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1、(10)申请公布号 CN 103329939 A (43)申请公布日 2013.10.02 CN 103329939 A *CN103329939A* (21)申请号 201310286744.X (22)申请日 2013.07.10 A01N 63/02(2006.01) A01P 21/00(2006.01) C12P 17/18(2006.01) C12P 13/00(2006.01) C12R 1/465(2006.01) C12R 1/56(2006.01) (71)申请人 唐睿 地址 571100 海南省海口市龙昆南路隆基大 厦 A 座 10 层海南博士威农用化学有限 公司 (72。
2、)发明人 任承才 唐睿 韩铁冰 吴景霄 杨照东 莫秋菊 (54) 发明名称 复合氨基酸嘌呤母液 - 年年乐的复合发酵配 方与工艺 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 一 种 用 三 株 放 线 菌 细 黄 链 霉 菌 Streptomyces microflavus、浅 黄 链 霉 菌 Streptomyces flaveolus 和 淡 紫 灰 链 霉 菌 Streptomyces lavendulae， 复合发酵生产 ( 以重 量百分比计 ) 复合氨基酸 0.1 -30、 羟烯腺嘌 呤 0.1mg-30mg/g 和烯腺嘌呤 0.1-30mg/g 母液的 工艺及配方。 (51)Int.Cl.。
3、 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103329939 A CN 103329939 A *CN103329939A* 1/1 页 2 1. 一种复合氨基酸嘌呤发酵母液的制备， 其特征在于 ： 复合发酵的三个菌种为放线菌 细黄链霉菌Streptomyces microflavus、 浅黄链霉菌Streptomyces flaveolus和淡紫灰链 霉菌 Streptomyces lavendulae。 2. 权利要求 1 所述的复合氨基酸嘌呤发酵母液的比例， 其特征在于 ： 以重。
4、量百分比计， 氨基酸的含量为 0.1 -30， 羟烯腺嘌呤的含量为 0.1mg/g-30mg/g， 烯腺嘌呤的含量为 0.1mg/g-30mg/g。 3. 权利要求 1 所述的复合氨基酸嘌呤发酵母液的发酵罐营养液配方， 其特征在于 ： 5 -15的玉米粉、 5 -15的豆粉、 3 -8的无水葡萄糖、 3 -8的饴糖、 0.3的甘 油、 0.05 -0.1的 MnSO4 H2O， 另外加入 0.2 -0.5的聚醚改性硅油作为消泡剂， PH 值 6.5-7.2。 权 利 要 求 书 CN 103329939 A 2 1/3 页 3 复合氨基酸嘌呤母液 - 年年乐的复合发酵配方与工艺 技术领域 00。
5、01 本发明涉及一种用三株放线菌细黄链霉菌 Streptomyces microflavus、 浅黄链霉 菌Streptomyces flaveolus和淡紫灰链霉菌Streptomyces lavendulae复合发酵生产(以 重量百分比计 ) 复合氨基酸 0.1 -30、 羟烯腺嘌呤 0.1mg/g-30mg/g 和烯腺嘌呤母液的 工艺及配方。 背景技术 0002 羟烯腺嘌呤和烯腺嘌呤， 属于植物五大内源激素之一的细胞分裂素， 对作物有促 进细胞分裂及生长、 提高作物的产量和品质， 近年来在农业上的应用越来越多。 而羟烯腺嘌 呤和烯腺嘌呤在植物体内的含量很低， 一般都是靠化学合成和从海藻中。
6、提取， 但是工艺复 杂、 产率较低， 生产成本较大， 生产规模不能满足人们在农业生产和生活上的需要。 0003 本发明是以三株放线菌 ACCC40027 细黄链霉菌、 ACCC40822 浅黄链霉菌和 ACCC40024 淡紫灰链霉菌 ( 三菌株均获购于中国农业微生物菌种保藏管理中心 ) 复合发酵 生产氨基酸、 羟烯腺嘌呤和烯腺嘌呤的工艺及配方。本发明解决了目前在微生物发酵生产 细胞分裂素的工艺上， 发酵生产工艺比较落后、 发酵菌种比较单一， 不能很好地利用发酵基 质， 产率较低的问题。 0004 由细黄链霉菌、 浅黄链霉菌和淡紫灰链霉菌复合发酵生产的复合氨基酸、 羟烯腺 嘌呤与烯腺嘌呤， 属。
