用于治疗与突变的RET激酶相关疾病的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲 基)-N-[4-甲基-3-((吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺 本发明涉及4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺(即下文中的“化合物I”)或其药学可接受的盐在制备用于治疗与突变的RET激酶相关疾病、特别是在RET激酶中含有至少一处突变的甲状腺癌的药物中的用途；涉及化合物I或其药学可接受的盐在治疗与突变的RET激酶相关疾病、特别是在RET激酶中含有至少一处突变的甲状腺癌中的用途；涉及治疗患有与突变的RET激酶相关疾病、特别是在RET激酶中含有至少一处突变的甲状腺癌的温血动物、包括哺乳动物、特别是人的方法，包括向需要这种治疗的所述哺乳动物施用有效剂量的化合物I或其药学可接受的盐。
人RET基因位于染色体10q11.2上，其包含21个外显子，可编码蛋白RET激酶——一种受体酪氨酸激酶(Takahashi M.和G.M.Cooper，1987，Mol.Cell.Biol.3：1378-1385)。受体酪氨酸激酶可为各种不同地过程转换细胞外信号，如细胞生长、存活和程序化细胞死亡、分化及迁移。成熟糖基化蛋白的大小为170kD，并含有三个主要结构域：涉及于配体结合的细胞外结构域，其由类钙粘着蛋白及富半胱氨酸区域组成；跨膜结构域；以及细胞内部分，其含有被27个氨基酸插入分开的酪氨酸激酶结构域(TK)。
RET原癌基因涉及神经嵴起源细胞的生长、存活、分化和迁移的调控。RET激酶的四个配体已经被确定：神经胶质细胞源性神经营养因子、neurturin、persephin以及artemin。在结合配体之后，RET激酶被诱导成为二聚体，从而激活受体的激酶活性、于所选酪氨酸残基上进行自磷酸化作用并通过效应子与受体的特定酪氨酸磷酸化结构域的相互作用启动细胞内信号传导。涉及髓样甲状腺癌或乳头状甲状腺癌发生的RET基因突变编码组成型活性受体，其中，控制其活化的关键调控功能之一已被破坏。在散发性乳头状甲状腺癌中，已观察到导致其酪氨酸激酶功能组成性激活的RET重排(RET/PTC)。在小鼠中，借助甲状腺球蛋白基因启动子在甲状腺中靶向表达RET/PTC，从而使其产生乳头状甲状腺癌，如此过程所示，此种致癌性攻击(hit)很可能涉及疾病的起因过程。
在美国，每年约诊断18,000例新发甲状腺癌病例。在这些病例中，约90％是起源于甲状腺滤泡细胞的乳头状甲状腺癌(PTC)。髓样甲状腺癌(MTC)起源于分泌降钙素的滤泡旁细胞，其在所有甲状腺癌中占5至10％。
已发现不定比例的散发性及放射线诱导的乳头状甲状腺癌(PTC)存在涉及含有酪氨酸激酶(TK)的RET激酶3’半部分和其他基因的5’端的体细胞转位。此重排导致的融合蛋白通常允许RET酪氨酸激酶的组成型激活，导致PTC形成。
多至75％的所有髓样甲状腺癌病例均为散发性的，约25％的髓样甲状腺癌为遗传性的，其或者为II型多发性内分泌腺瘤形成(MEN2)的一部分，或者为家族性髓样甲状腺癌(FMTC)。RET原癌基因的种系突变通过常染色体显性传递方式赋予所有遗传型MTC易感性。
依据所涉及的器官，MTC的遗传型——MEN2被分为三个亚型。多发性内分泌腺瘤形成包含MTC、约占病例的50％的嗜铬细胞瘤(PC)以及占病例的15％至30％的甲状旁腺功能亢进。2A型MEN最常见，可能占所有MEN病例的90％以上。MEN 2A及FMTC家族的RET分析揭示，在受影响的个体中存在种系突变，而在未受影响的个体或正常对照中不存在种系突变。在每一病例中，均发现外显子10中的五个特定半胱氨酸密码子(C609、C611、C618、C620、C790)之一或V804或外显子11(C634)产生突变。在98％的非相关典型MEN2A家族中检测到突变，并在85％的FMTC家族中也发现有突变。在MEN 2B中，单点突变已被确定：氨基酸883、氨基酸922或于95％病例中的外显子16中的氨基酸918。
