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1、(10)申请公布号 CN 101934066 A (43)申请公布日 2011.01.05 CN 101934066 A *CN101934066A* (21)申请号 200910040695.5 (22)申请日 2009.06.30 A61K 38/08(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 15/14(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市新港西路 135 号 (72)发明人 黎孟枫 袁洁 林璧润 朱勋 潘嘉慧 林永成 吴珏珩 李隽 何振健 古明晖 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 刘孟斌。
2、 (54) 发明名称 放线菌素类化合物放线菌素 V 在制备抗乳腺 癌药物中的应用 (57) 摘要 本发明提供了放线菌素类化合物放线菌素 V 在制备抗乳腺癌药物中的应用。其中， 放线菌 素类化合物放线菌素 V(ActV) 于南海海洋链霉 菌 Streptomyces zhapoensis H41-26 的发酵培 养物的乙酸乙酯粗提物中分离得到， 分子量为 1268。该药物含有上述放线菌素类化合物放线 菌素 V(ActV)。本发明的放线菌素类化合物从真 菌中提取， 方法简单， 成本低廉 ； ActV 可同时通过 Caspase 依赖的内源性和外源性途径诱导肿瘤细 胞凋亡。ActV 在体外和体内对人。
3、乳腺癌细胞生长 的抑制作用和诱导凋亡作用， 为进一步开发高效 低毒的抗肿瘤新型候选药物奠定基础。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 8 页 CN 101934066 A1/1 页 2 1. 放线菌素类化合物放线菌素 V 在制备抗乳腺癌药物中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述抗乳腺癌药物中含有放线菌素 V， 所 述放线菌素 V 具有如下结构 ： 3. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述放线菌素 V 的分子量为 1268。 4. 根据权利要求 1 所述的应用，。
4、 其特征在于， 所述放线菌素 V 是由南海海洋链霉菌 Streptomyces zhapoensis H41-26 的发酵培养物的乙酸乙酯粗提物中分离纯化得到的。 5. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述抗乳腺癌药物的剂型包括片剂、 丸 剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 溶液剂、 混悬剂或乳剂。 权 利 要 求 书 CN 101934066 A1/5 页 3 放线菌素类化合物放线菌素 V 在制备抗乳腺癌药物中的应 用 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 具体涉及放线菌素类化合物放线菌素 V， 特别是一类源 于海洋链霉菌属微生物具有抗肿瘤活性的放线菌素 V 在制备抗乳腺癌药物中。
5、的应用。 背景技术 0002 长期以来， 恶性肿瘤一直严重威胁着人类健康与生命。 在各种疾病中， 癌症是致人 死亡的主要疾病之一。 据WHO报告， 全世界每年约有600万人被癌症夺去生命， 估计到2020 年将升至 1000 万人。乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤， 发病率在过去五十年中呈缓慢上升趋 势， 在许多西方国家中， 乳腺癌的发病率占女性癌症的首位。近年来， 其发病率在发展中国 家呈现逐年上升趋势， 在我国的北京、 上海等大城市， 其发病率已位居女性恶性肿瘤之首。 0003 目前治疗恶性肿瘤的主要方法包括 ： 手术治疗、 抗癌药物的化学治疗、 放射治疗和 生物反应调节剂及其它治疗。其中化疗在。
