族，这通过该家族的一些成员的三维结构的分析而得到支持(Henrissat 1991，Henrissat和Bairoch 1993,1996)。
里氏木霉具有含有两个CBH、两个主要的EG和几个次要的EG及几个BG的公知且有效的纤维素酶系。里氏木霉CBHI(Cel7A)从纤维素链的还原端断开糖，其具有C-末端纤维素结合模块(CBM)且可构成总分泌蛋白的最高达60％。里氏木霉CBHII(Cel6A)从纤维素链的非还原端断开糖，具有N-末端纤维素结合模块且可构成总分泌蛋白的最高达20％。内切葡聚糖酶EGI(Cel7B)和EGV(Cel45A)在它们的C-末端具有纤维素结合模块(CBM)，EGII(Cel5A)具有N-末端CBM，而EGIII(Cel12A)根本没有纤维素结合模块。CBHI、CBHII、EGI和EGII是一起构成总分泌蛋白的80～90％的木霉的所谓“主要纤维素酶”。本领域普通技术人员已知酶可对几种底物具有活性且可使用不同的底物、方法和条件来测量酶活性。例如在van Tilbeurgh等1988中论述鉴定不同分解纤维素活性。
许多真菌水解酶是模块化蛋白，且它们全部含有表达分解纤维素活性的催化域(CD)/核。除了CD以外，水解酶还可含有碳水化合物结合模块，也称作纤维素结合域(CBD)，其可定位在催化域的N-末端或C-末端。CBM介导纤维素酶与结晶纤维素的结合，但对该酶对可溶性底物的纤维素酶水解活性几乎没有影响。这两个域通常经由柔性且高度糖基化的连接子区域连接。
糖苷水解酶家族7(GH7)包含具有数种已知活性的酶，特别是内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。“内切葡聚糖酶(EG)”为断开纤维素链的内部糖苷键的酶。它们是1,4-β-D-葡聚糖4-葡糖水解酶且催化在诸如纤维素及其衍生物的葡萄糖聚合物中的1,4-β-D-糖苷键内切水解。一些内切葡聚糖酶具有天然存在的纤维素结合域，而其它内切葡聚糖酶却没有。一些内切葡聚糖酶还具有木聚糖酶活性(Bailey等，1993)。
本发明基于的研究试图发现将改进纤维素底物的水解效率且能够用于多用途应用的新型GH7家族内切葡聚糖酶。这些新型酶的鉴定使用已知的分子生物学方法来完成。基本方法例如在Sambrook和Russel，2001中描述。获得称为EG_A和EG_B的两个GH家族7(Cel7)内切葡聚糖酶(表1)。
表1.本发明的EG/Cel7内切葡聚糖酶
根据本发明的新型EG/Cel7内切葡聚糖酶可由枝顶孢属获得，优选由嗜热枝顶孢菌获得，更优选由具有被保藏为CBS 116240的菌株ALKO4245的特征的菌株获得。“由……获得”是指它们可由所述物种获得，但并不排除从其它来源获得它们的可能性。换句话说，它们可来源于包括植物的任何生物体。优选它们可来源于例如细菌或真菌的微生物。所述细菌例如可来自选自芽胞杆菌属、固氮螺菌属和链霉菌属的类属。更优选地，所述酶来源于真菌(包括丝状真菌和酵母菌)，例如来源于选自以下的类属：嗜热子囊菌属(Thermoascus)、枝顶孢菌属、毛壳菌属、无毛毛壳属(Achaetomium)、梭孢壳菌属(Thielavia)、曲 霉菌属(Aspergillus)、葡萄孢属(Botrytis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、金钱菌属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、香菇属(Lentinus)、马兰诺菌属(Melanocarpus)、毁丝霉属(Myceliophthora)、麦瑞菌属(Myriococcum)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、毛平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(phlebia)、侧耳属(Pleurotus)、柄孢壳属(Podospora)、多孔属(Polyporus)、丝核菌属(Rhizoctonia)、西塔利菌属(Scytalidium)、密孔菌属(Pycnoporus)、篮状菌属(Talaromyces)、栓菌属(Trametes)和木霉菌属(Trichoderma)。
具有内切葡聚糖酶活性的本发明的新型EG/Cel7多肽优选包含如下的氨基酸序列或其具有内切葡聚糖酶活性的片段或变体，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7(EG_A)具有至少57％的同一性或与SEQ ID NO:8(EG_B)具有至少58％的同一性。根据本发明的一个实施方式，所述多肽与SEQ ID NO:7或8或与其酶活性片段具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。具有内切葡聚糖酶活性的EG/Cel7多肽在本文中仅简称为内切葡聚糖酶。
术语“同一性”(identity)在本文中是指从由相应基因编码的第一氨基酸到最后氨基酸彼此相比较时在两个氨基酸序列之间的整体同一性。通过使用在EBI(欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute))http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/下的EMBOSS Needle Needleman-Wunsch整体比对程序在以下参数下测量全长序列的同一性：BLOSUM50、Gap open 10.0、Gap extend 0.5。该算法描述在Needleman和Wunsch(1970)中。本领域普通技术人员了解如下事实：使用Needleman-Wunsch算法的结果只有在对准序列的相应域且在各比较中使用相同参数时才是可比较的。因此，无法进行例如包括CBM或信号序列的纤维素酶序列与具有缺乏那些元素的序列的比较。
