15 一种双标记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的合成方法 【技术领域】
本发明涉及稳定同位素标记的有机化合物的制备方法， 尤其是涉及一种双标记 13 15 2-NP-AHD-( C， N2) 的合成方法。背景技术 呋喃妥因是硝基呋喃类抗菌药物， 主要用于肾炎、 肾盂炎、 膀胱炎、 尿道炎等。 由于 价格低廉， 所以应用广泛。但是其具有潜在致癌和诱导有机体产生突变的性质。出于安全 性考虑， 世界上绝大多数国家包括中国、 欧盟、 美国等规定在动物食用组织中不允许有硝基 呋喃类兽药的残留。如欧盟已于 1995 年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素， 并将其 列为 A 类禁用药物 (EEC/1442/95 和 EEC/2901/93)， 我国也于 2002 年颁布了禁止使用硝基 呋喃类兽药的禁令。
呋喃妥因在动物体内代谢速度快， 半衰期短， 难以检出原药残留。 代谢产物可稳定 存在数月， 所以残留检测以代谢物作为指示该类药物残留的标识物。呋喃妥因的代谢物为
AHD(1- 氨基海因 )。
为了使化合物在高噪音背景下， 增加特征碎片离子的选择性， 提高质谱响应及其 灵敏度， 必须增加分子质量， 所以采用 2- 硝基苯甲醛衍生化氨基增加代谢物的离子化效 率。为了避免由于食品复杂的基质效应、 前处理和质谱检测器等因素对分析方法测定结果 的影响， 大部分兽药残留检测方法均使用同位素内标， 有效的校正了方法中出现的误差， 显 13 15 著提高了检测方法的稳定性。双标记 2-NP-AHD-( C， N2) 作为同位素内标物可以有效而且 准确的检测呋喃妥因的代谢物。
目前， 合成 AHD 的方法有 Norwich 制药公司 (Brit.Patent 757822 to Norwich Pharmacal Company， 1954) 以水合肼为原料制备， 不足之处在于该法使用过量 6 倍的有毒 水合肼， 对环境和人体带来了严重的危害， 收率也只有 35 ～ 40％； 张瑞仁等 ( 张瑞仁， 王旭， 王桂艳 .1- 氨基乙内酰脲的合成工艺改进 [J]. 黑龙江医药科学 .2006(5) ： 59) 采用水合肼 为原料， 使用丙酮做保护基团， 操作简单， 不足之处在于收率偏低 (49％ )。我们采用以双标 13 15 记氨基脲 -( C， N2) 为原料， 用苯甲醛对碱性较强的水合肼的两个活泼氢加以保护， 再与氯 乙酸酯类化合物进行缩合反应， 再用盐酸水解， 反应液直接和 2- 硝基苯甲醛反应， 即可得 13 15 到双标记 2-NP-AHD-( C， N2)。该方法操作简单， 并且不需要提纯 AHD， 直接参与下一步反 应， 提高收率至 62％， 并且同位素丰度不下降。 发明内容 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可以有效而且 准确的检测呋喃妥因的代谢物 AHD， 提供了一种方法简单、 可行并适合批量生产的双标记 13 15 2-NP-AHD-( C， N2) 内标物的有机合成方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现 ： 15
一种双标记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的合成方法， 其特征在于， 该方法以双标记氨基
15 脲 -(13C， N2) 为原料， 经过和苯甲醛反应， 对碱性较强的水合肼的两个活泼氢加以保护， 再 与氯乙酸酯类化合物进行缩合反应， 再用盐酸水解， 反应液直接和 2- 硝基苯甲醛反应， 即 13 15 可得到双标记 2-NP-AHD-( C， N2)。
反应路线如下 ：
注： * 处为同位素标记。 15
双标记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的合成方法具体包括以下步骤 ： 13 15
(1) 将双标记氨基脲 -( C， N2) 溶于水溶液中， 滴加到苯甲醛的乙醇溶液中， 水浴 13 15 反应后过滤， 得到无色固体苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) ； 15
(2) 将苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2) 置于三口瓶中， 加入等摩尔量的乙醇钠， 加热 至溶解， 滴加氯乙酸酯类化合物， 反应液回流 10min， 滴加乙醇钠， 2min 后滴加氯乙酸酯类 化合物， 反应 10min， 然后重复操作一次， 反应回流， 结束后浓缩至干， 加入 1mol/L HCl， 过滤 13 15 收集无色不溶固体， 用 DMF 重结晶， 可得无色晶体苯亚甲基氨基海因 -( C， N2) 纯品 ； 15