在下文中被称为化合物I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺具有下式：
化合物I的游离碱及其可接受的盐公开于欧洲专利申请0564409中。
化合物I的药学可接受的盐为药学可接受的酸加成盐，例如与无机酸如盐酸、硫酸或磷酸的盐，或与合适的有机羧酸或磺酸的盐，例如脂肪族一元或二元羧酸如三氟乙酸、乙酸、丙酸、羟乙酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸或草酸，或氨基酸如精氨酸或赖氨酸，芳香族羧酸如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸，芳香族-脂肪族羧酸如扁桃酸或肉桂酸；杂芳族羧酸如烟酸或异烟酸，脂肪族磺酸如甲-、乙-或2-羟基-乙-磺酸，或芳香族磺酸如苯-、对甲苯-或萘-2-磺酸。
下文中命名为“盐I”的化合物I甲磺酸盐和化合物I甲磺酸盐α和β晶形公开于1999年1月公布的国际专利申请WO 99/03854中。
令人惊讶的是，现已发现化合物I、例如盐I可用作用于治疗与突变的RET激酶相关疾病的治疗剂，特别是于RET激酶中含至少一处突变的甲状腺癌时。
化合物I或其药学可接受的盐、例如盐I于体外抑制突变的RET激酶转化的成纤维细胞的生长。RET激酶融合蛋白(RET重排如RET/PTC1和RET/PTC3)的自磷酸化作用及磷脂酶C-γ(RET激酶的PLC-γ下游效应子)的磷酸化作用可为化合物I或其药学可接受的盐、例如盐I所抑制。
因此，本发明涉及治疗患有与突变的RET激酶相关疾病、特别是在RET激酶中含有至少一处突变的甲状腺癌的温血动物的方法，其包括向需要这种治疗的所述动物施用对所述疾病治疗有效量的化合物I或其药学可接受的盐、例如盐I。
本发明涉及向患有与突变的RET激酶相关疾病、特别是在RET激酶中含有至少一处突变的甲状腺癌的人类对象施用化合物I或其酸加成盐、优选4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺的单甲磺酸盐的方法。
RET重排在儿童乳头状甲状腺癌中特别常见。
在一项实施方案中，本发明具体地提供了治疗儿童甲状腺癌的方法。
在另一项实施方案中，本发明提供了治疗由辐射暴露所致甲状腺癌的方法。
此文中所使用的术语“与突变的RET激酶相关疾病”包括但不限于以下疾病：
●甲状腺癌
●乳腺癌
●与RET癌基因激活相关的其他肿瘤，例如肾上腺髓质肿瘤(嗜铬细胞瘤(PC))和粘膜神经瘤
●甲状旁腺功能亢进(HPT)和甲状旁腺增生
●希施斯普龙病
●皮肤苔藓样淀粉样变
此文中所使用的术语“甲状腺癌”包含但不限于例如II型多发性内分泌腺瘤形成(MEN2)、髓样甲状腺癌或乳头状甲状腺癌及未分化甲状腺癌(anaplastic thyroid cancer)。
优选地，化合物I或其药学可接受的盐用于治疗II型多发性内分泌腺瘤形成(MEN2)、髓样甲状腺癌或乳头状甲状腺癌。
依照本发明，化合物I或其药学可接受的盐用于治疗异于未分化甲状腺癌的甲状腺癌。
术语“治疗”包括向需要这种治疗的温血动物施用化合物I或其药学可接受的盐、例如盐I，旨在治愈肿瘤或产生肿瘤消退或延缓疾病进展的效果。
此文中所使用的术语“延缓进展”指的是肿瘤的生长或者通常而言的疾病的进展因治疗而至少被减慢或牵制，同时与未经治疗或使用安慰剂治疗患者相比，接受此治疗的患者显示更高的存活率。
术语“突变的RET激酶”包括但不限于密码子中至少有一个点突变的、有导致融合蛋白的基因重排或有失调控表达的RET激酶蛋白。
依照本发明的药物组合物可以以本身已知的方法制备，同时其适合经肠如经口或直肠及胃肠外施用于温血动物、包括人类，该药物组合物包含单独或与一种或多种药学可接受载体、特别是适合经肠或胃肠外应用的载体组合的治疗有效量的至少一种药理学活性成份。本发明剂型的优选施用途径为口服。
相关技术领域技术人员完全能够选择相关试验模型以证明此文中所述的对与突变的RET激酶相关疾病、特别是在RET激酶中含有至少一处突变的甲状腺癌的有益效果。例如，通过下述实施例、通过体外试验和裸鼠或转基因小鼠中的体内试验或于合适的临床研究中均可证明此种化合物的药理学活性。合适的临床研究可为例如在患有转移性髓样甲状腺癌患者中的开放、非随机化的剂量递增研究。在这些研究中确定治疗疗效，例如通过每六周评定肿瘤大小、通过合适的血清肿瘤标记物或者通过闪烁造影肿瘤检测，其中对照获自与活性成份配对的安慰剂。
