蛋白质制剂 【发明领域】
本发明属于肽和蛋白质化学领域，因为它适用于人类医学。具体来说，本发明涉及制备含有烟酰胺和疏水性防腐剂的稳定的可溶肽和蛋白制剂。
【发明背景】
烟酰胺不是人们广泛接受的药用制剂中的赋形剂。例如在Handbook of pharmaceutical Excipients，第二版，A Wade & P.Weller编辑(1994)中没有将烟酰胺归入赋形剂。但是已知烟酰胺可增加微溶的非蛋白低分子量化合物的溶解性，例如某些哌嗪和哌嗪并化合物(piperazido and piperazino compounds)[Fawzi等，J.Pharmaceut.Sci.69:104-106(1980)]、抗癌核苷类似物[Truelove等，Int.J.Pharmaceutics 19:17-25(1984)]、扑热息痛[Hamza等，Drug Dev.Industr.Pharmacy11:1577-1596(1985)]、安定、灰黄霉素、黄体酮、17β-雌二醇和睾丸素[Rasool等，J.Pharmaceut.Sci.80:387-393(1991)]、吩噻嗪衍生物、乙吗噻嗪[Hussain等，J.Pharmaceut.Sci.82:77-79(1993)]和核黄素[Coffman等，J.Pharmaceut.Sci.85:951-954(1996)]。
在以上引述的制剂中，当将烟酰胺以高浓度加入时，烟酰胺明显地起作增加另一种溶质溶解性的水溶助剂的作用。这种促水溶现象与在一种微溶物质溶液中加入第二种溶质导致较少溶解的物质以致沉淀的通常溶液现象正好相反。
从前Jorgensen在美国专利第5,382,574号中描述了任选含有防腐剂的胰岛素和烟酰胺的组合物。据报道,该制剂促进胰岛素从注射部位加速吸收。Jorgensen没有论及烟酰胺对制剂稳定性的任何影响。并且，可能没有观测到或认识到烟酰胺的作用，因为该说明书特别推荐，加入已知的稳定剂如磷脂稳定所述制剂。此外，它没有论及单是烟酰胺对胰岛素稳定性产生的任何影响。
肽和蛋白质制剂中分子间的相互作用是复杂的，因为必须考虑多种因素如防腐剂、缓冲剂、离子强度、pH、温度和其它赋形剂的选择，才能获得适合生产、运输和储藏并满足这类产品常规要求的较稳定地制剂。因为含有防腐剂的制剂中的特定肽或蛋白质分子的复杂性以及该肽或蛋白发生聚集并沉淀的倾向性，所以引起聚集的每一因素的作用不能确定。鉴于该复杂性和发生聚集的倾向性，因此迄今既不能根据现有技术描述的烟酰胺作为较小分子的水溶助剂的作用，也不能根据其促进胰岛素从皮下注射吸收的周知的能力，预测烟酰胺对含有疏水性防腐剂的肽和蛋白制剂的稳定性的影响。
因此，本发明提供增强药用肽和蛋白在疏水性防腐剂存在下的物理稳定性的条件，并使得可以用具有市场前景的多用途可溶性药用产品来治疗多种人类疾病。
发明概述
本发明提供含有药用肽或蛋白、疏水性防腐剂和烟酰胺的稳定的可溶制剂。
本发明还提供制备所述制剂的方法，所述方法包括组合肽或蛋白、疏水性防腐剂和烟酰胺以生产所述制剂。
发明详述和优选实施方案
为了本文公开和要求保护的本发明目的，如下定义以下术语和缩写：
给药-其作用是将本发明制剂输入其需要哺乳动物体内的行为。可通过一般技术医师已知的任何有效途径给药。胃肠外给药在医学文献中通常认为是通过无菌注射器或某些其它机械装置如输液泵将药物剂型输入人体内。周围胃肠外给药途径包括但不限于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药途径。
烷基对羟基苯甲酸酯-是指C1-C4烷基对羟基苯甲酸酯或其混合物。烷基对羟基苯甲酸酯优选为甲基对羟基苯甲酸酯、乙基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯或丁基对羟基苯甲酸酯。
甲酚-是指间甲酚、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚或其混合物。
疏水性防腐剂-是指加入药用制剂中起作抗微生物剂作用的疏水性化合物。胃肠外制剂必须符合多用途商品有效保藏指南。有效而且胃肠外制剂可用的本领域已知的疏水性防腐剂有烷基对羟基苯甲酸酯、酚类防腐剂、苄醇、氯丁醇、苯甲酸和它们的各种混合物。参见例如WALLHAUSER,K.-H.,DEVELOP.BIOL.STANTDARD.24，第9-28页(Basel,S Krager,1974)。