(3) 将苯亚甲基氨基海因 -(13C， N2) 加入 2 ～ 12mol/L HCl 中水解， 加热回流反应 3 ～ 8 小时 ；
(4) 在 上 述 反 应 液 中 加 入 2- 硝 基 苯 甲 醛， 控 制 反 应 温 度 为 40 ～ 80 ℃ 反 应 1 ～ 3 小时， 冷却后过滤， 用乙醇和少量水洗杂， 无色固体真空干燥 4 小时， 即得双标记 13 15 2-NP-AHD-( C， N2)。 15
步骤 (1) 中所述的双标记氨基脲 -(13C， N2) 与苯甲醛的摩尔比为 1 ～ 2 ； 水浴反 应的反应温度为 40 ～ 80℃ ； 反应时间为 1 ～ 3 小时。 15
步骤 (1) 中所述的双标记氨基脲 -(13C， N2) 与苯甲醛的摩尔比为 1.2 ～ 1.5 ； 水 浴反应的反应温度为 50 ～ 60℃ ； 反应时间为 2 小时。 15
步骤 (2) 中所述的苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2)、 乙醇钠与氯乙酸酯类化合物的 13 15 摩尔比为 1 ∶ 2 ∶ 1， 加入方式为苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) 与乙醇钠摩尔比 1 ∶ 1 反 15 应， 接着加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2) 摩尔数的氯乙酸酯类化合物， 反应 10min 13 1 后加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲 -( C， 5N2) 摩尔数的乙醇钠和 0.25 倍的氯乙酸酯类化合 物， 反应 10min 后重复操作一次， 总的反应温度为 40 ～ 100℃， 反应时间为 1 ～ 3 小时。 13 15
步骤 (2) 中所述的苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2)、 乙醇钠与氯乙酸酯类化合物的
15 摩尔比为 1 ∶ 2 ∶ 1， 加入方式为苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2) 与乙醇钠摩尔比 1 ∶ 1 反 13 15 应， 接着加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) 摩尔数的氯乙酸酯类化合物， 反应 10min 13 15 后加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) 摩尔数的乙醇钠和 0.25 倍的氯乙酸酯类化合 物， 反应 10min 后重复操作一次， 总的反应温度为 70 ～ 80℃， 反应时间为 2 小时。
所述的氯乙酸酯类化合物为氯乙酸乙酯或氯乙酸甲酯。
步骤 (3) 中所述的 HCl 浓度为 6mol/L， 水解时间为 5 小时。 15
步骤 (4) 中所述的 2- 硝基苯甲醛与苯亚甲基氨基海因 -(13C， N2) 的摩尔比为 1 ～ 1.5。
步骤 (4) 中所述的反应温度为 50 ～ 60℃， 反应时间为 2 小时。
所述的乙醇钠为乙醇钠的无水乙醇溶液， 无水乙醇是将乙醇先用活化的 4A 分子 筛脱水， 然后加入镁条和碘进行回流， 最后重蒸出乙醇即为无水乙醇。 15
与现有技术相比， 本发明采用以双标记氨基脲 -(13C， N2) 为原料， 经过和苯甲醛反 应， 对碱性较强的水合肼的两个活泼氢加以保护， 再与氯乙酸酯类化合物进行缩合反应， 再 13 15 用盐酸水解， 反应液直接和 2- 硝基苯甲醛反应， 即可得到双标记 2-NP-AHD-( C， N2)。 收率 13 15 ≥ 62％， C 和 N 丰度都大于 98％ ( 用 Thermo 的液相色谱 - 质谱联用仪和 MAT271 同位素 质谱仪测定 )， 化学纯度大于 99％ (Waters 液相色谱和 Nicole 公司的 Mahna-IR550 红外光 15 谱仪测定 )。此方法标记 13C， N2 同位素工艺简单， 收率较高， 同位素丰度不下降， 适合实验 15 室生产双标记 2-NP-AHD-(13C， N2)。具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例 1 15