化合物I或其药学可接受的盐、例如盐I的有效剂量可取决于所使用的特定化合物或药物组合物、施用模式、所治疗甲状腺癌的类型或所治疗甲状腺癌的严重性而异。剂量方案根据许多其他因素进行选择，包括患者的肾脏和肝脏功能。普通技能的内科医师、临床医师或兽医可很容易地确定防止、对抗或阻滞病情进展所需化合物的有效量并开具处方。
依照物种、年龄、个体状况、施用方式以及所讨论的临床症象，向约70kg体重的温血动物施用有效剂量的化合物I或其药学可接受的盐、例如盐I，例如对应于约10-1000mg活性化合物(游离碱)、优选50-600mg、特别是100至400mg的每日剂量。对于患有甲状腺癌或相关疾病的成年患者，可推荐每日200或400mg的起始剂量。青少年的每日剂量为100-400mg/m2体表面积、最优选340mg/m2。对于评估治疗反应后，治疗反应不足的患者，可谨慎考虑剂量递增，只要患者从治疗中获益并且没有限定的毒性，均可对患者进行治疗。
本发明还涉及向患有与突变的RET激酶相关疾病、特别是在RET激酶中含有至少一处突变的甲状腺癌的人类对象施用化合物I或其药学可接受的盐的方法，其包括向人类对象施用药学有效量的化合物I或其药学可接受的盐，例如每日一次，例如使用期超过三个月。本发明特别涉及这样的方法，其中向成人施用50至600mg、优选100至400mg的每日剂量，向青少年施用200至400mg/m2体表面积、最优选340mg/m2体表面积的每日剂量。
实施例
细胞系：将大鼠甲状腺细胞系PCCL3置于由Coon’s培养基/F12高锌组成的H4完全培养基中，培养基中补充以5％FBS、0.3mg/ml L-谷氨酰胺、1mU/ml TSH、10μg/ml胰岛素、5μg/ml脱铁运铁蛋白、10nM皮质醇和青霉素/链霉素。所使用的表达体系由Bujard及其同事开发，可以导致基于高度特异性的大肠杆菌tet抑制子-操作子与强力霉素相互作用的强力霉素诱导性表达。进行稳定的转染，首先建立组成型表达反式激活蛋白rtTA(由rtetR结合结构域和VP16激活结构域的融合组成)的克隆系。然后通过瞬时转染受tet-操纵子控制的荧光素酶报道构建体来探测各rtTA-表达克隆的强力霉素诱导性表达。选择证明有非常低或无法检测到的基础荧光素酶活性及经强力霉素显著诱导(即＞100倍)的rtTA克隆作为用于第二次稳定转染的宿主，第二次将转染使用由含有tet-操纵子序列、克隆在RET/PTC1或RET/PTC3 cDNA上游的最小CMV启动子组成的构建体。
RET/PTC1或RET/PTC3产生自染色体重排，该重排连接非相关基因的启动子与丢失细胞外及跨膜结构域的RET激酶的C末端片断。此重排导致被组成型激活的截断型RET激酶的生成。
最常见的RET激酶种系突变为突变的氨基酸634-半胱氨酸，其导致组成型二聚作用及受体的激活。
实施例I：体外激酶反应
将RET/PTC3(PCCL3)细胞的融合T-75烧瓶在有或无强力霉素下孵育24小时，然后以含0.2mM原钒酸钠的冰冷PBS清洗。再使用冰冷的RIPA缓冲液(20mM Tris pH7.4、150mM NaCl、1％Nonidet P-40、1％Tween20、20mM氟化钠、1mM原钒酸钠、1mM EGTA、5mM EGTA、0.2mMPMSF和Sigma蛋白酶抑制剂混合物)于4℃恒定搅拌20分钟以溶解细胞。然后将溶胞产物通过26-口径的针以分散大团粒，并于4℃以10,600g离心20分钟以得到总的溶胞产物。将所清除的上清液与抗RET激酶抗体(SantaCruz山羊多克隆抗体)于4℃一起孵育2小时，然后再与预先经RIPA缓冲液清洗的蛋白质AG琼脂糖(Santa Cruz)一起孵育，之后于4℃孵育90分钟。将免疫复合物于清洗缓冲液(50mM HEPES pH7.2、20mM MnCl2、5mM MgCl2)中旋转清洗两次，再使用激酶缓冲液(清洗缓冲液加0.5mM二硫苏糖醇)最后清洗一次。