基于特异识别黄曲霉毒素单域重链抗体的亲和吸附材料技术领域
本发明涉及一种基于单域重链抗体(又称纳米抗体技术)的免疫亲和
吸附材料，特别是针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料。
技术背景
黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌产生的剧毒次
级代谢产物。它们的化学结构类似，为二呋喃香豆素衍生物，主要包括黄
曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG1)和M1(AFM1)
等。在天然污染的食品和饲料中，AFB1的污染最为常见，其毒性和致癌性
也最强，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物。世界各国及
地区指定了严格的黄曲霉毒素限量标准，例如欧盟婴幼儿食品中AFB1允
许量≤0.10μg/kg。
现有的黄曲霉毒素检测方法主要有仪器分析法、免疫分析法以及薄层
层析法。其中仪器分析法具有灵敏度高、准确性和重复性好等优点，但是
对于分析样品前处理要求较高，需要尽量去除样品中的杂质以减少对后续
检测的干扰。传统的前处理方法有液相萃取、固相萃取等，处理过程繁琐
且特异性不高。亲和层析技术基于配基与待测物质之间特异性的识别，可
通过一步操作实现对复杂混合样品中待测物的分离纯化。目前使用的黄曲
霉毒素亲和纯化介质一般采用多克隆抗体或单克隆抗体作为配基，存在不
耐有机试剂、活性迅速降低的问题。因此，需要开发活性高、稳定性好的
新型配基替换传统抗体。单域重链抗体是由羊驼重链抗体的可变区组成，
又称为纳米抗体，具有耐酸碱、耐高温以及易于生产等特性，相较于传统
抗体具有明显的优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料及其
应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料包括载体和配基，所述配基为单
域重链抗体，具有SEQIDNO.：1所示的氨基酸序列。该配基可特异性识别
黄曲霉毒素。
所述配基还可以为在前述单域重链抗体基础上通过随机或定点突变
技术进行改造所获得的能与黄曲霉毒素特异性结合的抗体。
所述载体为磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。
上述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的制备方法，其特征为：
所述载体为磁珠时，制备方法为：取1mg羧基磁珠于离心管中，加
入500～1000μl活化缓冲液(10mM，NaH2PO4，pH6.0)，涡旋混合均匀，
磁力架回收磁珠，再用活化缓冲液洗涤2遍。分别加入1～5mg碳二亚胺
(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，涡旋混合后，静置30min。用偶
联缓冲液(10mM，Na2HPO4，pH7.4)洗涤磁珠3遍，加入抗黄曲霉毒
素单域重链抗体，室温反应2～6h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重
链抗体的免疫磁珠；
所述载体为琼脂糖凝胶微球时，制备方法为：将CNBr活化的干胶用
0.1MHCl洗涤10～15次，每次平衡5～10min。用偶联缓冲液(10mM，
Na2HPO4，pH7.4)洗涤5～15次，加入抗黄曲霉毒素单域重链抗体，室
温反应2～10h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫亲和
吸附材料；
所述载体为硅胶微球时，制备方法为：将硅胶微球用纯水和磷酸缓冲
液(PBS，10mM，pH6.0)交替洗涤5～10次，用PBS缓冲液悬浮硅胶微
球，加入抗黄曲霉毒素单域重链抗体，混匀，加入终浓度1～10mg/ml的碳
二亚胺(EDC)，迅速混匀，4℃搅拌反应12～24h，得到共价偶联了抗黄
曲霉毒素单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。
将上述免疫亲和吸附材料(载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球)装填
至层析柱，即得到黄曲霉毒素免疫亲和层析柱，方法为：根据层析柱容量，
取适量上述免疫亲和吸附材料于层析柱，加入5～10倍柱床体积的PBS(10
mM，pH7.4)洗涤后，4℃，保存于20％乙醇溶液。
共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫磁珠无需装柱，直接吸
附后磁铁分离。
本发明还涉及装载有所述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的亲和层析
柱。
上述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的应用，用所述黄曲霉毒素免疫亲
和吸附材料对样品提取液进行净化，富集黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1