取双标记氨基脲 -(13C， N2)10nmol 溶于水溶液中， 滴加到 12nmol 苯甲醛的乙醇溶 15 液中， 水浴 80℃反应 1 小时， 过滤， 得到 1.54 克无色固体苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2)。 13 15
将 0.1mol 苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) 于 500ml 三口瓶中， 加入等摩尔的乙醇钠 的无水乙醇 ( 先用活化的 4A 分子筛脱水， 然后加入镁条和碘进行回流， 最后重蒸得到 ) 溶 液， 加热至 75℃溶解， 滴加氯乙酸乙酯 0.05mol， 反应液回流 10min。 滴加 0.05mol 的乙醇钠 的无水乙醇溶液， 2min 后滴加 0.025mol 的氯乙酸乙酯， 反应 10min。并且重复操作一次， 反 应回流 3 小时。回流结束后浓缩至干， 加入 1mol/L HCl， 过滤收集无色不溶固体， 用 DMF 重 13 15 结晶， 可得 18.50 克无色晶体苯亚甲基氨基海因 -( C， N2) 纯品。 15
将 0.1mol 苯亚甲基氨基海因 -(13C， N2) 加入到 150ml 的 2mol/L HCl 中， 油浴 加热回流反应 8 小时。反应结束冷却后， 加入 0.1mol 2- 硝基苯甲醛， 水浴 40℃反应 2 小 时， 冷却后过滤， 用乙醇和少量水洗杂， 无色固体真空干燥 4 小时， 即得 19.95 克双标记 13 15 13 15 13 2-NP-AHD-( C， N2)。反应总收率为 66.2 ％ ( 以双标记氨基脲 -( C， N2) 计 )， C 丰度 15 98.1％， N 丰度 98.5％， 纯度 99.3％。
实施例 2 15
取双标记氨基脲 -(13C， N2)10nmol 溶于水溶液中， 滴加到 10nmol 苯甲醛的乙醇溶 15 液中， 水浴 60℃反应 3 小时， 过滤， 得到 1.55 克无色固体苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2)。 13 15
将 0.1mol 苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) 于 500ml 三口瓶中， 加入等摩尔的乙醇钠的无水乙醇 ( 先用活化的 4A 分子筛脱水， 然后加入镁条和碘进行回流， 最后重蒸得到 ) 溶 液， 加热至 40℃溶解， 滴加氯乙酸乙酯 0.05mol， 反应液回流 10min。滴加 0.05mol 的乙醇 钠的无水乙醇溶液， 2min 后滴加 0.025mol 的氯乙酸乙酯， 反应 10min。并且重复操作一次。 反应回流 2 小时。回流结束后浓缩至干， 加入 1mol/L HCl， 过滤收集无色不溶固体， 用 DMF 13 15 重结晶， 可得 18.25 克无色晶体苯亚甲基氨基海因 -( C， N2) 纯品。 15
将 0.1mol 苯亚甲基氨基海因 -(13C， N2) 加入到 150ml 的 6mol/L HCl 中， 油浴 加热回流反应 5 小时。反应结束冷却后， 加入 0.1mol 2- 硝基苯甲醛， 水浴 80℃反应 5 小 时， 冷却后过滤， 用乙醇和少量水洗杂， 无色固体真空干燥 4 小时， 即得 19.55 克双标记 13 15 13 15 13 2-NP-AHD-( C， N2)。反应总收率为 64.4 ％ ( 以双标记氨基脲 -( C， N2) 计 )， C 丰度 15 98.4％， N 丰度 98.4％， 纯度 99.5％。
实施例 3 15
取双标记氨基脲 -(13C， N2)10nmol 溶于水溶液中， 滴加到 20nmol 苯甲醛的乙醇溶 15 液中， 水浴 40℃反应 2 小时， 过滤， 得到 1.57 克无色固体苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2)。 13 15
将 0.1mol 苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) 于 500ml 三口瓶中， 加入等摩尔的乙醇钠 的无水乙醇 ( 先用活化的 4A 分子筛脱水， 然后加入镁条和碘进行回流， 最后重蒸得到 ) 溶 液， 加热至 100℃溶解， 滴加氯乙酸乙酯 0.05mol， 反应液回流 10min。滴加 0.05mol 的乙醇 钠的无水乙醇溶液， 2min 后滴加 0.025mol 的氯乙酸乙酯， 反应 10min。并且重复操作一次。 反应回流 1 小时。回流结束后浓缩至干， 加入 1mol/L HCl， 过滤收集无色不溶固体， 用 DMF15 重结晶， 可得 18.35 克无色晶体苯亚甲基氨基海因 -(13C， N2) 纯品。 13 15