然后于20μl含DMSO(0.5％)或含用DMSO稀释的抑制剂的孵育缓冲液中进行激酶分析。通过加入含有比活性为140nCi/pmol的γP32-ATP(Perkin-Elmer＞6000Ci/mmol)的ATP混合物，并于室温孵育25分钟进行反应，一式两份。使用STOP缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液、1％Trition X-100、0.1％脱氧胆酸钠、1mM原钒酸钠、1mM ATP、5mM EDTA、5ug/ml抑酶肽)清洗两遍以终止反应。在第二遍清洗后，将反应于35μl Laemmli缓冲液中煮沸10分钟，将蛋白质进行SDS-PAGE(7.5％)电泳，并在其转移至硝化纤维素膜后，以PhosphoImager光密度测定法(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)测定其磷酸化作用。然后将蛋白负荷量标化为总RET激酶蛋白，后者通过使用山羊多克隆抗RET激酶抗体(Santa Cruz)或小鼠单克隆抗体(Cincinnati大学)的Western印迹分析确定。
100nM的盐I抑制RET/PTC3的自磷酸化作用40％。
实施例2：盐I对表达组成型活性RET MEN2A的NIH3T3细胞生长的影响
RETC634突变是RET激酶的最常见种系突变，其发生于85％的IIA型多发性内分泌腺瘤形成中。研究了盐I对稳定表达组成型活性形式的RET激酶(RETC634突变)的NIH3T3细胞生长的影响。
使表达组成型活性RET MEN2A的NIH3T3细胞于6孔平板铺板过夜。然后使其于含有盐I500nM或含有载体溶剂(对照)的1％或5％血清存在下生长9天，每3天更换培养基。在开始处理后的第9天，以EDTA/胰蛋白酶溶液收集细胞后，进行细胞计数。条件血清 1％ 5％对照载体++ ++盐I500nM-+ -+细胞减少的百分数％042 015
盐I可抑制RET激酶转化的NIH3T3成纤维细胞的生长。
实施例3：盐I对RET/PTC激活(磷脂酶C)PLCγ的影响
RET激酶联合PLCγ并使PLCγ磷酸化。为进一步探讨盐I对RET激酶活性的影响，检查了用盐I预处理对PLCγ磷酸化的作用。
将Ret-PTC3细胞以105细胞/孔接种于6孔Corning平板上。3天后，将细胞于250nM盐I存在下，使用或不使用强力霉素处理24小时。然后使用含0.1mM原钒酸钠的冷PBS(磷酸缓冲盐水)漂洗细胞两遍，并于4℃将其置于冰冷的RIPA缓冲液中轻轻振荡20分钟。于4℃以10,600g离心20分钟收集溶胞产物。通过考马斯蓝分析法(Piece，Rockford，IL)对上清液等分试样进行蛋白分析，通过如下步骤进行Western印迹分析：以100μg蛋白质进行SDS-PAGE(5％)电泳、转移至硝化纤维素膜并先使用anti-phospho PLCγ抗体(Cell Signaling)探测、之后使用抗PLCγ(CellSignaling)进行标化。
在250nM盐I存在时，与不含盐I的对照相比，PLCγ的磷酸化作用被抑制28％。
实施例4：含有4-[(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐β-晶形的胶囊
按以下组成制备含有相当于100mg化合物I(游离碱)的119.5mg盐I作为活性物质的胶囊：
组成
盐I 119.5mg
纤维素MK GR 92mg
聚乙烯聚吡咯烷酮XL 15mg
Aerosil 200 2mg
硬脂酸镁 1.5mg
230mg
将各组分混合并将该混合物装填入1号硬明胶胶囊中以制备胶囊。
实施例5：含有4-[(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐β-晶形的胶囊
按以下组成制备含有相当于100mg化合物I(游离碱)的119.5mg盐I作为活性物质的胶囊：
组成
活性物质 119.5mg
微晶纤维素(Avicel) 200mg
PVPPXL 15mg
Aerosil 2mg
硬脂酸镁 1.5mg
338.0mg
将各组分混合并将该混合物装填入1号硬明胶胶囊中以制备胶囊。