《源于棉花的MYC类转录因子、其编码基因及在调控植物胁迫抗性中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《源于棉花的MYC类转录因子、其编码基因及在调控植物胁迫抗性中的应用.pdf（32页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104178497A43申请公布日20141203CN104178497A21申请号201410390003022申请日20140808C12N15/29200601C12N15/82200601C07K14/415200601A01H5/0020060171申请人中国农业科学院生物技术研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号72发明人周美亮吴燕民刘博欣孙占敏唐益雄74专利代理机构北京康思博达知识产权代理事务所普通合伙11426代理人余光军54发明名称源于棉花的MYC类转录因子、其编码基因及在调控植物胁迫抗性中的应用57摘要本发明公开了源于棉花的MYC类转录因子、。
2、其编码基因及在调控植物胁迫抗性中的应用。本发明首先公开了从棉花中分离的GHMYC3转录因子编码基因，其多核苷酸序列为SEQIDNO3所示，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO4所示。本发明还公开了含有所述转录因子编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。转基因功能分析实验证明，在植物中过表达棉花GHMYC3转录因子编码基因能够有效提高植物对包括高盐或干旱等非生物逆境胁迫的抗性。本发明源于棉花的MYC类转录因子及其编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性以及培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种等方面有重要的应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书12页序列表10页附图8页19中华人民共和国国家知识产权局12发。
3、明专利申请权利要求书1页说明书12页序列表10页附图8页10申请公布号CN104178497ACN104178497A1/1页21从棉花GOSSYPIUMHIRSUTUML分离的GHMYC3转录因子编码基因，其特征在于，其多核苷酸为A、B、C、D或E所示A、SEQIDNO3所示的多核苷酸；或B、编码SEQIDNO4所示氨基酸的多核苷酸；或C、与SEQIDNO3的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有GHMYC3转录因子功能；或D、与SEQIDNO3所示的多核苷酸至少有90或以上同源性的多核苷酸，优选的，与SEQIDNO3所示的多核苷酸至少有95或以上同源性的。
4、多核苷酸，最优选的，与SEQIDNO3所示的多核苷酸至少有98或以上同源性的多核苷酸；或E、在SEQIDNO3所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有GHMYC3转录因子的功能或活性。2权利要求1所述编码基因编码的GHMYC3转录因子，其特征在于，其氨基酸为A或B所示A、SEQIDNO4所示的氨基酸；B、将SEQIDNO4所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GHMYC3转录因子功能或活性的蛋白变体。3含有权利要求1所述的编码基因的重组表达载体。4按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在。
5、于所述重组表达载体是重组植物表达载体。5含有权利要求3或4所述的重组表达载体的重组宿主细胞。6权利要求1所述的编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用。7按照权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤1构建含有权利要求1所述的编码基因的重组植物表达载体；2将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；3培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。8一种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤1构建含有权利要求1所述的编码基因的重组植物表达载体；2将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；3培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。9权利要求。
6、2所述的GHMYC3转录因子在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用。10按照权利要求6、7或9所述的应用，其特征在于所述的逆境胁迫包括高盐或干旱。权利要求书CN104178497A1/12页3源于棉花的MYC类转录因子、其编码基因及在调控植物胁迫抗性中的应用技术领域0001本发明涉及转录因子，尤其涉及源于棉花的MYC类转录因子及其编码基因，还涉及含有棉花MYC类转录因子编码基因的表达载体和宿主细胞，本发明进一步涉及棉花MYC类转录因子及其编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用，属于棉花MYC类转录因子及其应用技术领域。背景技术0002植物中髓细胞组织增生蛋白MYELOCYTOMATOSISPROT。