将 0.1mol 苯 亚 甲 基 氨 基 海 因 -( C， N2) 加 入 到 150ml 的 12mol/L HCl 中， 油 浴加热回流反应 5 小时。反应结束冷却后， 加入部分 2- 硝基苯甲醛， 水浴 60 ℃反应 3 小 时， 冷却后过滤， 用乙醇和少量水洗杂， 无色固体真空干燥 4 小时， 即得 19.65 克双标记 13 15 13 15 13 2-NP-AHD-( C， N2)。反应总收率为 65.9 ％ ( 以双标记氨基脲 -( C， N2) 计 )， C 丰度 15 98.1％， N 丰度 98.8％， 纯度 99.0％。
实施例 4 15
一 种 双 标 记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的 合 成 方 法， 该 方 法 以 双 标 记 氨 基 脲 -(13C， 15 N2) 为原料， 经过和苯甲醛反应， 对碱性较强的水合肼的两个活泼氢加以保护， 再与氯乙 酸乙酯进行缩合反应， 再用盐酸水解， 反应液直接和 2- 硝基苯甲醛反应， 即可得到双标记 13 15 2-NP-AHD-( C， N2)。
反应路线如下 ：
注： * 处为同位素标记。 15
双标记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的合成方法具体包括以下步骤 ： 13 15
(1) 将双标记氨基脲 -( C， N2) 溶于水溶液中， 滴加到苯甲醛的乙醇溶液中， 双标 13 15 记氨基脲 -( C， N2) 与苯甲醛的摩尔比为 1， 控制温度为 40℃水浴 3 小时后过滤， 得到无色
15 固体苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2) ； 15
(2) 将苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2) 置于三口瓶中， 加入等摩尔量的乙醇钠的无 水乙醇溶液， 加热至 40℃溶解， 接着加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲摩尔数的氯乙酸乙酯， 反 应 10min 后加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲摩尔数的乙醇钠和 0.25 倍的氯乙酸乙酯， 反应 10min 后重复操作一次， 反应回流， 结束后浓缩至干， 苯亚甲基缩氨基脲、 乙醇钠与氯乙酸乙 酯的摩尔比为 1 ∶ 2 ∶ 1， 总反应时间为 3 小时， 再加入 1mol/L HCl， 过滤收集无色不溶固 13 15 体， 用 DMF 重结晶， 可得无色晶体苯亚甲基氨基海因 -( C， N2) 纯品 ； 15
(3) 将苯亚甲基氨基海因 -(13C， N2) 加入 2mol/L HCl 中水解， 加热回流反应 3 小 时；
(4) 在 上 述 反 应 液 中 加 入 2- 硝 基 苯 甲 醛， 2- 硝 基 苯 甲 醛 与 苯 亚 甲 基 氨 基 海 13 15 因 -( C， N2) 的摩尔比为 1.2， 控制反应温度为 40℃反应 3 小时， 冷却后过滤， 用乙醇和少 13 15 量水洗杂， 无色固体真空干燥 4 小时， 即得双标记 2-NP-AHD-( C， N2)。
实施例 5 15
一 种 双 标 记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的 合 成 方 法， 该 方 法 以 双 标 记 氨 基 脲 -(13C， 15 N2) 为原料， 经过和苯甲醛反应， 对碱性较强的水合肼的两个活泼氢加以保护， 再与氯乙 酸乙酯进行缩合反应， 再用盐酸水解， 反应液直接和 2- 硝基苯甲醛反应， 即可得到双标记 13 15 2-NP-AHD-( C， N2)。 15
双标记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的合成方法具体包括以下步骤 ： 13 15
(1) 将双标记氨基脲 -( C， N2) 溶于水溶液中， 滴加到苯甲醛的乙醇溶液中， 双标 13 15 记氨基脲 -( C， N2) 与苯甲醛的摩尔比为 1.2， 控制温度为 50℃水浴 2 小时后过滤， 得到无 13 15 色固体苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) ； 15