术语“具有内切葡聚糖酶活性的片段”是指具有内切葡聚糖酶活 性的定义序列的任何片段。换句话说，具有内切葡聚糖酶活性的片段可为定义序列的成熟蛋白部分，或其可仅为成熟蛋白部分的片段，前提是其仍然具有内切葡聚糖酶活性。
所述新型多肽还可为所述多肽的变体。“变体”可为天然存在的多肽，例如在相同菌株、物种或类属内的等位基因变体，或其可通过诱变产生。其可包括氨基酸取代、缺失或插入，但其仍以基本类似于上文定义的酶的方式起作用，即其包含具有内切葡聚糖酶活性的片段。
所述分解纤维素的多肽通常在细胞中作为包含在蛋白分泌期间切下的信号序列的前多肽生成。它们也可在分泌期间在N-末端和/或C-末端进一步加工以给出成熟的酶活性蛋白。“具有内切葡聚糖酶活性的多肽”因此表示所述多肽可以在不成熟形式或成熟形式，优选其在成熟形式，即已经发生加工。另外，“成熟形式”是指酶已经从其在融合构造中的载体蛋白中脱下。
本发明的EG/Cel7内切葡聚糖酶优选为重组酶，其可以以通常已知的方式生成。将包含内切葡聚糖酶基因的多核苷酸片段分离，将基因在强启动子下插入表达载体中，该载体转化到合适的宿主细胞中且在激起酶生成的条件下培养宿主细胞。通过重组技术在不同宿主体系中生成蛋白的方法在本领域中是公知的(Sambrook等，1989；Coen,2001；Gellissen,2005)。优选所述酶作为细胞外酶生成，它们分泌到培养基中，可从该培养基中容易地回收并分离它们。
所述重组多肽可为融合多肽，其中在本发明的多肽的N-末端或C-末端融合另一多肽。通过使编码另一多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合而生成融合多肽。在本领域中已知生成融合多肽的技术，其包括连接编码所述多肽的编码序列以使得它们处于框架中且融合多肽的表达处于相同启动子和终止子的控制之下。
在SEQ ID NO:7中公开的本发明多肽天然地含有C-末端CBM和连接子。“连接子”为连接催化域和CBM的柔性且高度糖基化的区域。在此使用的CBM还包括连接子区域。在本发明的一个实施方式中，该天然连接子和CBM区域可被例如来自木霉属或毛壳菌属物种的、优选来自里氏木霉的连接子和CBM替代。在优选的实施方式中，内切葡聚糖酶EG_A的天然CBM已经被里氏木霉内切葡聚糖酶I(EGI/Cel7B)的CBM或里氏木霉纤维二糖水解酶I(CHBI/Cel7A)的CBM替代，优选所产生的融合蛋白包含具有SEQ ID NO:23(EG_A+EGI-CBM)或SEQ ID NO:27(EG_A+CHBI-CBM)的氨基酸序列(表2)。
在SEQ ID NO:8中公开的本发明多肽并不天然地含有CBM和连接子。在本发明的一个实施方式中，该多肽可通过例如来自木霉属或毛壳菌属物种的、优选来自里氏木霉的连接子和CBM区域连接。在优选的实施方式中，里氏木霉EGI/Cel7B或里氏木霉CHBI/Cel7A的连接子和CBM已经遗传性连接到内切葡聚糖酶EG_B，且优选所产生的融合蛋白包含具有SEQ ID NO:24(EG_B+EGI-CBM)或SEQ ID NO:28(EG_B+CHBI-CBM)的氨基酸序列(表2)。
表2.本发明的EG+CBM重组融合蛋白
此外，在本发明的范围内，重组融合蛋白包含如下的氨基酸序列，其与SEQ ID NO:23(EG_A+EGI-CBM)或SEQ ID NO:27(EG_A+CHBI-CBM)具有至少55％的序列同一性或与SEQ ID NO:24 (EG_B+EGI-CBM)或SEQ ID NO:28(EG_B+CHBI-CBM)具有至少64％的序列同一性。根据本发明的一个实施方式，所述融合蛋白包含如下的氨基酸序列，其与SEQ ID NO:23或27具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性或与SEQ ID NO:24或28或与其酶活性片段具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
本发明的EG/Cel7内切葡聚糖酶可在没有信号序列和/或CBM的情况下使用，或者所述信号序列和/或CBM可来源于上述微生物或不同微生物的不同酶或者可合成或重组地并入上述酶的催化域中。
本发明涉及新型多核苷酸，其可包含SEQ ID NO:5或6的核苷酸序列或编码如上定义的新型多肽的序列，包括其互补链。本文使用的“多核苷酸”是指RNA和DNA两者，且其可为单链或双链的。此外，所述多核苷酸可由于遗传密码子而与如上定义的序列中的任一个具有简并性。这意味着不同的密码子可编码相同的氨基酸。
本发明的一个实施方式为EG/Cel7内切葡聚糖酶，其由在SEQ ID NO:21、22、25或26中包括的多核苷酸序列编码。
所述多核苷酸也可为所述多核苷酸的片段，其包含至少17个核苷酸，优选至少20、30、40或50个核苷酸。根据本发明的一个实施方式，所述多核苷酸具有作为NO 1、2、9、10、13或14提出的序列。
根据本发明的另一实施方式，所述多核苷酸包含与在具有保藏编号DSM 25492、DSM 25493、DSM 25657、DSM 25658、DSM 25655或DSM 25656的微生物中包含的基因类似的基因(表1、表2)。
本发明的EG/Cel7内切葡聚糖酶可由包含所述核酸分子的重组表达“载体”生成，其编码如上表征的内切葡聚糖酶，可操作地连接到 如下的调控序列，其能够指导(direct)编码所述内切葡聚糖酶的基因在合适宿主中的表达。所述调控序列可与生产生物体同源或异源，或它们可来源于生物体，从该生物体中分离编码本发明的内切葡聚糖酶多肽的基因。所述表达载体还可包含用于选择转化体菌株的标记基因或选择标记物可通过在另一载体构建中共转化而引入宿主中。