7、于生物农药领域， 对大田作物、 蔬菜、 水果等经济作物都有显著的增产 效果和改善品质作用， 可以增强植物的抗病性， 特别是对病毒病的抗性， 对粮食、 果蔬类可 以提高 10 -30以上的增产效果， 并具有对人畜比较安全、 不污染环境等有利于生态平 衡的特点。 发明内容 0005 对三株菌种分别进行活化培养， 复合培养基的制备 ( 以下， 本文所引用的百分 比， 皆为重量百分比 ) ： KNO3-1g， K2HPO4-0.5g， NaCl-0.5g， FeSO47H2O-0.01g， 可溶性淀 粉 -20g， MgSO47H2O-0.5g， MnSO4H2O-0.05g， 甘油 -3g， 琼脂 。
8、-20g， 清水补齐至 1000g， pH 值调至 6.5-7.2， 分装三角瓶并经过 121高压灭菌 30 分钟， 取出冷却至 60左右后， 在超洁净工作台上， 于无菌条件下倒入灭过菌的培养皿中， 分别将 ACCC40027 细黄链霉 菌、 ACCC40822 浅黄链霉菌和 ACCC40024 淡紫灰链霉菌转接到复合培养基中， 于温度为 28 -30的恒温培养箱中倒置培养 4-5 天， 然后进行生物测定。 0006 拮抗试验 ： 将 ACCC40027 细黄链霉菌、 ACCC40822 浅黄链霉菌和 ACCC40024 淡紫灰 链霉菌分别两两组合， 在复合培养基上， 将两菌的两点放置相距 3。
9、cm， 每个组合设计 3 个重 复， 进行交叉拮抗试验， 结果表明三者相互之间不存在拮抗， 能够共同生长。 0007 复合氨基酸嘌呤 - 年年乐母液的复合发酵生产 ： 复合培养基的配方为 KNO3-1g， K2HPO4-0.5g， NaCl-0.5g， FeSO47H2O-0.01g，可 溶 性 淀 粉 -20g， MgSO47H2O-0.5g， MnSO4 H2O-0.05g， 甘油 -3g， 加入 0.2的聚醚改性硅油作为消泡剂， pH 值调至 6.5-7.2， 按 说 明 书 CN 103329939 A 3 2/3 页 4 上述配方将复合培养液配制好后， 倒入三角摇瓶中， 经过 121。
10、高压灭菌 30 分钟， 待冷却后 在超净工作台上， 在无菌操作的条件下， 将保存培养的 ACCC40027 细黄链霉菌、 ACCC40822 浅黄链霉菌和 ACCC40024 淡紫灰链霉菌的三个菌株各自配成菌悬液， 分别接种到三角摇瓶 中， 每瓶接种比例为 3 -8， 在 28 -30条件下于摇床上振荡培养 72 小时后， 将三个菌 株的菌液以111的比例混合摇匀， 然后以3-8的比例接种到发酵罐。 振荡培养过 程中用 pH 值调节剂 ( 柠檬酸、 碳酸氢钠 ) 调节培养液的 pH， 使培养液的 pH 保持在 6.5-7.2 之间。 0008 复合氨基酸嘌呤母液的发酵 ： 发酵罐营养液配方为 。
11、5 -15的玉米粉、 5 -15的豆粉、 3 -8的无水葡萄糖、 3 -8的饴糖、 0.3的甘油、 0.05 -0.1的 MnSO4H2O， 另外加入 0.2 -0.5的聚醚改性硅油作为消泡剂， PH 值 6.5-7.2。罐体装料 后在 121， 0.12MPa 下灭菌 30 分钟。冷却至 30左右后将制备好的菌悬液按 3 -8的 比例接种到发酵培养液来， 于培养温度 28 -32， 通气量开始在 1 1.5(v.v.m)， 发酵 24 小时后增至12(v.v.m)， 48小时后降至11.8(v.v.m)。 发酵过程中用pH值调节剂(柠 檬酸、 碳酸氢钠 ) 调节发酵液的 pH， 使发酵液的 。
12、pH 保持在 6.5-7.2 之间。发酵至 72 小时的 时候发酵完毕， 经过镜检 ACCC40027 细黄链霉菌、 ACCC40822 浅黄链霉菌和 ACCC40024 淡紫 灰链霉菌的比例与接种比例相近， 含菌量达到 2.0109个 /g 时为合格的发酵菌液 ； 经高效 液相色谱仪检测， 氨基酸含量达到 0.1 -30、 羟烯腺烯酰嘌呤含量达到 0.1mg/g-30mg/g 时为合格的发酵母液。用 80 目过滤网过滤， 并将发酵完毕的发酵液经过 121灭菌 30 分 钟， 得到本发明的制剂。 具体实施方式 0009 为了更好的理解本发明， 下面用具体的实例来阐述本次发明技术工艺及配方， 但。