或AFG2)。黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料在去除黄曲霉毒素、净化黄曲霉
毒素污染物料中的应用。这种处理不以疾病诊断治疗为目的。当免疫吸附
材料的载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球时，方法为：首先用纯水清洗免
疫吸附材料，加入样品提取液，然后用纯水淋洗，再用甲醇洗脱特异性吸
附的黄曲霉毒素，收集的洗脱液，即为净化和富集后的样品提取液，可用
于后续分析检测。当载体为磁珠时，方法为：将免疫磁珠加入纯水中，磁
力架回收磁珠，重复清洗3～5次，然后将免疫磁珠加入样品提取液中，混
匀，磁力架回收磁珠，纯水清洗1～3次后，甲醇洗脱特异性吸附的黄曲霉
毒素，收集的洗脱液，即为净化和富集后的样品提取液，可用于后续分析
检测。
本发明针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料配基为单域重链抗体，具
有SEQIDNO.：1所示的氨基酸序列，该配基可特异性识别黄曲霉毒素。该
单域重链抗体容易获得，可以通过生物学方法大量培养生产配基为单域重
链抗体，避免了人工抗体等繁琐生产方法，大大降低了生产成本。生产过
程无需接触黄曲霉毒素，避免了对生产人员身体伤害。具有耐酸碱、耐高
温以及易于生产等特性，这些特性对于黄曲霉毒素的低成本、可重复使用
的免疫学检测方法有重要的实用价值。
具体实施方式
下面通过黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的制备及应用，对本发明做进
一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范
围。
实施例1：
抗黄曲霉毒素单域重链抗体(即针对黄曲霉毒素的单域重链抗体)免疫文
库的构建
将黄曲霉毒素B1与匙孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)
共价偶联，得到黄曲霉毒素人工抗原AFB1-KLH，取300μgAFB1-KLH与
弗氏完全佐剂乳化后，对羊驼(Lamapacos)进行皮下多点注射免疫。加
强免疫采用150μgAFB1-KLH与弗氏不完全佐剂乳化，间隔2周进行，每
次免疫7天后静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清效价
最高的样品分离淋巴细胞，提取RNA。
RNA的提取参照TAKARA公司RNAiso试剂说明书进行。以RNA
为模板，oligodT为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA
第一链。
采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，经巢式PCR获得重链抗体的可
变区编码基因(采用的引物见表1)。第一轮PCR分别以引物AlpVh-LD
和CH2-R扩增cDNA，反应条件为，98℃，10s，55℃，20s，72℃，
1min，20个循环，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。
将第一轮PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳，回收600bp～750bp
的DNA片段，作为第二轮PCR的模板，分别用引物AlpVh-SfiI和
AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，进行扩增，反应条件为，
98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5个循环，98℃，10s，68℃，
40s，30个循环，72℃延伸10min。经DNA片段回收试剂盒回收、定量，
于-20℃保存备用。将噬菌粒pHEN1和PCR扩增产物分别用SfiI、NotI
双酶切，经琼脂糖凝胶回收、定量后，以1∶3摩尔比，在16℃，过夜连
接。
表1文库构建及鉴定所用的引物
注：下划线表示限制性内切酶识别序列
连接产物经乙醇沉淀后，溶于10μL无菌水，分十次进行电穿孔转化
大肠杆菌TG1。取10μL电击、培养后的菌液倍比稀释，涂布氨苄青霉素
2×YT培养板，37℃，倒置培养12～16h，采用引物M13-R和pHEN-R
进行菌落PCR，计算库容；其余部分全部涂布于24cm×24cm氨苄青霉
素2×YT培养板，37℃，倒置培养12～16h。用10mL，2×YT培养基将
培养板上的菌苔刮洗后，加入终浓度15～30％甘油，分装，-80℃保存备
用。
根据计算的库容量结果，接种10倍库容量的活细胞于20mL的
2×YT(含2％葡萄糖，100μg/mL氨苄青霉素)，30℃，220r/min培养至
OD600达0.5，按感染复数20∶1加入辅助噬菌体，37℃，220r/min，60min。
将培养物离心，用50mL的2×YT(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL
卡那霉素)重悬沉淀，30℃，220r/min过夜培养后，3000g离心取上清，