生产“宿主”可为能够表达纤维素分解酶的任何同源或异源生物体。优选地，所述宿主为微生物细胞，更优选为真菌。最优选地，所述宿主为丝状真菌。用于生成纤维素分解酶的优选宿主特别是来自木霉属或曲霉属的菌株。优选地，将重组宿主改性以使表达并分泌纤维素分解酶作为其主要活性或其主要活性之一。这可通过缺失编码主要的同源分泌酶例如木霉属的四种主要纤维素酶的基因和通过将异源基因整合到具有高表达和生产水平的基座来完成。
本发明还涉及用于生成具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，和在能够表达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞，和任选回收和纯化所述多肽。所述生产培养基可为适合生长宿主生物体且含有用于有效表达的诱发物的培养基。
本发明的多肽可被分离，在本发明的上下文中，其仅简单地指已经从含有所述多肽的培养基中除去细胞或细胞碎片。方便地，例如通过将阴离子和/或阳离子聚合物(絮凝剂)加到耗尽培养基中以增强细胞和细胞碎片的沉淀来分离所述多肽。随后使用无机过滤剂和过滤器过滤所述培养基以除去所形成的沉淀物。此后，将滤液使用半透膜进一步加工以除去过量的盐、糖和代谢产物。也可通过结晶纯化或浓缩所述多肽。
通过本发明的方法获得的新型EG/Cel7多肽可为酶制剂的组分。术语“酶制剂”表示包含在此所述的新型多肽中的至少一种的组合物。 在所述酶制剂中的多肽可为如下的重组蛋白，其具有内切葡聚糖酶活性和包含如下的氨基酸序列，所述氨基酸序列与具有SEQ ID NO:7的EG_A具有至少57％的序列同一性或与具有SEQ ID NO:8的EG_B具有至少58％的序列同一性。在一个实施方式中，所述酶制剂包含如下的多肽，所述多肽为与SEQ ID NO:23(EG_A+EGI-CBM)或SEQ ID NO:27(EG_A+CHBI-CBM)具有至少55％的序列同一性或与SEQ ID NO:24(EG_B+EGI-CBM)或SEQ ID NO:28(EG_B+CHBI-CBM)具有至少64％的序列同一性的重组融合蛋白。根据本发明的一个实施方式，所述酶制剂包含如下的多肽，其与SEQ ID NO:23或27具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性或与SEQ ID NO:24或28或与其酶活性片段具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。优选地，所述酶制剂至少包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和任选的木聚糖酶。
所述酶制剂还可包含至少一种选自以下的另外的酶：纤维二糖水解酶，内切葡聚糖酶，β-葡糖苷酶，β-葡聚糖酶，木葡聚糖酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，甘露聚糖酶，β-甘露糖苷酶，α-葡糖苷酸酶，乙酰基木聚糖酯酶，α-阿拉伯呋喃糖苷酶，α-半乳糖苷酶，果胶酶，其涉及内切-α-L-阿拉伯糖酶和外切-α-L-阿拉伯糖酶，内切-半乳糖醛酸酶和外切-半乳糖醛酸酶，内切果胶裂解酶，果胶酸酯裂解酶和果胶脂酶，苯酚酯酶，涉及木质素过氧化物酶的木质酶，锰依赖性过氧化物酶，H2O2-产生酶，和有或没有介体的漆酶。所述酶制剂可含有这些酶和本发明的EG/Cel7内切葡聚糖酶的任意组合，但所述酶不限于在此描述的那些。它们例如还可为市售的酶制剂。
所述酶制剂可以处于液体、粉末或颗粒的形式。其可为含有一种或多种纤维素分解酶的滤液。优选地，所述酶制剂为耗尽培养基。“耗尽培养基”(spent culture medium)是指宿主的包含所生成酶的培养基。优选地，在生产之后将宿主细胞从所述培养基中分离。所述酶制剂或组合物也可为任选在没有任何生物质分离、下游加工或纯化所要的纤 维素分解酶的情况下使生产宿主或微生物失活之后获得的“全培养肉汤(whole culture broth)”。在加强的生物方法中，所述酶组合物或所述酶组合物中的至少一些酶可通过有发酵力的微生物生成。
所述酶制剂可含有处于至少部分地纯化或分离的形式的酶。其甚至可以基本上由一种或多种想要的酶组成。有或没有宿主细胞的培养基可在不进一步纯化的情况下本身用作酶制剂，因为内切葡聚糖酶蛋白可分泌到培养基中，且它们在耗尽培养基的环境条件下显示出活性。
除了所述内切葡聚糖酶蛋白之外，本发明的酶制剂还可含有添加剂，诸如介体、稳定剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂和/或培养基组分。优选的添加剂是那些为特定应用准备的酶制剂中常用的添加剂。
在本申请的处理纤维素材料的方法中，使所述纤维素材料与本发明的EG/Cel7内切葡聚糖酶或包含所述内切葡聚糖酶的酶制剂反应，由此获得至少部分地水解的纤维素材料。所述酶以酶有效量同时例如以酶混合物形式或依次加入，或通过发酵的微生物生成，或作为这些方法的组合。
本发明的EG/Cel7内切葡聚糖酶能够在中等温度至高温下水解纤维素材料。在本发明的上下文中的术语“中等温度”或“常规温度”是指在纤维素水解中常用且对应于在所述方法中使用的酶的最适宜温度或热稳定性的温度。因此，这些术语是指30℃～45℃的温度范围。术语“高温(elevated temperature)”或“高温(high temperature)”是指45℃～70℃的温度范围。在短期的水解方法中，酶甚至可在高达80℃下有效。在这样的高温范围下具有活性或稳定的酶也称作“热稳定的”或“嗜热的”酶。本发明的内切葡聚糖酶优选在35℃～60℃的温度下使用。更优选地，它们在37℃～55℃的温度下使用，最优选在45℃～55℃的温度下使用。
与含有常规里氏木霉内切葡聚糖酶EGI/Cel7B的酶混合物相比较，本发明的EG/Cel7内切葡聚糖酶在中等温度和高温两者下显示改进的水解结果。可使用不同的酶混合物和组合来适应不同的工艺条件。已知高温增强在纤维素或木质纤维素材料中存在的结晶纤维素的水解，因此降低在水解中需要的酶的总量或降低所需的水解时间。并且，因为在高温下，木质纤维素底物的粘度减小，所以使得热稳定酶可以在较高固体荷载下工作并节约投资成本。