等渗剂-是指生理上耐受并且使得所述制剂具有合适张力以防止水跨细胞膜的净流量的化合物。化合物如甘油通常以已知浓度用于这样的目的。其它可用的等渗剂包括盐(例如氯化钠)和糖(如葡萄糖、甘露醇和蔗糖)。
烟酰胺-是指下式化合物：
药学上可接受的缓冲剂-用药学上可接受的缓冲剂可以缓冲所述制剂的pH，这样的缓冲剂例如但不限于乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠、TRIS或碱性氨基酸如组氨酸、赖氨酸或精氨酸。其它药学上可接受的缓冲剂为本领域已知的。缓冲剂的选择和浓度是本领域已知的。
酚类防腐剂-是指苯酚和甲酚。
可溶的-是指相对不存在肉眼可见的聚集蛋白。通过检测制剂的浊度可推知所述制剂中的蛋白聚集程度。所述制剂的浊度越高，则所述制剂中的蛋白聚集程度越高。通常用比浊法测定而且用Nephalometric Turbidity Unit (NTU)度量浊度。
稳定-“稳定”制剂是指其中所述蛋白或肽在储藏条件下保持溶解时间延长的制剂。
本文所用的治疗-是指为了克制疾病、病症或障碍而对患者的处理和护理，包括给予本发明制剂以预防症状或并发症的发生、缓解症状或并发症、或者消除所述疾病、病症或障碍。本文所用的治疗包括为美容目的而给予所述蛋白。美容的目的是控制哺乳动物体重以改善体型外貌。
在一个实施方案中，本发明涉及含有疏水性防腐剂、烟酰胺和药用肽或蛋白的制剂，所述肽或蛋白定义为包括天然激素和功能性类似物(排除胰岛素和胰岛素类似物以及leptin和leptin类似物)、天然细胞因子和功能性类似物、可溶性蛋白疫苗和抗体以及所有类型的抗体片段。
提供以下所列的药用肽和蛋白，其目的是说明本发明而不是以任何方式限制符合本发明的药用肽和蛋白的范围，所述药用肽和蛋白是：催产素、加压素、促肾上腺皮质激素和类似物、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、催乳素、促黄体生成素释放激素、生长激素、生长激素释放激素、促生长素抑制素、胰高血糖素、GLP-1相关化合物、IL-2、IL-10、IL-15、干扰素-α、β、γ、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿胃泌素、促胰液素、降钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧张素、促甲状腺素释放激素、肿瘤坏死因子、神经生长因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、肾素、缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、粘菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽。
一组更优选的药用肽和蛋白，定义为用于本说明书目的的“组Ⅰ多肽”，包括酰化胰岛素、特别是对胰岛素B-链赖氨酸的ε氨基的C6-C20酰化、尤其是C14酰化的LysB28 ProB29人胰岛素，哺乳动物生长激素，生长激素释放激素、GLP-1相关化合物、红细胞祖细胞激素(EPO)、甲状旁腺激素和片段，特别是美国专利第4,086,196和5,208,041号所公开的激素,β-促脂解素，成纤维细胞生长因子-8和类似物，osteoprotegrin-2和3，白细胞介素-10和15和其类似物，血管内皮生长因子和促卵泡激素(FSH)和变异体。
本文定义的促卵泡激素“FSH”(无论是重组产生还是分离产生的)和促卵泡激素变异体“FSH变异体”是本领域周知的。本文所用的FSH是指作为全长成熟蛋白产生的FSH，它包括但不限于无论是重组还是从人类资源分离的人FSH或“hFSH”(参见Shome B.等，J.ProtChem.,7:325-339,1988；Saxena B.B.和Rathnam P.,J Biol.Chem.,251:993-1005,1976；Watkins等，DNA,6:205-212,1987；Shome B.和ParloW A.F.,J.Clin Endocrinol.Metab.,39(1):203-205,1974；和Beck等，DNA,4:76,1985；U.S.5,405,945和U.S.5,639,640))，每一引用文献通过引用结合到本文中。