(2) 将苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2) 置于三口瓶中， 加入等摩尔量的乙醇钠的无 水乙醇溶液， 加热至 70℃溶解， 接着加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲摩尔数的氯乙酸乙酯， 反应 10min 后加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲摩尔数的乙醇钠和 0.25 倍的氯乙酸乙酯， 反应 10min 后重复操作一次， 反应回流， 结束后浓缩至干， 苯亚甲基缩氨基脲、 乙醇钠与氯乙酸乙 酯的摩尔比为 1 ∶ 2 ∶ 1， 总的反应时间为 2 小时， 再加入 1mol/L HCl， 过滤收集无色不溶 13 15 固体， 用 DMF 重结晶， 可得无色晶体苯亚甲基氨基海因 -( C， N2) 纯品 ； 15
(3) 将苯亚甲基氨基海因 -(13C， N2) 加入 6mol/L HCl 中水解， 加热回流反应 5 小 时；
(4) 在 上 述 反 应 液 中 加 入 2- 硝 基 苯 甲 醛， 2- 硝 基 苯 甲 醛 与 苯 亚 甲 基 氨 基 海 13 15 因 -( C， N2) 的摩尔比为 1.2， 控制反应温度为 50℃反应 2 小时， 冷却后过滤， 用乙醇和少 13 15 量水洗杂， 无色固体真空干燥 4 小时， 即得双标记 2-NP-AHD-( C， N2)。
实施例 6 15
一 种 双 标 记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的 合 成 方 法， 该 方 法 以 双 标 记 氨 基 脲 -(13C， 15 N2) 为原料， 经过和苯甲醛反应， 对碱性较强的水合肼的两个活泼氢加以保护， 再与氯乙 酸乙酯进行缩合反应， 再用盐酸水解， 反应液直接和 2- 硝基苯甲醛反应， 即可得到双标记 13 15 2-NP-AHD-( C， N2)。 15
双标记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的合成方法具体包括以下步骤 ： 13 15
(1) 将双标记氨基脲 -( C， N2) 溶于水溶液中， 滴加到苯甲醛的乙醇溶液中， 双标 13 15 记氨基脲 -( C， N2) 与苯甲醛的摩尔比为 1.5， 控制温度为 50℃水浴 2 小时后过滤， 得到无 13 15 色固体苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) ； 15
(2) 将苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2) 置于三口瓶中， 加入等摩尔量的乙醇钠的无 水乙醇溶液， 加热至 80℃溶解， 接着加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲摩尔数的氯乙酸乙酯， 反 应 10min 后加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲摩尔数的乙醇钠和 0.25 倍的氯乙酸乙酯， 反应 10min 后重复操作一次， 反应回流， 结束后浓缩至干， 苯亚甲基缩氨基脲、 乙醇钠与氯乙酸乙 酯的摩尔比为 1 ∶ 2 ∶ 1， 总的反应时间为 2 小时， 再加入 1mol/L HCl， 过滤收集无色不溶 13 15 固体， 用 DMF 重结晶， 可得无色晶体苯亚甲基氨基海因 -( C， N2) 纯品 ； 15
(3) 将苯亚甲基氨基海因 -(13C， N2) 加入 6mol/L HCl 中水解， 加热回流反应 5 小 时；
(4) 在 上 述 反 应 液 中 加 入 2- 硝 基 苯 甲 醛， 2- 硝 基 苯 甲 醛 与 苯 亚 甲 基 氨 基 海 13 15 因 -( C， N2) 的摩尔比为 1.5， 控制反应温度为 60℃反应 2 小时， 冷却后过滤， 用乙醇和少 13 15 量水洗杂， 无色固体真空干燥 4 小时， 即得双标记 2-NP-AHD-( C， N2)。
实施例 7 15
一 种 双 标 记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的 合 成 方 法， 该 方 法 以 双 标 记 氨 基 脲 -(13C， 15 N2) 为原料， 经过和苯甲醛反应， 对碱性较强的水合肼的两个活泼氢加以保护， 再与氯乙 酸乙酯进行缩合反应， 再用盐酸水解， 反应液直接和 2- 硝基苯甲醛反应， 即可得到双标记 13 15 2-NP-AHD-( C， N2)。 15