7、EINS，MYCS即MYC类转录因子，具有多种调节功能，并广泛存在于动植物中。在已经发现的MYC类转录因子中，MYC2是研究最为深入的一个，目前在模式植物拟南芥中发现MYC2转录因子通过形成CO1/JAZS/MYC2复合物发挥调控作用，参与JA、ABA等激素信号转导过程。如拟南芥的ATMYC2转录因子，在逆境下表达增强。在干旱胁迫下，ATMYC2蛋白也作为ABA诱导的转录激活子发挥功能。0003干旱和盐渍是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害，严重影响作物的产量和种植面积。据不完全统计，全世界的干旱地区占陆地总面积的三分之一，且有逐年增加的趋势。土壤盐碱化和次生盐碱化问题在世界范围内广。
8、泛存在，特别是干旱、半干旱地区，问题更为严重。0004棉花是最耐盐的农作物之一，其耐盐性因品种、生育阶段、器官以及土壤盐分种类等不同而差异较大。因此，从棉花中克隆MYC类转录因子编码基因并将其应用于提高植物对逆境胁迫的抗性以及培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种，对棉花等植物抗逆性能的提高将具有重要的意义。发明内容0005本发明的目的之一是提供一类与植物抗逆性相关的棉花MYC类转录因子及其编码基因；0006本发明的目的之二是提供含有所述MYC类转录因子编码基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞；0007本发明的目的之三是将所述的棉花MYC类转录因子及其编码基因应用于提高植物对逆境胁。
9、迫的抗性以及培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种。0008本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的0009本发明首先从棉花GOSSYPIUMHIRSUTUML分离了GHMYC3转录因子编码基因，其多核苷酸为A、B、C、D或E所示0010A、SEQIDNO3所示的多核苷酸；或0011B、编码SEQIDNO4所示氨基酸的多核苷酸；或0012C、与SEQIDNO3的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多说明书CN104178497A2/12页4核苷酸所编码蛋白质仍具有GHMYC3转录因子功能；或0013D、与SEQIDNO3所示的多核苷酸至少有90或以上同源性的多核苷酸，优选的，与SEQI。
10、DNO3所示的多核苷酸至少有95或以上同源性的多核苷酸，最优选的，与SEQIDNO3所示的多核苷酸至少有98或以上同源性的多核苷酸；或0014E、在SEQIDNO3所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有GHMYC3转录因子的功能或活性。0015本发明还公开了由所述转录因子基因编码的GHMYC3转录因子，其氨基酸为A或B所示0016A、SEQIDNO4所示的氨基酸；0017B、将SEQIDNO4所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GHMYC3转录因子功能或活性的蛋白变体。0018本发明所。
11、述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备GHMYC3转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中用于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。本发明所述的GHMYC3转录因子及其编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。
12、。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQIDNO4所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法例如DNA改组。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。0019本发明还公开了含有所述GHMYC3转录因子编码基因的重组表达载体；所述的重组表达载体是重组植物表达载体。0020本发明还公开了含有所述的重组表达载体的重组宿主细胞。0021将所述棉花GHMYC3转录因子编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编。
13、码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5端非编码区，SEQIDNO3所示的核苷酸和3非编码区组成；其中，所述的5端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3非编码区可以包含终止子序列、MRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的TI质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。0022另外，本领域技术人员可以将SEQIDNO3所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。0023所述重组植物表达载体。