6、恶性肿瘤治疗中占有不可替代的地位。对于乳腺 癌， 常用治疗手段主要是以传统的手术治疗为主， 术后辅以局部或全身的放疗、 化疗及内分 泌治疗， 其中化疗是治疗乳腺癌的重要辅助性手段， 化疗能够明显降低乳腺癌的术后复发 率， 对晚期乳腺癌失去根治机会者采用化疗也有明显的缓解率。 但是， 由于抗恶性肿瘤药物 的选择性差， 毒副作用大， 造成恶性肿瘤患者免疫功能低下， 生活质量降低， 这使得化疗药 物的使用受到一定的限制。另外， 多药耐药性的产生也限制了化疗药物的使用。因此， 研究 新一代的低毒高选择性、 耐药性低的药物成为恶性肿瘤治疗的当务之急。 0004 随着细胞分子生物学的发展， 可将癌症定义为。
7、细胞周期异常性疾病。癌症从细胞 水平上可以看作是调控细胞周期或细胞凋亡的某一个或某几个环节发生紊乱， 使癌化细胞 无限制地盲目无序增殖的一种状态。细胞凋亡诱导剂能通过调控细胞凋亡的生物过程， 控 制和矫正癌化细胞盲目无序增殖的状态。因此， 新的细胞凋亡诱导剂有可能开发成新的化 疗药物用于治疗癌症， 而检测细胞凋亡诱导作用的生物活性指标则可用于筛选和发现新的 抗癌活性物质。 发明内容 0005 为克服上述技术缺陷， 本发明提供了放线菌素类化合物放线菌素 V(ActV) 在制备 抗乳腺癌药物中的应用。 0006 本发明的放线菌素类化合物放线菌素 V(ActV) 来源于海洋红树林内生真菌。发 明人由。
8、南海海洋链霉菌 Streptomyces zhapoensis H41-26 的发酵培养物的乙酸乙酯粗提 物中分离得到化合物 ActV， 该菌株由广东省农业科学院植物保护研究所从广东省阳江市 西南端海陵岛闸坡的海泥中分离得到。ActV 的分子量为 1268， 纯度为 96。尽管 ActV 曾以少量的形式与 ActD 一起从陆地放线菌被分离得到， 但以 ActV 为优势产物从海洋放线 菌分离出来还是第一次。其结构运用核磁共振 (H-NMR， 13C-NMR， HSQC， HMBC)、 高分辨质谱 (ESI-MS) 等现代波谱技术进行鉴定， 并与现有文献报道的图谱进行对照确认。结构如下列 说 明 。
9、书 CN 101934066 A2/5 页 4 式所示 ： 0007 0008 所述放线菌素 V 是由南海海洋链霉菌 Streptomyces zhapoensis H41-26 的发酵 培养物的乙酸乙酯粗提物中分离纯化得到的。 0009 所述抗乳腺癌药物的剂型包括片剂、 丸剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 溶液剂、 混悬剂或乳 剂。 0010 该药物可以是药物上可接受的任意一种剂型， 包括具有适当组成的任何固体 ( 片 剂、 丸剂、 胶囊剂、 颗粒剂 ) 等或液体 ( 溶液剂、 混悬剂或乳剂 ) 或者口服、 局部给药或肠胃 外给药， 它们可以包含所述纯化合物或者与任何载体或其它药理学活性化合物相结合。
10、。当 进行肠胃外给药时， 需要对这些组合物进行灭菌处理。 0011 本发明化合物或组合物的给药可以通过任何适当的方法进行， 如静脉输注、 口服 制剂、 腹膜内和静脉内给药。优选输注时间最多为 48 小时。包含本发明化合物的药用组合 物可以通过以缓释配方中的脂质体或毫微球包囊方式或通过其它标准传递方式进行给药。 0012 所述化合物的正确剂量将根据具体剂型、 应用模式和具体部位、 患者及所要治疗 的肿瘤而变化、 还需考虑其它因素如年龄、 体重、 性别、 饮食、 给药时间、 排泄速率、 患者症 状、 药物结合、 反应敏感性和疾病严重程度， 可以在最大允许剂量范围内连续给药或者定期 给药。 0013。