此外，本领域已知或了解不同FSH变异体(参见Shome,J.Clin.Endocrin.Metab 39:187(1974)；Saxena,J.BiolChem 251(4):993-1005(1976)；1978；Sairam等，Biochem J 197:541(1981)；此外参见Closset Eur.J Biochem 86:115-120；Fujiki,J.Biol.Chem.253:5363-5368(1978)；Sairam,Biochem.J.197:541-552(1981),每一引用文献通过引用独立结合到本文中)。现有技术的FSHβ亚单位应该包括Saxena序列和Sairam在讨论(a)进化上保守的氨基酸和(b)在测序中周知的特征性错误中论及的一类序列。本领域技术人员还了解到(ⅰ)化学上相似的氨基酸或(ⅱ)进化上保守的氨基酸取代现有技术鉴定的氨基酸对包含由此修饰的hFSHβ亚单位的FSH杂二聚体的生物活性没有明显影响。
具体地说,Sairam对Saxena hFSH序列的评论以及其对功能性FSH分子之间确立的氨基酸取代的讨论定义了一类现有技术的FSHβ链序列。更具体地讲，1981年Sairam(Sairam,Biochem J197:541,551(1981))公开确立了Saxena等，Shome等，Closset等和Fujiki等的公开涉及的保守氨基酸序列。现有技术(1)证明Saxena的FSHβ链序列优于Shome的序列；(2)阐明了羧基末端异质性问题；(3)说明受种间差异影响的分子部分不是所述激素活性所必需的，以及(4)关注根据种间和三种人糖蛋白激素FSH、LH和TSH的β链之间的同源性提出的指南。
除了猪FSH-s之外，C末端异质性见于所有公开序列的报道，其中谷氨酸是唯一的C末端残基。还发现Saxena确定的位置27的色氨酸残基支持进化上的保守论证，因为已证明在所有现有技术的种中FSH-B位置24是色氨酸。关于位置44和46,Saxena证实位置44的残基应该是精氨酸而不是赖氨酸，位置46是赖氨酸而不是精氨酸。猪、马和羊的序列也反映了对保守位置44的精氨酸的进化压力。在21、22和44三个位置的变异体涉及结构保守性或进化保守性(“同源”)取代，其中每一个均具有生物活性。
Sairam、Shome和Closset的各参考文献公开位置21-22为异亮氨酸、丝氨酸残基，而Saxena公开为亮氨酸、苏氨酸，Fujiki公开在这些位置为异亮氨酸、苏氨酸。这些公开中的每一个不仅是进化保守取代，而且也是结构保守取代。于位置41上在Sairam、Shome、Closset和Fujiki均公开的天冬氨酸和Saxena、Closset和Sairam公开的天冬酰胺之间的变化涉及两种进化保守残基，其中每一种均具有生物活性。这些保守取代和进化保守取代的公开指导技术人员区分hFSH-B链类中的FSHβ链变异体。
一组更优选的药用肽和蛋白包括GLP-1相关化合物和天然哺乳动物生长激素。
一组符合本发明的更优选的肽是本文定义的胰高血糖素样肽-1、其类似物和衍生物。
上述肽和蛋白的水溶性共聚物和聚合物缀合物也符合本发明，而且包括例如聚乙二醇、乙二醇/聚乙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环己烷、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规或非无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚乙二醇均聚物聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚苯乙烯马来酸酯和聚乙烯醇。优选聚乙二醇丙醛。
术语“GLP-1”是指其序列和结构均是本领域已知的人胰高血糖素样肽-1。参见美国专利第5,120,712号，通过将其引用结合到本文中。存在两种天然形式的人GLP-1即GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2，只有当需要时才对它们进行区分。