在高温下特别改进的结果可在使用包含与SEQ ID NO:7具有至少57％的序列同一性的重组内切葡聚糖酶EG_A的酶制剂时获得。在本发明的一个优选的实施方式中，所述酶制剂包含嗜热枝顶孢菌纤维二糖水解酶CBHI/Cel7A、嗜热枝顶孢菌纤维二糖水解酶CBHII/Cel6A、耐热子囊菌内切葡聚糖酶EGII/Cel5A、嗜热枝顶孢菌β-葡糖苷酶βG/Cel3A、耐热子囊菌木聚糖酶Xyn10A和本发明的内切葡聚糖酶EG_A。
在本发明的一个实施方式中，所述酶制剂包含具有SEQ ID NO:23、24、27或28的重组EG_A或EG_B融合蛋白。在用这些内切葡聚糖酶的情况下，还在中等温度和高温下在高干物质条件下获得改进的水解结果。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述酶制剂包含纤维二糖水解酶CBHI/Cel7A、纤维二糖水解酶CBHII/Cel6A、内切葡聚糖酶EGII/Cel5A、β-葡糖苷酶βG/Cel3A、木聚糖酶Xyn10A和包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的内切葡聚糖酶融合蛋白。
在本发明的另一优选的实施方式中，所述酶制剂包含纤维二糖水解酶CBHI/Cel7A、纤维二糖水解酶CBHII/Cel6A、内切葡聚糖酶EGII/Cel5A、β-葡糖苷酶βG/Cel3A、木聚糖酶Xyn10A和包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的内切葡聚糖酶融合蛋白。
在另一优选的实施方式中，所述酶制剂包含纤维二糖水解酶CBHI/Cel7A、纤维二糖水解酶CBHII/Cel6A、内切葡聚糖酶EGII/Cel5A、β-葡糖苷酶βG/Cel3A、木聚糖酶Xyn10A和包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的内切葡聚糖酶融合蛋白。
如本领域普通技术人员所将理解的，在水解中可使用任意量的纤维素材料。本文使用的术语“干物质”是指纤维素材料的可溶性和不溶性的固体两者的总量。纤维素材料的水解可在低干物质条件下进行，其中低干物质为<15％。在其它实施方式中，酶水解可在高干物质含量下优选在>15％干物质下进行。
用本发明的内切葡聚糖酶处理纤维素材料的方法特别适合由木质纤维素材料生产可发酵糖。所述可发酵糖随后可通过酵母菌发酵成乙醇，且作为燃料使用。它们也可用作中间体或原料在例如所谓的生物精炼中用于生产化学工业工艺的各种化学品或结构单元。可将所述木质纤维素材料在酶水解之前预处理以破坏纤维素底物的纤维结构并使得纤维素成分更易于被纤维素分解酶处理。当前的预处理包括机械、化学或热加工及其组合。所述材料例如可通过蒸汽闪爆或酸解预处理。
所述新型EG/Cel7内切葡聚糖酶可应用于涉及纤维素分解酶的任何过程中，诸如用于生物燃料、生物质水解、淀粉、纺织、清洁剂、纸浆和纸、食品、饲料或饮料工业中，特别用于水解纤维素材料以生产包含乙醇的生物燃料。在纸张造纸工业中，它们可用来例如在处理硫酸盐纸浆、机械纸浆或再生纸中对纤维素纤维进行改性。
具体实施方式
通过以下非限制性实施例描述本发明。本领域普通技术人员将清楚地得出，随着技术发展，本发明的构思能够以多种方式实施。本发明及其实施方式不限于所描述的实施例，而是可在权利要求书的范围 内变化。
实施例
实施例1.内切葡聚糖酶(cel7/egl)基因的克隆
在大肠杆菌转化、测序等中，使用标准分子生物学方法对DNA进行分离和酶处理(例如，分离质粒DNA、消化DNA以生成DNA片段)。所使用的基本方法如由酶、试剂或试剂盒生产商所述的，或如在标准分子生物学手册例如Sambrook和Russell(2001)中所述的。如由Raeder和Broda(1985)所详细地描述的，进行基因组DNA的分离。
在从Roal Oy(罗尔公司)菌种保藏的几种菌株中筛选之后，选择一种嗜热真菌菌株用于克隆。用于克隆来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245的cel7/egl基因(egl_A和egl_B)的探针通过PCR合成。以GH家族7内切葡聚糖酶(EGI)蛋白的先前公开的氨基酸序列的比对为基础来设计简并寡核苷酸。引物的序列示于表3中(SEQ ID NO:1～2)。
表3.作为PCR引物的寡聚核苷酸，其用以扩增探针以从嗜热枝顶孢菌ALKO4245筛选egl基因
(aN＝A或G或T或C，Y＝T或C，R＝A或G，S＝G或C，W＝A或T；在括号中的“s”＝有义链，在括号中的“as”＝反义链。
在反应中，使用基因组DNA作为模板，使用在表3中所述的引物， 通过PCR对探针进行扩增。嗜热枝顶孢菌ALKO4245的PCR混合物含有用于Dynazyme DNA聚合酶的1×F-511缓冲液(Finnzymes，芬兰)、0.2mM Mix(Fermentas，芬兰)、1μM的每种引物、3％DMSO(Finnzymes，芬兰)、2～4单位的F-501L Dynazyme II DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)和1～2μg的相应基因组DNA。PCR反应的条件如下：在95℃下初始变性5分钟，接着进行28次循环的95℃下变性1分钟，在50℃下退火30秒、在72℃下延长30秒和在72℃下最后延长5分钟。
在表3中描述的引物组合生成具有预期大小的特异性DNA产物(根据基于公布的cel7/egl序列进行的计算)。根据制造商的说明书(Invitrogen,USA)，从PCR反应混合物中分离并纯化DNA产物并克隆到载体中。插入片段通过测序和通过对几种限制酶消化的基因组DNA进行南方印迹杂交来进行表征。在表4中呈现选作探针的PCR片段，该探针用于从嗜热枝顶孢菌ALKO4245菌株中的基因克隆。