双标记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的合成方法具体包括以下步骤 ： 13 15
(1) 将双标记氨基脲 -( C， N2) 溶于水溶液中， 滴加到苯甲醛的乙醇溶液中， 双标 13 15 记氨基脲 -( C， N2) 与苯甲醛的摩尔比为 2， 控制温度为 80℃水浴 1 小时后过滤， 得到无色 13 15 固体苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) ； 15
(2) 将苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2) 置于三口瓶中， 加入等摩尔量的乙醇钠的无水乙醇溶液， 加热至 100℃溶解， 接着加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲摩尔数的氯乙酸乙酯， 反应 10min 后加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲摩尔数的乙醇钠和 0.25 倍的氯乙酸乙酯， 反应 10min 后重复操作一次， 反应回流， 结束后浓缩至干， 苯亚甲基缩氨基脲、 乙醇钠与氯乙酸乙 酯的摩尔比为 1 ∶ 2 ∶ 1， 总的反应时间为 1 小时， 再加入 1mol/L HCl， 过滤收集无色不溶 13 15 固体， 用 DMF 重结晶， 可得无色晶体苯亚甲基氨基海因 -( C， N2) 纯品 ； 15
(3) 将苯亚甲基氨基海因 -(13C， N2) 加入 12mol/L HCl 中水解， 加热回流反应 3 小 时；
(4) 在 上 述 反 应 液 中 加 入 2- 硝 基 苯 甲 醛， 2- 硝 基 苯 甲 醛 与 苯 亚 甲 基 氨 基 海 13 15 因 -( C， N2) 的摩尔比为 1.5， 控制反应温度为 80℃反应 1 小时， 冷却后过滤， 用乙醇和少 13 15 量水洗杂， 无色固体真空干燥 4 小时， 即得双标记 2-NP-AHD-( C， N2)。
实施例 8 15
一 种 双 标 记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的 合 成 方 法， 该 方 法 以 双 标 记 氨 基 脲 -(13C， 15 N2) 为原料， 经过和苯甲醛反应， 对碱性较强的水合肼的两个活泼氢加以保护， 再与氯乙 酸甲酯进行缩合反应， 再用盐酸水解， 反应液直接和 2- 硝基苯甲醛反应， 即可得到双标记 13 15 2-NP-AHD-( C， N2)。15 双标记 2-NP-AHD-(13C， N2) 的合成方法具体包括以下步骤 ： 13 15
(1) 将双标记氨基脲 -( C， N2) 溶于水溶液中， 滴加到苯甲醛的乙醇溶液中， 双标 13 15 记氨基脲 -( C， N2) 与苯甲醛的摩尔比为 1.5， 控制温度为 50℃水浴 2 小时后过滤， 得到无 13 15 色固体苯亚甲基缩氨基脲 -( C， N2) ； 15
(2) 将苯亚甲基缩氨基脲 -(13C， N2) 置于三口瓶中， 加入等摩尔量的乙醇钠的无 水乙醇溶液， 加热至 80℃溶解， 接着加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲摩尔数的氯乙酸甲酯， 反 应 10min 后加入 0.5 倍苯亚甲基缩氨基脲摩尔数的乙醇钠和 0.25 倍的氯乙酸甲酯， 反应 10min 后重复操作一次， 反应回流， 结束后浓缩至干， 苯亚甲基缩氨基脲、 乙醇钠与氯乙酸甲 酯的摩尔比为 1 ∶ 2 ∶ 1， 总的反应时间为 2 小时， 再加入 1mol/L HCl， 过滤收集无色不溶 13 15 固体， 用 DMF 重结晶， 可得无色晶体苯亚甲基氨基海因 -( C， N2) 纯品 ； 15
(3) 将苯亚甲基氨基海因 -(13C， N2) 加入 6mol/L HCl 中水解， 加热回流反应 5 小 时；
(4) 在 上 述 反 应 液 中 加 入 2- 硝 基 苯 甲 醛， 2- 硝 基 苯 甲 醛 与 苯 亚 甲 基 氨 基 海 13 15 因 -( C， N2) 的摩尔比为 1.5， 控制反应温度为 60℃反应 2 小时， 冷却后过滤， 用乙醇和少 13 15 量水洗杂， 无色固体真空干燥 4 小时， 即得双标记 2-NP-AHD-( C， N2)。
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