术语“GLP-1类似物”定义为与GLP-1比较具有一个或多个取代、缺失、翻转或添加的分子。许多GLP-1类似物是本领域已知的，而且包括例如GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Val8-GLP-1(7-37)、Gln9-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。优选的GLP-1类似物为美国专利第5,118,666号公开的GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)，该专利通过引用结合到本文中。
术语“GLP-1衍生物”定义为具有GLP-1或GLP-1类似物的氨基酸序列但是还具有其一个或多个其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸基化学修饰的分子。化学修饰包括但不限于添加化学部分、产生新的键和去除化学部分。氨基酸侧基修饰包括但不限于酰化赖氨酸e-氨基，N-烷基化精氨酸、组氨酸或赖氨酸，烷基化谷氨酸或天冬氨酸羧酸基和脱酰胺谷氨酰胺或天冬酰胺。末端氨基修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。末端羧基修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1-C4烷基。而且，一个或多个侧基或末端基团可以用一般蛋白质化学家已知的保护基保护。氨基酸的α-碳可以是一甲基化或是二甲基化的氨基。
术语“GLP-1分子”是指GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物。
另一组优选的GLP-1类似物定义为下式化合物及其药学上可接受的盐：
R1-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-
Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-
Lys-Gly-Arg-R2 SEQ ID No:1其中：R1选自L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基-组氨酸、b-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸；X选自Ala、Gly、Val、Thr、Ile和α-甲基-Ala；Y选自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；Z选自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；R2选自NH2和Gly-OH；前提是R1是His，X是Ala、Y是Glu和Z是Glu，R2必须是NH2。
再一组符合本发明的优选GLP-1化合物公开于WO 91/11457(美国专利第5,545,618号，通过引用结合到本文中)，基本上包括GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)或它们的酰胺形式，以及其药学上可接受的盐，具有至少以下一种修饰：
(a)甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸或D-赖氨酸取代位置26和/或位置34的赖氨酸；或甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸或D-精氨酸取代位置36的精氨酸；
(b)氧化抗性氨基酸取代位置31的色氨酸；
(c)至少一种以下取代：酪氨酸取代位置16的缬氨酸；赖氨酸取代位置18的丝氨酸；天冬氨酸取代位置21的谷氨酸；丝氨酸取代位置22的甘氨酸；精氨酸取代位置23的谷氨酰胺；精氨酸取代位置24的丙氨酸；和谷氨酰胺取代位置26的赖氨酸；和
(d)至少以下一种取代：甘氨酸、丝氨酸或半胱氨酸取代位置8的丙氨酸；天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸取代位置9的谷氨酸；丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸取代位置10的甘氨酸；和谷氨酸取代位置15的天冬氨酸；和