11、 与现有抗肿瘤药物相比， 本发明具有如下有益效果 ： 0014 本发明的放线菌素类化合物来源于海洋真菌， 从真菌中提取化合物的方法简单， 而优化的培养方法将使大量发酵生产本化合物的成本低廉 ； 本发明通过体外以及体内实验 证明新型海洋源性放线菌素 ActV 具有很强的抗肿瘤活性， 可作为治疗抗乳腺癌等其他实 体肿瘤的先导化合物， 可用于制备抗肿瘤药物。本发明的放线菌素类化合物放线菌素 V 药 物可以与其它药物一起使用以提供联合治疗。 所述其它药物可以形成该同一组合物的一部 分， 或者作为单独组合物在相同时间或不同时间进行给药， 对其它药物的特性没有特别限 制。本发明提供了一种对罹患癌症的任何哺。
12、乳动物 ( 特别是人类 ) 进行化合物联合治疗的 方法， 该方法包括给予患者治疗有效量的本发明化合物或其药用组合物。本发明为进一步 开发高效低毒的抗肿瘤新型候选药物奠定基础。 在体外抗乳腺癌细胞生长以及体内动物模 型的抗肿瘤实验中， 本化合物表现出作为抗肿瘤药物的优良特性 ； 而对其抗肿瘤分子机制 的研究， 更增加了其成为候选抗肿瘤药物的可能。 说 明 书 CN 101934066 A3/5 页 5 附图说明 0015 图 1 是本发明实施例 1 中人乳腺癌 MCF-7 细胞经不同浓度的 ActV 作用 48h 后的 形态学变化的结果图 ； 0016 图 2 是本发明实施例 1 中人乳腺癌 M。
13、DA-MB 435 细胞经不同浓度的 ActV 作用 48h 后的形态学变化的结果图 ； 0017 图3是本发明实施例1中人永生化正常乳腺上皮细胞MCF-10A经不同浓度的ActV 作用 48h 后的形态学变化的结果图 ； 0018 图 4 是本发明实施例 2 中 MTT 比色法检测 ActV 对人乳腺癌细胞 MCF-7、 MDA-MB 435 和人永生化正常乳腺上皮细胞 MCF-10A 体外剂量依赖性抑制细胞增殖的生物学活性的 一个优选实施例的结果图 ； 0019 图 5 是本发明实施例 3 中对 BALB/cA-nude 裸鼠皮下接种人乳腺癌细胞 MDA-MB 435体内抗肿瘤活性检测中A。
14、ctV的两个不同剂量(10g/kg和30g/kg)对体内肿瘤生长 抑制曲线图 ； 0020 图 6 是本发明实施例 3 中体内 ActV 对裸鼠 MDA-MB-435 移植瘤抑制实验中， 对受 试裸鼠体重随给药时间变化曲线图 ； 0021 图 7 是本发明实施例 4 中以流式细胞仪检测 (Annexin V-FITC/PI 双染法 )ActV 对人乳腺癌细胞 MCF-7、 MDA-MB 435 和人永生化正常乳腺上皮细胞 MCF-10A 早期凋亡影响 的图 ； 0022 图 8 是本发明实施例 4 中 TUNEL 免疫荧光染色法检测 ActV 诱导乳腺癌细胞 MDA-MB435、 MCF7 和。
15、人永生化正常乳腺上皮细胞 MCF-10A 凋亡的生物学活性图 ； 0023 图 9 是本发明实施例 4 中利用 Western Blotting 技术检测 ActV 处理人乳腺癌细 胞 MCF-7、 MDA-MB435 后凋亡相关蛋白的表达水平的图。 具体实施方式 0024 为使本发明更加容易理解， 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 0025 实施例 1 ActV 对人乳腺癌株 MCF-7、 MDA-MB 435 及人乳腺上皮细胞 MCF-10A 细 胞生长和形态的影响 0026 1、 ActV 对人乳腺癌 MCF-7 细。