加入5×PEG/NaCl溶液，冰上放置1h或4℃过夜，12000rpm离心30min，
重悬沉淀于含10％甘油的磷酸缓冲液(PBS，0.01M，pH7.4)，即得到
抗黄曲霉毒素单域重链抗体免疫文库，取10μL测定滴度，其余分装于-80
℃保存备用。
实施例2：
抗黄曲霉毒素单域重链抗体的淘选与鉴定
采用固相亲和淘选的方法从实施例1所得抗黄曲霉毒素单域重链抗体
免疫文库文库中淘选针对黄曲霉毒素的单域重链抗体。将AFB1与卵清白
蛋白(albumin，OVA)共价偶联，得到人工抗原AFB1-OVA。每孔加入
100μL用PBS稀释的人工抗原AFB1-OVA，4℃，包被过夜，每轮淘选的
包被浓度分别为100，75，50μg/mL；吸出包被液，PBS洗板3次，每孔
加入300μL3％BSA-PBS，37℃，封闭2h；PBS洗板6次，加入100μL
噬菌体抗体文库(约含2×1011CFU)，37℃，孵育1.5h；吸出未结合的噬
菌体，用PBST(含0.5％Tween-20)洗板5次(逐轮增加5次)，再用PBS
洗板10次(洗板次数逐轮增加5次)；以100μL洗脱液(甘氨酸-盐酸，pH
2.2)洗脱吸附在酶标孔中的噬菌体，用50μLTris-HCl(1mol/L，pH8.0)中
和洗脱物，取10μL用于滴度测定，其余洗脱物扩增后用于下一轮淘选。
第二轮和第三轮淘选采用竞争洗脱，分别用50和25ng/mL的AFB1溶液
在37℃，孵育1h。
经三轮淘选后，采用辅助噬菌体KM13对随机挑取的单克隆进行救援，
分别得到展示抗体可变区的噬菌体颗粒，再用间接phage-ELISA和间接竞
争phage-ELISA测定噬菌体颗粒的结合活性和特异性，实验设定阴性对照
及背景对照，具体加样步骤见表2。
表2间接phage-ELISA加样表
将ELISA阳性克隆送生物技术服务公司进行序列测定，得到插入片段
的DNA序列，其编码针对黄曲霉毒素的单域重链抗体，具体如下(SEQID
NO.：2)：
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGAGGAGGCGTAGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTG
AAACTCTCCTGTACAGCCTCTGGAAGCATCTATAGCCTCGTTGCCATGGGCTGGTACCG
CCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTGGGTCGCAGATATTACTCGTGTTGGTAACACA
AACCATGCGAACTCCAGGGAGGACCGATTCACCATCTCGACAGGTGTCCCCTGGAACA
CGGTGATTCTGTCTATGAACAGCCTGGAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTATTGTAAT
GCCCGAGTTACCTCCGGGCTTAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCT
CAA
依据DNA测序结果及密码子表可获得针对黄曲霉毒素的单域重链抗
体的氨基酸序列(SEQIDNO.：1)：
QVQLVESGGGVVQPGGSLKLSCTASGSIYSLVAMGWYRQAPGKQR
EWVADITRVGNTNHANSREDRFTISTGVPWNTVILSMNSLEPEDTAVYY
CNARVTSGLNYWGQGTQVTVSS
采用间接竞争phage-ELISA法对阳性克隆与几种不同黄曲霉毒素亚型
的交叉反应率进行测定，将AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1五种标
准品稀释至12个不同的工作浓度，在同样的条件下进行间接竞争
phage-ELISA测定，分别绘制竞争ELISA曲线，计算抑制率为50％时的标
准品浓度(IC50)，按照公式：交叉反应率(％)＝(AFB1IC50/类似物IC50)
×100％，所述类似物为AFB2、AFG1、AFG2或AFM1，得到本发明阳性
克隆(针对黄曲霉毒素的单域重链抗体)对于AFB1的50％抑制浓度。结
果表明，本发明阳性克隆(针对黄曲霉毒素的单域重链抗体)对于AFB1
具有较好的特异性，对AFG1和AFG2也有一定的结合能力。
实施例3：
抗黄曲霉毒素单域重链抗体的规模制备
编码抗AFB1单域重链抗体的DNA片段的获取：1.采用限制性内切
酶SfiI/NotI，双酶切噬菌粒pHEN-抗AFB1单域重链抗体基因，琼脂糖凝
胶电泳回收抗AFB1单域重链抗体基因；2.直接将抗AFB1单域重链抗体
编码序列送生物技术服务公司进行化学合成；3.设计特异性引物，通过
PCR技术从羊驼(Lamapacos)来源的cDNA库中扩增。
将得到的抗AFB1单域重链抗体基因片段克隆至表达载体pET25，经
PCR和酶切鉴定，构建完成抗AFB1单域重链抗体的大肠杆菌表达质粒。
将表达质粒转化至大肠杆菌BL21，挑取单菌落进行诱导表达。将单
菌落接入4mLLBA(Luria-Bertanibrothwith100μg/mLampicillin)液体
培养基中，37℃、250r/min振荡培养12h；以1％培养基体积的接种量