(e)甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸、或D-或N-酰化或烷基化形式的组氨酸取代位置7的组氨酸；其中在所述取代为(a)、(b)、(d)和(e)时，所述取代的氨基酸可任选为D-型而且在位置7的取代氨基酸可任选为N-酰化或N-烷基化形式。
又一组符合本发明的GLP-1分子也描述于WO 98/08871，包括连接于N-末端或C-末端氨基酸残基的亲脂性取代基，其中所述取代基是烷基或具有ω羧基的基团。
因为所述酶二肽基-肽酶Ⅳ(DPPⅣ)可以产生观测到的快速体内失活所给予的GLP-1(参见例如Mentlein，R.等，Eur.J.Biochem.,214:829-835(1993)]，所以优选给予保护避免DPPⅣ酶解的GLP-1类似物和衍生物，更优选给予Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、α-甲基-Ala8-GLP-1(7-36)NH2和Gly8-Gln21-GLP-1(7-37)OH或其药学上可接受的盐。
在本发明中优选使用在美国专利第5,188,666号要求保护的分子，该专利通过引用结合到本文中。这种分子选自具有以下氨基酸序列的肽：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-
Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-
Val-X SEQ ID No:2其中X选自Lys和Lys-Gly；和所述肽的衍生物，其中所述肽选自：所述肽药学上可接受的酸加成盐、所述肽药学上可接受的羧酸盐、所述肽药学上可接受的低级烷基酯和选自酰胺、低级烷基酰胺和低级二烷基酰胺的所述肽药学上可接受的酰胺。
另一组优选基团用于本发明的GLP-1分子包括在美国专利第5,512,549号(通过引用结合到本文中)中公开的以下通式1的化合物及其药学上可接受的盐：
R1-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-
Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-其中R1选自4-咪唑丙酰基、4-咪唑乙酰基或4-咪唑-a,a-二甲基-乙酰基；R2选自C6-C10非支链酰基或不存在；R3选自Gly-OH或NH2；Xaa是Lys或Arg，在本发明中可使用。
适用于本发明的更优选的式1化合物是其中Xaa为Arg和R2为C6-C10非支链酰基的化合物。
适用于本发明的高度优选的式1化合物是其中Xaa为Arg、R2是C6-C10非支链酰基和R3为Gly-OH的化合物。
适用于本发明的更加高度优选的式1化合物是其中Xaa为Arg、R2为C6-C10非支链酰基、R3为Gly-OH和R1为4-咪唑丙酰基的化合物。
适用于本发明的最优选的式1化合物是其中Xaa为Arg、R2为C8非支链酰基、R3为Gly-OH和R1为4-咪唑丙酰基的化合物。
高度优选在本发明中使用美国专利第5,705,483号(通过引用结合到本文中)要求保护的Val8-GLP-1(7-37)OH或其药学上可接受的盐。
制备可用于本发明的GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物的方法是本领域周知的而且一般技术的蛋白质化学工作者或生物化学工作者容易掌握。可用固相合成化学法、从天然资源纯化GLP-1分子或者重组DNA技术制备在本发明中使用的活性化合物或其前体的氨基酸部分。常规合成有机技术可使GLP-1衍生物烷基化和酰化。
术语“GLP-1相关化合物”是指属于所述GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物定义的任何化合物。
通过制备本发明制剂，以及将其浊度与缺乏烟酰胺的对照的浊度相比较，证实烟酰胺对制剂稳定性的意外作用。
用常规溶解和混合方法可制备本发明胃肠外制剂。制剂学一般技术人员应该知道加入药用肽或蛋白、疏水性防腐剂和烟酰胺的顺序可不同，而不会损害制得制剂的稳定性。