表4.PCR反应中使用的引物，选定用于筛选来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245的egl基因的探针。显示基因组模板DNA和含有探针片段的质粒的名称。
从这两种PCR片段推导的氨基酸序列与所公布的EG/Cel7B序列(BLAST程序，2.2.9版，美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information))具有相似性。
用几种限制酶消化嗜热枝顶孢菌ALKO4245基因组DNA以进行南方印迹分析。用于杂交的探针为566bp(SEQ ID NO:3，基因egl_A)和431bp(SEQ ID NO:4，基因egl_B)EcoRI片段，分别从质粒pALK2698和pALK2699切割。上述探针根据供应商的说明书(罗氏，德国)通过使用异羟基洋地黄毒甙元(digoxigenin)进行标记。在65℃下进行杂交过夜。在杂交之后，将过滤器在室温下使用2×SSC-0.1％洗涤2×5分钟，接着在65℃下使用0.1×SSC-0.1％SDS洗涤2×15分钟。包含质粒pALK2698的大肠杆菌菌株RF8831和包含质粒pALK2699的大肠杆菌菌株RF8832分别在保藏编号DSM 25490和DSM 25491下保藏于DSM菌种库中。
从嗜热枝顶孢菌ALKO4245的基因组DNA中，大约6.6kb的HindIII-消化的片段使用来自pALK2698的异羟基洋地黄毒甙元-标记的566bp EcoRI片段作为探针进行杂交。相应地，约9.5kb的EcoRI-消化的片段用也来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245的基因组DNA的pALK2699的异羟基洋地黄毒甙元-标记的431bp EcoRI片段进行杂交。杂交基因组DNA片段基于它们的大小从消化的基因组片段的库中分离。基因组片段从琼脂糖凝胶中分离并克隆到pBluescript II KS+(Stratagene，USA)载体，将这些载体用HindIII(基因A)或EcoRI(基因B)分离。将接合混合物转化到大肠杆菌XL10-Gold细胞(Stratagene)并涂在含有50～100μg/ml氨苄西林的LB(Luria-Bertani)板上。在与上述南方印迹分析相对应的杂交条件下用pALK2698和pALK2699插入片段作为探针采用克隆杂交来筛选大肠杆菌菌落的阳性克隆。从板上收集几个阳性克隆。据显示，它们通过限制性消化以包含预期大小的插入片段。编码嗜热枝顶孢菌ALKO4245EG_A(egl_A,SEQ ID NO:5)的全长基因从6.6kb HindIII插入片段测序且将含有该插入片段的质粒命名为pALK3152。包含质粒pALK3152的大肠杆菌菌株RF8939被保藏于DSM菌种库中，保藏编号为DSM 25492。将编码嗜热枝顶孢菌ALKO4245蛋白A的基因命名为egl_A。相应地，编码另一嗜热枝顶孢菌ALKO4245EG_B(egl_B.SEQ ID NO:6)的全长基因从9.5kb EcoRI 插入片段测序且将含有该插入片段的质粒命名为pALK3153。包含质粒pALK3153的大肠杆菌菌株RF8974被保藏于DSM菌种库中，保藏编号为DSM 25493。将编码嗜热枝顶孢菌ALKO4245蛋白B的基因命名为egl_B。基因和推导的蛋白序列(SEQ ID NO:5～8)的相关信息分别汇总在表5和表6中。
表5.从嗜热枝顶孢菌ALKO4245中分离的egl基因的汇总
(a包括终止(STOP)密码子。
(b不包括终止密码子。
表6.从来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245的egl基因序列推导的氨基酸序列的汇总
(a使用程序SignalP v3.0,NN/HMM(Nielsen等，1997；Nielsen & Krogh,1998；Bendtsen等，2004)对信号序列进行预测。
(b纤维素结合模块(CBM)和连接子区域，指示连接子-CBM区域的氨基酸[编号中包括M1(Met#1)]。
(c未包括预测的信号序列。使用用于Windows的Clone Manager 9版，Sci-Ed软件进行预测。
表7显示从嗜热枝顶孢菌ALKO4245推导的EG序列与数据库的比较。
表7.与从嗜热枝顶孢菌ALKO4245推导的EG_A和EG_B氨基酸序列具有最高同一性的序列。比对包括信号序列的全长氨基酸序列。在http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/和http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/上使用FASTA(EMBL-EBI、FASTA-蛋白相似性搜索、UniProt知识库+NR专利蛋白水平-1、BLOSUM50、Gap open-10、Gap extend-2)和EMBOSS Needle(EMBL-EBI,EMBOSS-Needle-成对序列比对,BLOSUM50,Gap open 10,Gap extend 0.5)进行数据库搜索以确定同一性程度。
实施例2.在里氏木霉中的重组EG/Cel7蛋白的生成
构建表达质粒，以便由在里氏木霉中的嗜热枝顶孢菌ALKO4245生成重组EG/Cel7(EG_A和EG_B)蛋白。构建的表达质粒列在表8中。 重组cel7/egl基因(egl_A和egl_B)(包括其自身的信号序列)通过PCR融合到里氏木霉cel7A/cbh1启动子。通过里氏木霉cel7A/cbh1终止子确保转录终止且使用构巢曲霉amdS标记基因来选择转化体，如在Paloheimo等(2003)中所述的。在NotI消化之后从载体骨架分离线性表达组件(图1)且将其转化到里氏木霉原生质体。所使用的宿主菌株不会生成四种主要里氏木霉纤维素酶(CBHI、CBHII、EGI、EGII)中的任一种。按照在等(1987)中描述的和在Karhunen等(1993)中描述的改进进行转化，选择乙酰胺作为唯一的氮源(amdS标记基因)。转化体在PD上形成孢子之前透过单一的分生孢子在筛选盘上进行纯化。