14、还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因以及赋予除说明书CN104178497A3/12页5草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如半乳糖苷酶和荧光蛋白等。0024本发明还涉及将所述的棉花GHMYC3转录因子编码基因引入到植物中以提高植物对逆境胁迫的抗性。0025本发明进一步公开了所述的棉花GHMYC3转录因子编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用，包括以下步骤1构建含有所述棉花GHMYC3转录因子编码基因的重组植物表达载体；2将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；3培育筛选得到对逆。
15、境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。0026本发明进一步公开了一种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，包括以下步骤1构建含有所述棉花GHMYC3转录因子编码基因的重组植物表达载体；2将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；3培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。0027其中，所述的逆境胁迫包括高盐或干旱等非生物胁迫。0028转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物单子叶植物或双子叶植物或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用。
16、多种瞬时转化法将本发明的GHMYC3转录因子基因提供给植物。在其它实施方案中，本发明的GHMYC3转录因子基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的GHMYC3转录因子基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。0029利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株MCCORMICKETALPLANTCELLREPORTS198658184。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生或甘蔗等。0030为了分。
17、析本发明从棉花GOSSYPIUMHIRSUTUML分离的GHMYC3转录因子的功能，本发明用GATEWAY方法构建含有GHMYC3基因核苷酸为SEQIDNO3所示的植物表达载体，花序浸染法转化拟南芥，获得T1代种子；通过拟南芥种子抗性筛选及PCR鉴定，获得转基因拟南芥。同时分别构建含有GHMYC1核苷酸为SEQIDNO1所示、GHMYC2核苷酸为SEQIDNO2所示和GHMYC4核苷酸为SEQIDNO5所示基因的植物表达载体，转化拟南芥，获得转基因拟南芥。0031对转基因拟南芥进行抗旱耐盐分析。表型分析结果表明，转GHMYC3基因的拟南芥抗旱效果明显，植株生长旺盛，没有明显的叶片发黑现象。生理。
18、指标分析表明，NACL处理后，转GHMYC3基因的拟南芥叶绿素含量与NK基本持平，属正常水平，说明转GHMYC3基因植株的光合作用正常；干旱处理后，转GHMYC3基因的拟南芥丙二醇含量较低，在0013MOL/G附近，证明抗旱效果明显；转GHMYC3基因1号植株的可溶性糖含量为0112MMOL/G，显著高于对照，说明转GHMYC3基因植株通过升高可溶性糖含量来提高其抗旱水平，转GHMYC3基因的拟南芥抗旱效果明显。0032总之，转化实验证明，在植物中过表达棉花GHMYC3转录因子编码基因能够有效提高植物对高盐或干旱逆境胁迫的抗性。因此，本发明克隆的棉花GHMYC3转录因子编码基因说明书CN104。
19、178497A4/12页6在提高植物对逆境胁迫抗性及培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种中有着重要的应用前景。0033本发明所涉及到的术语定义0034除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。0035术语“转录因子”意指能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白。0036术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类。
20、似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA肽核酸、在反义技术中所用的DNA类似物硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体包括但不限于简并密码子取代和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选或所有密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代BATZER等人,NUCLEICACIDRES1950811991；OHTSUKA等人,JBIOLCHEM260260526081985；和CASSOL等人,1992；RO。