在本发明的一个实施方案中，可在纯化的肽或蛋白溶液中加入烟酰胺，然后冻干，在固态情况下不会负面影响化学或物理稳定性。当用含有疏水性防腐剂而不含有烟酰胺的稀释剂复制时，所述蛋白制剂具有很高的物理稳定性，是因为在所述制剂中存在烟酰胺。相反，本发明稳定制剂可以如下制备：将称量的纯冻干蛋白溶解于水中，然后加入一足够量已测体积的烟酰胺和疏水性防腐剂溶液，以获得所需要的浓度。还可以加入任选的化合物如等渗剂或药学上可接受的缓冲剂。所述制剂的pH可用例如盐酸或氢氧化钠溶液调节。制成后，本发明制剂一般在给予前过滤除菌。本发明制剂可用本领域一般技术人员容易操作的许多其它方法制备。例如一般技术人员可优化所述成分组合的方式和条件、用来调节pH的酸或碱的类型和将所述制剂除菌的方法。
在本发明制剂中使用的疏水性防腐剂和烟酰胺容易从商业供应商得到符合给予人类的常规要求的足够量产品。
除了所述药用肽和蛋白、疏水性防腐剂和烟酰胺之外，本发明制剂可任选含有其它化合物。例如在所述制剂中可任选加入药学上可接受的增溶剂如吐温20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)、吐温40(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、吐温80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、P1uronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)以降低聚集。如果使用泵型容器或塑料容器给予所述制剂则这些添加剂特别有用。药学上可接受的表面活性剂也可减少蛋白聚集。等渗剂优选甘油可任选加入到所述可溶性胃肠外制剂中。胃肠外制剂中的等渗剂的浓度范围是本领域已知的，优选约1-25mg/mL、更优选约8-16mg/mL或约16mg/mL-约25mg/mL，甚至更优选约16mg/mL。可任选加入药学上可接受的缓冲剂控制pH。
如上所述，本发明提供包含药用肽或蛋白、疏水性防腐剂和烟酰胺的可溶性制剂。所述烟酰胺浓度优选为0.01-2M。烟酰胺浓度的其它优选范围为0.05-1.5M；0.1-1.0M；0.1-0.5M；0.5-1.0M；0.15-0.25M。因为在所述制剂中加入了烟酰胺，所以在某些防腐剂存在下所述肽和蛋白保持溶液状态，使得可以制备相对没有蛋白聚集的多用途胃肠外制剂。
单独或联合应用的酚类防腐剂是用于本发明制剂的优选防腐剂。另一组优选防腐剂为烷基对羟基苯甲酸酯防腐剂。苄醇和苯甲酸是其它的优选防腐剂。更为高度优选的防腐剂是苯酚和间甲酚，单独或联合使用。当联合使用时，所述制剂中苯酚与间甲酚的摩尔比优选为3∶1和1∶3，而防腐剂的总浓度优选为约1-10mg/mL。防腐剂浓度是保持有效防腐要求的浓度，而该浓度在其它可变因素中又取决于防腐剂、其溶解性和所述制剂的温度和pH。一般来说，必需的防腐剂的量可见于参见例如WALLHAUSER,K.-H.,DEVELOP.BIOLSTANDARD.24，第9-28页(Basel,S Krager,1974)。
一般来说，所述药用肽或蛋白的浓度范围根据特定蛋白或肽的药理作用可以为约0.01-约100mg/mL。例如人生长激素的浓度为约0.25mg/mL-约40mg/mL。所述浓度优选为约0.25mg/mL-约25mg/mL。所述浓度更优选为约0.5mg/mL-约10mg/mL。其它优选浓度范围为约0.5mg/mL-约15mg/mL。
GLP-1相关分子的浓度范围为约0.01mg/mL-10mg/mL，优选为约0.1mg/mL-约5mg/mL，更优选为约0.25mg/mL-约1mg/mL。所述浓度最优选为约0.5mg/mL-约1.0mg/mL。
本发明制剂中药用肽或蛋白的溶解性使得所述制剂的浊度低于50NTU。所述浊度更优选低于20NTU。所述浊度最优选低于10NTU。
优选外周胃肠外给药。按照本发明制备的制剂可用胃肠外用注射器、注入器、泵或本领域已知的任何其它装置给药。为治疗特定疾病而给予的本发明制剂的剂量取决于若干因素，其中包括但不限于患者的性别、体重和年龄、疾病的潜在病因、给药途径和生物利用度以及特定肽或蛋白的效力。间隙性给药时，每次给药量也应该考虑给药间隔和所述制剂蛋白的生物利用度。可连续性给予本发明制剂。一般技术水平医师可确定给予本发明制剂的剂量和速率或频率以达到所需要的临床效果。
参照以下实施例可以更好地理解本发明。这些实施例代表本发明具体实施方案，而不是用来限制本发明范围。