表8.构建表达组件以由在里氏木霉中的嗜热枝顶孢菌ALKO4245生成EG_A和EG_B重组蛋白。表达组件的总体结构如在图1中描述。
内切葡聚糖酶(Cel7)蛋白表达质粒表达组件(a
EG_ApALK31566.9kb NotI
EG_BpALK31576.5kb NotI
(a用于里氏木霉转化的表达组件通过使用NotI消化从载体骨架分离。
转化体的EG/Cel7生产从摇瓶培养中的培养上清液进行分析。转化体从PD斜面接种到含有50ml的用5％KH2PO4缓冲的复合乳糖基纤维素酶诱发培养基(Joutsjoki等1993)的摇瓶中。转化体的EG/Cel7蛋白生产从转化体在30℃、250rpm下生长7天之后的培养上清液中进行分析。重组蛋白的异源生产通过SDS-PAGE及随后的考马斯染色(Coomassie staining)进行分析。所选转化体的基因型通过使用其中包括几种基因组消化物的南方印迹分析来确认且将相应的表达组件用作探针。
选择最佳生产转化体以在试验室规模的生物反应器中培养。转化 体在试验室生物反应器中在28℃下在纤维素酶诱发的复合培养基中控制pH在4.2±0.2(NH3/H3PO4)下培养3～4天，以获得用于应用测试的材料。上清液通过离心回收并经EK过滤器(Pall SeitzSchenk Filtersystems股份有限公司，巴特克罗伊茨纳赫，德国)过滤。
实施例3.在里氏木霉中重组嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG+里氏木霉CBM融合蛋白的生成
将嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG/Cel7_A(EG_A)的非典型连接子和CBM区域除去且将该蛋白的核心区域融合到里氏木霉EGI/Cel7B(＝EGI-CBM)的连接子和CBM。也将嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG_B融合到里氏木霉EGI/Cel7B的连接子和CBM。为此目的，EG_A和EG_B的核心区域的编码序列和里氏木霉EGI/Cel7B的连接子和CBM的编码序列使用以下引物通过PCR合成：
SEQ ID NO:9(EG_A核引物的正向序列)
SEQ ID NO:10(EG_A核引物的反向序列)
SEQ ID NO:11(EGI-CBM引物的正向序列)
SEQ ID NO:12(EGI-CBM引物的反向序列)
SEQ ID NO:13(EG_B引物的正向序列)
SEQ ID NO:14(EG_B引物的反向序列)
SEQ ID NO:15(EGI-CBM引物的正向序列)
SEQ ID NO:16(EGI-CBM引物的反向序列)。
用于合成编码EG_A核的DNA序列的PCR反应混合物含有1×Phusion HF反应缓冲液(Finnzymes，芬兰)、7.5mM MgCl2、0.2mM dNTPs、1μM的各种引物、3％DMSO、4单位的Phusion DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)和大约50ng/200μl的含有来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245的全长egl_A基因的模板DNA。PCR反应的条件如下：在98℃下初始变性30秒，接着进行24次循环的98℃下变性10秒，在52.5℃(±7.5℃梯度)下退火30秒，在72℃下延长30秒且在72℃下最终延长7分钟。在PCR反应中的特异性DNA片段在45℃～60℃的退火 温度下获得。在嗜热枝顶孢菌ALKO4245 egl_A的合成核片段制造相容性限制位点以便融合到里氏木霉cel7/egl1连接子-CBM区域并接合表达载体。
用于合成编码EG_B和EGI-CBM的DNA序列的PCR反应混合物含有用于Dynazyme DNA聚合酶的1×F-511缓冲液(Finnzymes，芬兰)、0.2mM dNTP Mix(Fermentas，芬兰)、1μM的各种引物、3％DMSO(Finnzymes，芬兰)、2～4单位的F-501L Dynazyme II DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)和大约50ng/200μl的含有来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245的全长egl_B基因和来自里氏木霉的全长cel7/egl1基因的模板DNA。PCR反应的条件如下：在95℃下初始变性5分钟，接着进行28次循环的95℃下变性1分钟，在52.5℃(±7.5℃梯度)下退火30秒，在72℃下延长30秒且在72℃下最终延长5分钟。在PCR反应中的特异性DNA片段在45℃～60℃的退火温度范围内获得。通过上述引物组合制造的片段随后用相容性限制酶消化且接合在一起。通过PCR、引物组合和相容性限制酶扩增的片段描述在表9中。
表9.从嗜热枝顶孢菌ALKO4245egl_A和egl_B和从里氏木霉egl1全长基因扩增的PCR片段