21、SSOLINI等人,MOLCELLPROBES891981994。0037术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白即抗原，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。0038述语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序。
22、列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献TIJSSEN,TECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGYHYBRIDIZATIONWITHNUCLEICPROBES,“OVERVIEWOFPRINCIPLESOFHYBRIDIZATIONANDTHESTRATEGYOFNUCLEICACIDASSAYS1993。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度PH下的热熔点TM约510。TM为在平衡状态下50与目标。
23、互补的探针杂交到目标序列时所处的温度在指定离子强度、PH和核酸浓度下因为目标序列过量存在，所以在TM下在平衡状态下50的探针被占据。严谨条件可为以下条件其中在PH70到83下盐浓度低于约10M钠离子浓度，通常为约001到10M钠离子浓度或其它盐，并且温度对于短探针包括但不限于10到50个核苷酸而言为至少约30，而对于长探针包括但不限于大于50个核苷酸而言为至少约60。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下50甲酰胺，5SSC和1SDS，在42下培养；或5SSC，说明书CN1041。
24、78497A5/12页71SDS，在65下培养，在02SSC中洗涤和在65下于01SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。0039术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、F配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。0040术语“转化”意指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。0041术语“表达”意指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和。
25、/或翻译。0042术语“编码序列”意指转录成RNA的核酸序列。0043术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括TDNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。附图说明0044图1为从棉花基因组及CDNA中克隆GHMYC1和GHMYC2电泳图；其中，M为DNAMARKER；1、2为棉花基因组对MYC1全长引物的PCR结果；3为棉花CDNA对MYC1全长引物的PCR结果；4、5为棉花基因组对MYC。
26、2全长引物的PCR结果；6为棉花CDNA对MYC2全长引物的PCR结果；0045图2为从棉花基因组及CDNA中克隆GHMYC3和GHMYC4电泳图；其中，1、2为棉花CDNA对MYC3全长引物的PCR结果；3为棉花基因组对MYC3全长引物的PCR结果；4、5、6为棉花基因组对MYC4全长引物的PCR结果；7、8、9为棉花CDNA对MYC4全长引物的PCR结果；0046图3为GHMYC1的阳性菌落检测图；其中，M为DNAMARKER；11、13为11和13号菌落；为阳性对照；为空白对照；0047图4为GHMYC2的阳性菌落检测图；0048图5为GHMYC3的阳性菌落检测图；0049图6为GHMY。
27、C4的阳性菌落检测图；0050图7为GATEWAY方法构建含有GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3或GHMYC4基因的植物表达载体的流程图；0051图8为GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4基因的入门克隆转化大肠杆菌菌株DH5的菌液PCR检测图；其中，M为DNAMARKER；13为GHMYC1的入门克隆转化大肠杆菌DH5的3号菌落的PCR检测结果；23和24为GHMYC2的入门克隆转化大肠杆菌DH5的3号和4号菌落的PCR检测结果；32、33和34为GHMYC3的入门克隆转化大肠杆菌DH5的2号、3号和4号菌落的PCR检测结果；41、42、43、44和45为GHMYC4的。
28、入门克隆转化大肠杆菌DH5的1号、2号、3号、4号和5号菌落的PCR检测结果；为阳性对照；0052图9为GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4基因的植物表达载体转化大肠杆菌菌株DH5的菌液PCR检测图；其中，M为DNAMARKER；11、12和13为GHMYC1的植物表达载体转化大肠杆菌DH5的1号、2号和3号菌落的PCR检测结果；21、21、23和24为GHMYC2的植物表达载体转化大肠杆菌DH5的1号、2号、3号和4号菌落的PCR检测结果；说明书CN104178497A6/12页831、32和33为GHMYC3的植物表达载体转化大肠杆菌DH5的1号、2号和3号菌落的PCR检。