13、 不限制本次发明的范围。 0010 实例 1 ： 5复合氨基酸嘌呤母液的制备 ： 复合培养基的配方为 KNO3-1g， K2HPO4-0.5g， NaCl-0.5g， FeSO47H2O-0.01g，可 溶 性 淀 粉 -20g， MgSO47H2O-0.5g， MnSO4H2O-0.05g， 甘油 -3g， 0.2的聚醚改性硅油作为消泡剂， pH 值调至 6.5-7.2， 按上述 配方将复合培养基配制好后， 倒入三角摇瓶中， 经过 121高压灭菌 30 分钟， 待冷却后在超 净工作台上， 在无菌操作的条件下， 将保存培养的 ACCC40027 细黄链霉菌、 ACCC40822 浅黄 链霉菌和。
14、 ACCC40024 淡紫灰链霉菌的三个菌株各自配成菌液， 分别接种到三角摇瓶中， 每 瓶接种比例为 3 -8， 在 28 -30条件下于摇床上振荡培养 72 小时后， 将三个菌株的 菌液以 1 1 1 的比例混合摇匀， 然后以 3 -8的比例接种到发酵罐。 0011 复合母液的发酵 ： 发酵罐营养液配方为 6的玉米粉、 6的豆粉、 3的无水葡萄 糖， 3的饴糖， 0.05的 MnSO4H2O， 0.3的甘油， 另外加入 0.2的聚醚改性硅油作为消 泡剂， PH 值 6.5-7.2。罐体装料后在 121， 0.12MPa 下灭菌 30 分钟。冷却至 30左右后将 制备好的菌悬液按3-8的比例接。
15、种到发酵培养液来 ； 在培养温度28-30， 通气量开 始在 1 1.5(v.v.m)， 培养 24 小时后增至 1 2(v.v.m)， 48 小时后降至 1 1.8(v.v.m)。 发酵至 72 小时的时候发酵完毕， 经过镜检 ACCC40027 细黄链霉菌、 ACCC40822 浅黄链霉菌 和 ACCC40024 淡紫灰链霉菌的比例在 1 1 1 左右， 含菌量达到 2.0109个 /ml 时为合 格的发酵菌液 ； 经高效液相色谱仪检测， 羟烯腺嘌呤含量达到 5.0mg/g， 烯腺嘌呤含量达到 说 明 书 CN 103329939 A 4 3/3 页 5 0.5mg/g时为合格的发酵菌液 。
16、； 氨基酸的含量等于或大于5时也为合格的发酵菌液。 用80 目过滤网过滤， 并将发酵完毕的发酵液经过 121灭菌 30 分钟， 得到本发明的制剂。 0012 将实例1制得的复合母液用于西瓜试验 ： 将复合母液稀释1000倍， 清水作为对照， 每种药剂设计 4 个重复， 于上午 10 点前或下午 4 点后用喷雾器对发病的西瓜的苗期、 花前 期、 花后期及膨果期进行喷施， 试验表明本制剂对西瓜产量的增加达到 23以上。 0013 实例 2 ： 8复合氨基酸嘌呤母液的制备 0014 根据实例 1 的方法， 将发酵罐营养液配方改为为 12的玉米粉、 12的豆粉、 6 的无水葡萄糖， 6的饴糖， 0.0。
17、8的 MnSO4H2O， 0.3的甘油， 另外加入 0.35的聚醚改 性硅油作为消泡剂， 发酵制得复合氨基酸含量大于或等于 8、 羟烯腺嘌呤含量大于或等于 8mg/g、 烯腺嘌呤含量大于或等于 0.8mg/g 的本发明复合制剂， 稀释 1500 倍， 用清水作为对 照， 每种药剂设计 4 个重复， 于上午 10 点前或下午 4 点后用喷雾器对发病的葡萄的苗期、 花 前期、 花后期及膨果期进行喷施， 试验表明本制剂对葡萄产量的增加达到 28以上。 0015 实例 3 ： 13复合氨基酸嘌呤母液的制备 0016 根据实例 1 的方法， 将发酵罐营养液配方改为为 15的玉米粉、 15的豆粉、 8 的无水葡萄糖， 8的饴糖， 0.1的 MnSO4H2O， 0.3的甘油， 另外加入 0.5的聚醚改性 硅油作为消泡剂， 发酵制得复合氨基酸含量大于或等于 13、 羟烯腺嘌呤含量大于或等于 13mg/g、 烯腺嘌呤含量大于或等于1.3mg/g的本发明复合制剂， 稀释2000倍后， 用清水作为 对照， 每种药剂设计 4 个重复， 于上午 10 点前或下午 4 点后用喷雾器对发病的黄瓜的各个 时期进行喷施， 试验表明本制剂对黄瓜产量的增加达到 33以上。 说 明 书 CN 103329939 A 5 。