新产生的片段随后被进一步接合到表达载体中。在表达质粒中的PCR扩增片段通过测序(对于egl_A核，SEQ ID NO:17；对于egl_B核，SEQ ID NO:18；对于egl1-CBM，SEQ ID NO:19；对于egl1-CBM，SEQ ID NO:20；对于egl_A+egl1-CBM，SEQ ID NO:21；和对于EG_A+EGI-CBM，SEQ ID NO:23；对于egl_B+egl1-CBM，SEQ ID NO:22；和对于EG_B+EGI-CBM，SEQ ID NO:24)确认。融合基因也进一步克隆到pBluescript II KS+载体中，以便本专利保藏在如下保藏编号下保藏到DSM菌种库中：DSM25657＝包括含有融合基因egl_A+egl1-CBM的质粒pALK3179的大肠杆菌菌株RF10076；DSM25658＝包括含有融合基因egl_B+egl1-CBM的质粒pALK3180的大肠杆菌菌株RF10077。
嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG_A和EG_B也与里氏木霉CBHI/Cel7A的连接子和CBM(＝CBHI-CBM)融合。egl+cbh1-CBM融合基因以这样的方式设计：使得嗜热枝顶孢菌ALKO4245 egl_A的非典型连接子和CBM区域将被除去且剩余的核心区域将与里氏木霉cel7A/cbh1的连接子和CBM区域(＝cbh1-CBM)融合。里氏木霉cel7A/cbh1连接子和CBM区域将与嗜热枝顶孢菌cel7/egl_B直接融合，因为其不含天然CBM。作为合成构造订购融合基因(来自GenScript,USA)。在质粒中的合成融合基因通过测序(对于egl_A+cbh1-CBM，SEQ ID NO:25；对于egl_B+cbh1-CBM，SEQ ID NO:26；对于EG_A+CBHI-CBM，SEQ ID NO:27；和对于EG_B+CBHI-CBM，SEQ ID NO:28)确认。包括在pUC57中含有融合基因egl_A+cbh1-CBM的质粒pALK3167的大肠杆菌菌株RF9587和包括在pUC57中含有融合基因egl_B+cbh1-CBM的质粒pALK3168的RF9588分别以保藏编号DSM 25655和DSM 25656保藏在DSM菌种库。
构建表达质粒以生成重组EG+EGI-CBM(EG_A+EGI-CBM和EG_B+EGI-CBM)和EG+CBHI-CBM(EG_A+CBHI-CBM和EG_B+CBHI-CBM)融合蛋白(SEQ ID NO:23～24和27～28对应核酸 SEQ ID NO:21、22和25～26)。构建的表达质粒列在表10中。构建的egl_A+egl1-CBM、egl_B+egl1-CBM、egl_A+cbh1-CBM和egl_B+cbh1-CBM融合基因在表达质粒中与里氏木霉cbh1(cel7A)启动子融合。通过里氏木霉cel7A终止子确保转录终止且使用构巢曲霉amdS标记基因来选择转化体，如在Paloheimo等(2003)中所描述的。在NotI消化之后从载体骨架分离线性表达组件(图1)且将其转化到里氏木霉原生质体。所使用的宿主菌株不会生成四种主要里氏木霉纤维素酶(CBHI、CBHII、EGI、EGII)中的任一种。按照在等(1987)中描述的和在Karhunen等(1993)描述的改进进行转化，选择乙酰胺作为唯一的氮源(amdS标记基因)。转化体在PD上形成孢子之前透过单一的分生孢子在筛选盘上进行纯化。
表10.构建表达组件以在里氏木霉中生成EG+CBM融合蛋白。表达组件的总体结构如在图1中描述。
融合蛋白表达质粒表达组件(a
EG_A+EGI-CBMpALK31586.9 NotI
EG_B+EGI-CBMpALK31596.7 NotI
EG_A+CBHI-CBMpALK31616.9 NotI
EG_B+CBHI-CBMpALK31626.7 NotI
(a用于里氏木霉转化的表达组件通过使用NotI消化从载体骨架分离。
转化体的EG+CBM融合蛋白生产从摇瓶培养的培养上清液进行分析。转化体从PD斜面接种到含有50ml的用5％KH2PO4缓冲的复杂乳糖基纤维素酶诱发的培养基(Joutsjoki等1993)的摇瓶中。转化体的EG+CBM融合蛋白生产从转化体在30℃、250rpm下生长7天后的培养上清液中进行分析。重组蛋白的异源生产通过SDS-PAGE及随后的考马斯染色进行分析。所选转化体的基因型通过使用其中包括几种基因组消化物的南方印迹分析来确认且将相应的表达组件用作探针。
选择最佳生产转化体以在试验室规模的生物反应器中培养。转化体在试验室生物反应器中在28℃下在纤维素酶诱发的复杂培养基中控制pH在4.2±0.2(NH3/H3PO4)下培育3～4天，以获得用于应用测试的材料。上清液通过离心回收并经EK过滤器(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH，巴特克罗伊茨纳赫，德国)过滤。
实施例4.用包含重组EG/Cel7和EG/Cel7+CBM内切葡聚糖酶的酶制剂水解玉米纤维底物
将蒸汽闪爆的玉米纤维悬浮在0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.8)中。水解混合物的最后重量为1g，其中总固体浓度为5％(w/w)或17％(w/w)。在2ml反应试管中使用不同的酶混合物以0.5mg蛋白/g固体总量的剂量水解底物。使用具有牛血清蛋白(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))作为标准物的Pierce BCA测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测定酶组分的蛋白含量。将反应试管在来自GFL的在不同温度下调节的线性振荡水浴1086中摇动。对于各取样点，从一样的反应试管中取出0.5ml样品并离心，将上清液沸腾20分钟以终止酶水解，且分析来自该水解的反应产物。制备具有不同EG/Cel7代替物的7种单独的混合物组合(基础混合物：混合物1；混合物1_EG_A和混合物1_EG_B；混合物1_EG_A+EGI-CBM；混合物1_EG_B+EGI-CBM；混合物1_EG_A+CBHI-CBM；和混合物1_EG_B+CBHI-CBM)。