29、测结果；41、42、43和44为GHMYC4的植物表达载体转化大肠杆菌DH5的1号、2号、3号和4号菌落的PCR检测结果；为阳性对照；为空白对照；0053图10为GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4基因的植物表达载体转化农杆菌GV3101的菌液PCR检测图；其中，M为DNAMARKER；11、12、14和15为GHMYC1的植物表达载体转化农杆菌GV3101的1号、2号、4号和5号菌落的PCR检测结果；21、23、24和25为GHMYC2的植物表达载体转化农杆菌GV3101的1号、3号、4号和5号菌落的PCR检测结果；31、32、33和34为GHMYC3的植物表达载体转化农杆。
30、菌GV3101的1号、2号、3号和4号菌落的PCR检测结果；42和45为GHMYC4的植物表达载体转化农杆菌GV3101的2号和5号菌落的PCR检测结果；为阳性对照；0054图11转基因拟南芥的PCR鉴定图；其中，M为DNAMARKER；1116为转GHMYC1基因的6株拟南芥的检测结果；3132为转GHMYC3基因的2株拟南芥的检测结果；41412为转GHMYC4基因的12株拟南芥的检测结果；0055图12为200MMOL/LNACL处理后的转基因拟南芥总叶绿素含量的柱状图；其中NK为对照未转基因植株；GHMYC11和GHMYC12为转GHMYC1基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC21和。
31、GHMYC22为转GHMYC2基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC31和GHMYC32为转GHMYC3基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC41和GHMYC42为转GHMYC4基因的拟南芥植株1号和2号；0056图13为干旱处理后的转基因拟南芥总叶绿素含量的柱状图；其中NK为对照未转基因植株；GHMYC11和GHMYC12为转GHMYC1基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC31和GHMYC32为转GHMYC3基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC41和GHMYC42为转GHMYC4基因的拟南芥植株1号和2号；0057图14为干旱处理后的转基因拟南芥的丙二醇含量柱状图；其中NK为对照未转基因。
32、植株；GHMYC11和GHMYC12为转GHMYC1基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC21和GHMYC22为转GHMYC2基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC31和GHMYC32为转GHMYC3基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC41和GHMYC42为转GHMYC4基因的拟南芥植株1号和2号；0058图15为200MMOL/LNACL处理后的转基因拟南芥的可溶性糖含量的柱状图；其中NK为对照未转基因植株；GHMYC11和GHMYC12为转GHMYC1基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC21和GHMYC22为转GHMYC2基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC31和GHMYC32为转G。
33、HMYC3基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC41和GHMYC42为转GHMYC4基因的拟南芥植株1号和2号；0059图16为干旱处理后的转基因拟南芥的可溶性糖含量柱状图；其中NK为对照未转基因植株；GHMYC11和GHMYC12为转GHMYC1基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC21和GHMYC22为转GHMYC2基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC31和GHMYC32为转GHMYC3基因的拟南芥植株1号和2号；GHMYC41和GHMYC42为转GHMYC4基因的拟南芥植株1号和2号。具体实施方式说明书CN104178497A7/12页90060下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本。
34、发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。00611、实验材料0062棉花银棉品种的叶片，银棉品种购买于北京市中蔬大森林花卉市场；拟南芥种子为哥伦比亚型，本发明人实验室保存；PMD19T克隆载体、TAQ酶购于全式金公司；大肠杆菌DH5与高纯质粒小量制备试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；农杆菌菌株GV3101为本发明人实验室保存；0063PDONRTM207载体购自英伟捷达公司；表达载体。
35、PH7WG2D购自VIB比利时公司；GATEWAY克隆的BP反应试剂盒和LR反应试剂盒购自英伟捷达公司；DNA胶回收试剂盒购自塔克拉公司；TRIZOL试剂购自天根科技有限公司；CDNA反转录试剂盒购自FERMENTAS公司；引物合成和测序由北京奥科鼎盛生物技术有限公司完成。0064实施例1棉花MYC类转录因子编码基因的克隆00651、实验方法006611电子克隆得到MYC类转录因子0067根据同源基因中存在保守相似序列的特性，用拟南芥MYC类转录因子基因的序列为信息探针，对NCBI中EST数据库棉花GOSSYPIUMHIRSUTUM进行TBLASTX同源性检索，利用DNASTAR软件将检索到的。