将其转接到50mLLBA液体培养基中，37℃、250r/min振荡培养至OD600
达到0.5(约需2.5～3h)，加入终浓度0.1mM的IPTG，30℃、200r/min
诱导培养。
诱导培养物8000r/min离心，在细胞沉淀中加入20mL磷酸缓冲液
(pH7.4)混匀，8000r/min离心，去上清，保留细胞沉淀；在细胞沉淀中
加入10mL相同缓冲液，混匀，冰上超声波细胞破碎处理，超声破碎条件
为200W，破碎2s，间歇3s，共240个循环，在4℃下对细胞破碎物12000
r/min离心20min，取上清进行亲和层析纯化和SDS-PAGE电泳分析，或
在上清中加入终浓度30％的甘油，混匀，保存于-20℃冰柜待用。
通过优化诱导表达条件(如宿主菌、表达载体、诱导培养时间、温度
以及IPTG浓度等)，可以进一步提高目的蛋白(单域重链抗体)表达量，
为大量制备抗AFB1单域重链抗体提供了途径。
实施例4黄曲霉毒素免疫亲和磁珠的小量制备
采用纳米磁珠作为载体，偶联抗黄曲霉单域重链抗体后，得到黄曲霉
毒素免疫磁珠，具体制备方法如下：
取1mg羧基修饰的磁珠(购自无锡百运纳米科技有限公司，羧基磁珠
300nm)于离心管中，加入500μl活化缓冲液(10mM，NaH2PO4，pH6.0)，
涡旋混合均匀，磁力架回收磁珠，再用活化缓冲液洗涤2遍。分别加入2mg
碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，涡旋混合后，静置30min。
用偶联缓冲液(10mM，Na2HPO4，pH7.4)洗涤磁珠3遍，加入溶于偶
联缓冲液的抗黄曲霉毒素单域重链抗体1mg，室温反应3h，用偶联缓冲
液洗涤磁珠3次，加入500μl含1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)或1％
(w/v)卵清蛋白(OVA)的偶联缓冲液封闭未反应的活性基团，室温反
应30min。用偶联缓冲液洗涤磁珠3次，PBS溶液(10mM，pH7.4，0.02
％w/v，Na3N)重悬后保存于4℃。
实施例5黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料及亲和柱的制备
采用琼脂糖微球作为载体，偶联抗黄曲霉单域重链抗体，具体制备方
法如下：
将CNBr活化的干胶用0.1MHCl洗涤10次，每次平衡5min。用偶
联缓冲液(10mM，Na2HPO4，pH7.4)洗涤10次，加入抗黄曲霉毒素单
域重链抗体(2mg/每克琼脂糖微球)，室温反应4h，使抗黄曲霉毒素单域
重链抗体与CNBr活化的琼脂糖凝胶微球共价偶联。用偶联缓冲液(10
mM，Na2HPO4，pH7.4)洗涤2次后，加入封闭液室温反应2h以封闭未
反应的活性基团。用5被胶体积的磷酸缓冲液(10mM，pH7.4)和醋酸
缓冲液(0.1M，pH4.0)交替洗涤3次，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单
域重链抗体的免疫亲和吸附材料。取0.2ml上述免疫亲和吸附材料于容量
为1ml的层析柱，5～10倍柱床体积的PBS(10mM，pH7.4)洗涤后，加
入20％乙醇溶液，4℃保存。
实施例6黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料及亲和柱的制备
采用硅胶微球作为载体，偶联抗黄曲霉单域重链抗体，具体制备方法
如下：
取2g硅胶微球用纯水和磷酸缓冲液(PBS，10mM，pH6.0)交替洗
涤5～10次，用10mlPBS缓冲液悬浮硅胶微球，加入5mg抗黄曲霉毒素
单域重链抗体，混匀，加入终浓度5mg/ml的碳二亚胺(EDC)，迅速混匀，
4℃搅拌反应12～24h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免
疫亲和吸附材料。取0.2ml上述免疫亲和吸附材料于容量为1ml的层析柱，
5～10倍柱床体积的PBS(10mM，pH6)洗涤后，加入含0.02％(w/v)
Na3N的PBS(10mM，pH6)，4℃保存。
实施例7黄曲霉毒素免疫亲和柱柱容量、加标回收率、重复使用测定
将实施例5或实施例6制备的亲和层析柱用5mlPBS(10mM，pH7.4)
洗涤，加入5ml浓度为100ng/ml的AFB1标准品溶液，10ml纯水淋洗，
用1ml甲醇洗脱，收集洗脱液用高效液相色谱检测洗脱液中AFB1的含量，
计算得出亲和层析柱的容量为650～800ng。
取5g粉碎的花生、玉米样品(不含黄曲霉毒素)，分别加入50ng、
100ng和200ng的AFB1或AFG1标准品，用60％(v/v)甲醇-水溶液提取
样品，涡旋振荡15min，快速定性滤纸过滤，取5ml滤液，加PBS(10mM，
pH7.4)稀释。
将实施例5或实施例6制备的亲和层析柱用5mlPBS(10mM，pH7.4)洗
涤，加入10ml样品提取稀释液，10ml纯水淋洗，用1ml甲醇洗脱，收集
洗脱液用高效液相色谱检测AFB1或AFG1的含量，计算回收率。结果显示
制备的亲和柱对AFB1或AFG1的平均回收率分别为85～101％，80～97％。
重复使用10次后，亲和柱对AFB1或AFG1的平均回收率＞80％。