使用以下组分制备不同纤维素酶的基础混合物：
含有重组里氏木霉EGI/Cel7B的嗜温EGI/Cel7B制剂。
含有重组嗜热枝顶孢菌ALKO4245 CBHI/Cel7A(WO2007071818)的CBHI/Cel7A制剂。
含有重组嗜热枝顶孢菌ALKO4245 CBHII/Cel6A(WO2011080317)的CBHII/Cel6A制剂。
含有具有遗传性连接的里氏木霉EGII/Cel5A的CBM的重组耐热子囊菌ALKO4242EGII/Cel5A(WO2007071818)的EGII/Cel5A制剂。
含有嗜热枝顶孢菌ALKO4245β-葡糖苷酶/Cel3A(WO2007071818) 的β-葡糖苷酶制剂。
含有耐热子囊菌ALKO4242 Xyn10A木聚糖酶(WO2007071818)的木聚糖酶制剂。
所有纤维素酶在不具有纤维素酶背景的里氏木霉宿主菌株中作为单组分异源地生成(编码四种主要纤维素酶CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B和EGII/Cel5A的基因缺失)。在该混合物中使用粗培养上清液。将酶组分按如下组合以制备基础混合物：纤维二糖水解酶CBHI/Cel7A制剂60％、纤维二糖水解酶CBHII/Cel6A制剂15％、内切葡聚糖酶EGII/Cel5A制剂10％、内切葡聚糖酶EGI/Cel7B制剂8％、β-葡糖苷酶βG/Cel3A制剂4％和木聚糖酶Xyn10A制剂3％。该酶混合物被称为混合物1。
为了测试EG内切葡聚糖酶在使用混合物1的水解中的性能，将混合物1的8％的EGI/Cel7B内切葡聚糖酶组分用以下替代：
含有重组嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG_A的EG/Cel7制剂或
含有重组嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG_B的EG/Cel7制剂。含有嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG/Cel7蛋白EG_A或EG_B的混合物被分别称为混合物1_EG_A和混合物1_EG_B。
为了测试EG+CBM融合蛋白在使用混合物1的水解中的性能，将混合物1的8％的EGI/Cel7内切葡聚糖酶组分用以下替代：
含有遗传性融合到里氏木霉EGI-CBM的重组嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG_A(EG_A+EGI-CBM)的EG+CBM制剂或
含有遗传性融合到里氏木霉EGI-CBM的重组嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG_B(EG_B+EGI-CBM)的EG+CBM制剂或
含有遗传性融合到里氏木霉CBHI-CBM的重组嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG_A(EG_A+CBHI-CBM)的EG+CBM制剂或
含有遗传性融合到里氏木霉CBHI-CBM的重组嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG_B(EG_B+CBHI-CBM)的EG+CBM制剂。
含有融合蛋白EG_A+EGI-CBM、EG_B+EGI-CBM、EG_A+CBHI-CBM或EG_B+CBHI-CBM的混合物被分别称为混合物1_EG_A+EGI-CBM、混合物1_EG_B+EGI-CBM、混合物1_EG_A+CBHI-CBM和混合物1_EG_B+CBHI-CBM。
对于所有这些混合物，在37℃和55℃下进行水解。在48小时后从水解中取样，通过HPLC定量并确定葡萄糖的浓度(图2)。
结果显示，混合物1_EG_A和混合物1_EG_B在37℃下在高(17％)干物质含量下具有更好的性能。发现与混合物1相比较，混合物1_EG_A使从玉米纤维底物释放的葡萄糖的量增加9％；混合物1_EG_B使从玉米纤维底物释放的葡萄糖的量增加7％(图2A)。发现与酶混合物混合物1相比较，在55℃和高干物质含量下，混合物1_EG_A使葡萄糖产率增加34％(图2B)。
对于EG+EGI-CBM(EG_A+EGI-CBM和EG_B+EGI-CBM)融合蛋白，结果显示，在37℃下在低(5％)干物质条件下混合物1_EG_A+EGI-CBM和混合物1_EG_B+EGI-CBM具有更好的性能。发现与混合物1相比较，混合物1_EG_A+EGI-CBM使从玉米纤维底物释放的葡萄糖量增加30％，且混合物1_EG_B+EGI-CBM使从玉米纤维底物释放的葡萄糖量增加35％(图3A)。发现与酶混合物混合物1相比较，在高干物质条件下，在37℃和55℃两种温度下，混合物1_EG_B+EGI-CBM混合物使葡萄糖产率增加7％(图3B和图3C)。
对于EG+CBHI-CBM(EG_A+CBHI-CBM和EG_B+CBHI-CBM)融合蛋白，结果显示，在37℃下在低干物质条件和高干物质条件两者下，混合物1_EG_A+CBHI-CBM和混合物1_EG_B+CBHI-CBM具有更好的性能。发现与混合物1相比较，在低干物质条件下混合物1_EG_A+CBHI-CBM使从玉米纤维底物释放的葡萄糖量增加22％，而 高干物质条件下，其使从玉米纤维基质释放的葡萄糖量增加5％；且在低干物质条件下混合物1_EG_B+CBHI-CBM使从玉米纤维底物释放的葡萄糖量增加8％，而在高干物质条件下，其使从玉米纤维底物释放的葡萄糖量增加5％(图4A和图4B)。发现与混合物1相比较，在55℃和高干物质含量下，混合物1_EG_B+CBHI-CBM使葡萄糖产率增加4％(图4C)。
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