36、来自于棉花的EST序列拼接获得连接体；然后用此连接体再次进行TBLASTX的同源检索与拼接，重复以上过程直至无重叠的EST序列，最终获得陆地棉4个GHMYC基因的CDNA序列片段。006812RTPCR方法获得目的基因0069依据电子克隆获得的全长4个GHMYC基因的CDNA序列设计RTPCR引物表1。0070表1GHMYC克隆全长引物007100720073利用TRIZOL异丙醇法提取银棉总RNA，按照试剂盒的说明进行操作。提取棉花总RNA后，以其为模板，OLIGODT5PMOL/L为引物1L，混匀后65孵育5MIN，放于冰说明书CN104178497A8/12页10上，加入5REACTIO。
37、NBUFFER4L、RNASININHIBITOR1L、MMLVRT1L及DNTPMIX2L，并温和混匀后瞬离，42孵育60MIN，705MIN终止反应，即反转录合成CDNA第一链，20保存备用。0074将反转录产物初步检测后，取1L作为模板按下列体系和条件进行PCR扩增。0075RTPCR反应体系为总体系为20L，其中含有10BUFFER为2L，2MMOL/LDNTP为1L，稀释为10MOL/L的引物各1L，TAQ酶05U一般20L的反应体系加1L，加DDH2O至20L。0076RTPCR的反应程序为94预变性5MIN；94变性30S，退火45S，72延伸60S，并循环29次；72延伸10M。
38、IN。0077扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳，将预期大小的片段回收并克隆入PMD19T克隆载体，然后转化大肠杆菌菌株DH5。挑取阳性菌进行菌液PCR并进行测序。0078另外，利用CTAB法提取棉花基因组DNA，利用表1的引物从棉花基因组DNA克隆出4个GHMYC转录因子基因。00792、实验结果0080根据电子克隆的棉花四个GHMYCDNA序列设计引物，通过RTPCR反应分别从CDNA或基因组DNA克隆出四个GHMYC转录因子基因图1、图2，获得的4个MYC类转录因子基因分别命名GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4，其核苷酸序列分别为SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQID。
39、NO3和SEQIDNO5所示。其中，GHMYC3基因的推导的氨基酸序列为SEQIDNO4所示。从图1、图2发现GHMYC转录因子的四个基因在银棉基因组中不含内含子。0081将克隆的GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4基因的PCR产物分别与PMD19T载体连接，转化大肠杆菌DH5，进行阳性菌液PCR检验。0082对转GHMYC1基因的DH5抗性菌进行PCR菌落检测，发现11和13号菌落为阳性图3。0083对转GHMYC2基因的DH5抗性菌进行PCR菌落检测，发现3号菌落为阳性图4。0084对转GHMYC3基因的DH5抗性菌进行PCR菌落检测，发现2号、3号等18个菌落为阳性图5。
40、。0085对转GHMYC4基因的DH5抗性菌进行PCR阳性菌落检测，发现9号、14号菌落为阳性图6。0086实施例2含有MYC类转录因子编码基因的植物表达载体构建及转化拟南芥00871、实验方法008811GATEWAY方法构建植物表达载体0089根据GATEWAY克隆技术的引物序列设计要求及实施例1克隆的GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4基因序列设计GATEWAY反应引物表2。0090表2GATEWAY引物设计0091说明书CN104178497A109/12页110092采用DNA聚合酶，用表2的上下游引物进行PCR反应，总体系为20L，其中含有实施例1制备的分别连接G。
41、HMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4基因的PMD19T克隆载体质粒1L，10BUFFER为2L，2MMOL/LDNTP为1L，稀释为10MOL/L的引物各1L，TAQ酶05U一般20L的反应体系加1L，加DDH2O至20L。在GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4全长基因的上下游加入ATTB序列。反应条件如下94预变性5MIN，94变性30S，退火45S，75延伸1MIN，共30个循环；75延伸10MIN，4终止反应。用琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，并纯化回收。0093BP反应BP反应的目的是将扩增得到的含有ATTB接头的PCR产物克隆到含有ATTP的供体载体PD。
42、ONRTM207上，以产生入门克隆。根据INVITROGEN公司的GATEWAYBPCLONASEENZYMEMIX试剂盒中BP反应体系，包括PCR产物15150NG、PDONRTM207载体1L150NG/L，补充TE缓冲液PH80至8L，快速漩涡震荡酶体系混合液两次，加1BPCLONASETM酶混合物2L。反应体系置25温育60MIN后加入2L蛋白酶K液，37温育10MIN，以终止BP反应。得到入门克隆PDONRTM207GHMYC1、PDONRTM207GHMYC2、PDONRTM207GHMYC3和PDONRTM207GHMYC4。0094BP反应产物的转化及阳性克隆的鉴定将通过BP反。