实施例1
制备以下储备液并用于制备测试制剂。
在重组大肠杆菌中生物合成美国专利第5,705,483号描述的V8-GLP-1(7-37)OH，纯化至接近均一，然后冻干。将冻干肽样品溶解于水至终浓度为2mg/mL，所述水先前已用5N氢氧化钠将pH调节为9.0。然后用10％盐酸调节储备液至pH7.8。
1M烟酰胺水溶液。
100mM磷酸钠水溶液，pH7.8。
2％(w/v)苯酚水溶液。
1.2％(w/v)间甲酚水溶液。
纯苄醇。
冲洗用无菌水。
以下所示的全部制剂以5mM磷酸盐缓冲液和0.5mg/mL V8-GLP-1(7-37)OH的终浓度制备。磷酸盐缓冲液、烟酰胺和V8-GLP-1(7-37)OH储备液使用前通过0.22μm滤膜过滤。以适当比例混合储备液和试剂获得以下所示的制剂。加入的顺序为防腐剂、烟酰胺、缓冲剂、无菌水、V8-GLP-1。检测所述制剂的最终pH，必要时将其调节至7.8。用HACH2100AN浊度计测量样品的澄明度。# 烟酰胺 防腐剂 初始NTU 于5℃3天后的NTU1 0mM 0.3％间甲酚 48.495 98.142 100mM 0.3％间甲酚 3.6365 48.893 200mM 0.3％间甲酚 0.099 32.654 300mM 0.3％间甲酚 0.015 3.835 400mM 0.3％间甲酚 0.0995 0.056 0mM 0.5％苯酚 0.1765 44.197 100mM 0.5％苯酚 0.5965 32.488 200mM 0.5％苯酚 0.2115 20.199 300mM 0.5％苯酚 0.044 0.4710 400mM 0.5％苯酚 0.215 0.4711 0mM 1.5％苄醇 -0.1415 35.1212 100mM 1.5％苄醇 -0.055 22.8913 200mM 1.5％苄醇 -0.0165 -0.514 300nM 1.5％苄醇 0.1465 0.4215 400mM 1.5％苄醇 0.078 0.28
实施例2
制备在70mM磷酸盐缓冲液，pH7.4中含有5mg/mL GLP-1(7-37)OH的储备液并通过0.22μm滤膜除菌过滤。制备1％间甲酚的储备水溶液并通过0.22μm滤膜除菌过滤。制备2M烟酰胺储备水溶液并通过0.22μm滤膜除菌过滤。按下表所示混合储备液：GLP储备液 间甲酚储备液 烟酰胺储备液 DI水 烟酰胺终浓度0.800ml 1.200ml 0ml 2.000ml 0mM0.800ml 1.200ml 0.500ml 1.500ml 250mM0.800ml 1.200ml 1.000ml 1.000ml 500mM0.800ml 1.200ml 1.500ml 0.500ml 750mM0.800ml 1.200ml 2.000ml 0ml 1000mM
所有最终制剂制成4.0ml体积并含有1mg/ml GLP-1(7-37)OH、14mM磷酸盐缓冲液，pH7.4和0.3％作为防腐剂的间甲酚。请注意：总是在加入防腐剂前混合烟酰胺和蛋白。将所述GLP制剂于25℃老化(be aged)。证实所有含烟酰胺的制剂具有良好的物理稳定性，在4天内检测其浊度低于10NTU。所有不含烟酰胺制剂检测的浊度大于65NTU。
实施例3
制备在20mM柠檬酸盐缓冲液，pH7.5中含有20mg/mlhGH的储备液并通过0.22μm滤膜除菌过滤。制备1.5％间甲酚储备水溶液并通过0.22μm滤膜除菌过滤。按下表所示混合储备液：hGH储备液 间甲酚储备液 加入的烟酰胺 烟酰胺终浓度5.0ml 2.0ml 0mg 0mM5.0ml 2.0ml 611mg 500mM5.0ml 2.0ml 916mg 750mM5 0ml 2.0m1 1221mg 1000mM
所有最终制剂制成10ml体积并含有10mg/mlhGH、10mM柠檬盐缓冲液，pH6.0和0.3％作为防腐剂的间甲酚。请注意：总是在加入防腐剂前混合烟酰胺和蛋白。结果示于图1。不含烟酰胺制剂的200NTU值代表所用仪器检测的极限值。实际值可能高得多。
在上述说明书中描述了实施本发明的原理、优选实施方案和方式。但是，不能解释为本文要求保护的本发明仅限于所公开的具体形式，因为它们将被认为是说明性的而不是限制性的。本领域技术人员可在不偏离本发明宗旨的情况下对本发明进行变更和改变。