43、应得到的入门克隆PDONRTM207GHMYC1、PDONRTM207GHMYC2、PDONRTM207GHMYC3和PDONRTM207GHMYC4转化大肠杆菌菌株DH5，并涂布到壮观霉素LB抗性平板上，挑取抗性菌落，进行PCR检测，检测为阳性的菌落提取质粒，即得到入门克隆载体。0095LR反应LR反应的目的是将已经重组入入门载体PDONRTM207GHMYC1、PDONRTM207GHMYC2、PDONRTM207GHMYC3和PDONRTM207GHMYC4的目标基因GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4再克隆到表达载体PH7WG2D中。LR反应体系中包括入门克隆质粒15。
44、150NG，PH7WG2D载体1L150NG/L，补充TE缓冲液PH80至8L，快速漩涡震荡酶体系混合液两次，加1LRCLONASETM酶混合物2L。反应体系置25温育60MIN后加入2L蛋白酶K溶液，37温育10MIN以终止LR反应，得到最终的表达载体PH7WG2DGHMYC1、PH7WG2DGHMYC2、PH7WG2DGHMYC3和PH7WG2DGHMYC4构建流程图见图7。0096LR反应产物的转化及阳性克隆的鉴定将LR反应产物的表达载体PH7WG2DGHMYC1、PH7WG2DGHMYC2、PH7WG2DGHMYC3和PH7WG2DGHMYC4转化大肠杆菌菌株DH5，并涂布到卡那霉素L。
45、B抗性平板上，挑取阳性菌落，进行PCR检测，以确定阳性克隆。009712花序浸染法转化拟南芥0098121拟南芥的培养与处理说明书CN104178497A1110/12页120099将置于4冰箱中春化了两三天的拟南芥种子种在生长盆里，浇水并盖膜以保持水分。在拟南芥初次开花时，为促进侧枝更多花枝的增生，将主茎顶端的花蕾剪掉。适合转化植株的花卉是并没有成熟，也没有产生已受精的角果大约生长时间为30天左右。0100在用花序侵染法转拟南芥之前，剪去已经长成的角果，以免降低阳性率。侵染前一晚浇水，保持土壤湿度，侵染过程中土不易掉出。0101122花序浸染法转化拟南芥0102将GATEWAY方法构建的植物。
46、表达载体PH7WG2DGHMYC1、PH7WG2DGHMYC2、PH7WG2DGHMYC3和PH7WG2DGHMYC4分别转化农杆菌GV3101，挑取阳性菌落进行PCR检测。将阳性菌株分别接种到250ML三角瓶按11000的比例添加到装有200ML的YEB液体培养基中，添加抗生素卡那霉素和利福平，大量摇菌1天直到OD值为12。5000RPM离心富集农杆菌，然后用5的蔗糖1/2MS大量悬浮蔗糖溶液中加入01的表面活性剂SILWETL77，直至OD值约为08。将拟南芥的花序浸入菌液中侵染1分钟；侵染后的拟南芥用黑色塑料袋或者薄膜覆盖，暗培养24小时。在第一次侵染后7天进行第二次侵染，侵染方法同第一。
47、次。待拟南芥植株长大成熟，角果自然开裂后收获种子，即为T1代种子。0103123拟南芥种子的抗性筛选0104将T1代种子均匀播种在含50MG/L潮霉素或100MG/L卡那青霉素的抗性平板1/4MS培养基上，置4冰箱冷处理72H后，移至25，16H光照培养箱中发芽，定期观察并调查种子发芽和幼苗生长情况。生长710天左右，长出两片真叶的幼苗为抗性幼苗，将抗性幼苗移栽到营养土中。待长成熟时，提取转基因植株的基因组进行PCR鉴定。01052、实验结果010621植物表达载体构建0107入门克隆PDONRTM207GHMYC1、PDONRTM207GHMYC2、PDONRTM207GHMYC3和PDON。
48、RTM207GHMYC4转化大肠杆菌菌株DH5的菌液PCR检测结果见图8。0108植物表达载体PH7WG2DGHMYC1、PH7WG2DGHMYC2、PH7WG2DGHMYC3和PH7WG2DGHMYC4转化大肠杆菌菌株DH5的菌液PCR检测结果见图9。说明GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4基因的植物表达载体构建成功。010922植物表达载体转化拟南芥0110扩增含有植物表达载体PH7WG2DGHMYC1、PH7WG2DGHMYC2、PH7WG2DGHMYC3和PH7WG2DGHMYC4的阳性DH5菌落并提取质粒，转化进农杆菌GV3101中图10。0111通过花序浸染法转化。
49、拟南芥，分别获得转GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4基因的拟南芥T1代种子。011223拟南芥的抗性筛选0113提取阳性幼苗基因组进行PCR鉴定图11。结果说明，成功获得分别转GHMYC1、GHMYC2、GHMYC3和GHMYC4基因的拟南芥。0114实施例3转棉花MYC类转录因子编码基因拟南芥的抗旱耐盐分析01151、实验方法011611转基因阳性株的胁迫处理0117111盐胁迫处理0118用实施例2获得的盆栽4周左右的转基因拟南芥植株作为研究对象浇淋200MMOL/说明书CN104178497A1211/12页13L的NACL，盐处理10D时取样检测，以野生型拟南芥作对照。观察盐胁迫对转基因拟南芥表型的影响。0119112干旱胁迫处理0120用实施例2获得的盆栽4周左右的转基因拟南芥植株作为研究对象进行干旱胁迫处理，10天内不浇水，干旱处理10D时取样检测，以野生型拟南芥作对照。观察干旱胁迫对转基因拟南芥表型的影响。012112生理指标检测0122121叶绿素含量的测定0123取胁迫处理后的拟南芥鲜叶擦净，剪碎去掉中脉，混匀，称取剪碎鲜样00。