16、胞生长和形态的影响 0027 ActV 对人乳腺癌 MCF-7 细胞的生长具有显著抑制作用。0.01M ActV 处理 48h 后， MCF-7 细胞密度较对照组明显降低， 随着药物浓度的增加， 细胞密度进一步显著降低。 1M 高浓度 ActV 药物处理下的细胞出现大量死亡， 见图 1。在光学显微镜下放大 200 可 观察细胞出现典型的细胞凋亡形态学变化， 贴壁细胞开始出现体积变小， 变形， 皱缩， 变圆， 脱落。在光学显微镜下放大 400 可观察脱落细胞的胞膜出现泡化现象。 0028 2、 ActV 对人乳腺癌 MDA-MB 435 细胞生长和形态的影响 0029 ActV 对人乳腺癌 MD。
17、A-MB 435 细胞的生长具有显著抑制作用。0.01MActV 处理 48h 后， MDA-MB 435 细胞密度较对照组明显降低， 随着药物浓度的增加， 细胞密度进一步显 著降低。1M 高浓度 ActV 药物处理下的细胞出现大量死亡， 见图 2。在光学显微镜下放大 说 明 书 CN 101934066 A4/5 页 6 200 可观察细胞出现典型的细胞凋亡形态学变化， 贴壁细胞开始出现体积变小， 变形， 皱 缩， 变圆， 脱落。在光学显微镜下放大 400 可观察脱落细胞的胞膜出现泡化现象。 0030 3、 ActV 对人乳腺上皮细胞 MCF-10A 生长的影响 0031 ActV对人永生化。
18、乳腺上皮细胞MCF-10A生长的抑制作用较对人乳腺癌细胞MCF-7 和 MDA-MB 435 要小。0.01M ActV 处理 48h 后， MCF-10A 在细胞数目和形态上与对照无显 著差异， 只是细胞较对照组变得较细长。 1M ActV处理的MCF-10A镜下仍可见一些形态较 完整的细胞， 见图3。 但这不以充分说明ActV对细胞毒性低， 只是相对于体外实验中对肿瘤 细胞系的杀伤程度而言。 0032 实施例 2 ActV 抑制人乳腺癌细胞生长的剂量 - 效应关系 0033 ActV 对人乳腺癌细胞 MCF-7 和 MDA-MB 435 的生长抑制作用呈现明显的剂量依赖 性， 对低分化、 。
19、高侵袭性的乳腺癌细胞 MDA-MB 435 抑制率最高， 对低致瘤性、 低转移的人乳 腺癌 MCF-7 抑制率其次， 其作用 48h 的 IC50分别为 0.031M 和 0.055M。而 ActV 对人永 生化乳腺上皮细胞 MCF-10A 生长的抑制作用最弱， 其作用 48h 的 IC50为 1.042M， 见图 4。 0034 实施例3 ActV抑制裸鼠异体移植人乳腺癌细胞瘤生长的体内抗乳腺癌活性检测 0035 采用人乳腺癌细胞 MDA-MB 435 经皮下接种植入 BALB/cA-nude 裸鼠颈背部位建 立异体移植动物模型。将人乳腺癌细胞 MDA-MB 435 用 1PBS 洗涤， 用。
20、含 0.02 EDTA 的 0.05胰蛋白酶消化 1 分钟左右， 然后用胰酶抑制剂终止消化。在 4， 1000rpm 离心 5 分 钟后， 细胞沉淀重悬于 1PBS 中并且将浓度调节至 2106细胞 /ml。在用于 SPF 级实验动 物饲育的屏障环境动物实验室， 将 0.1ml 肿瘤细胞悬液经皮下注射接种于裸鼠颈背部。肿 瘤大小用游标刻度卡钳测量， 并且体积利用如下公式测算肿瘤 ： 体积宽度 宽度 长 度 0.52。在肿瘤体积为至少 100-200mm3( 体重的 0.5-1 ) 后 ( 其在 5-7 天内发生 )， 将 小鼠随机分为3组， 一组作为对照， 不进行药物处理， 另外两组分别以10。
21、g/kg和30g/kg 剂量 ActV 每 3 天腹腔注射给药一次， 持续 29 天， 观察并记录两组不同剂量的 ActV 的体内 抑瘤作用。结果证明， 不同剂量的给药组 (10g/kg 和 30g/kg) 与对照组相比， 在实验过 程中， 肿瘤生长明显受到抑制作用 ( 见图 5)， 而且两组不同剂量给药组之间肿瘤生长抑制 率分别为62.19和80.87， 体现了剂量依赖性， 见表1， 表1是ActV体内抑制肿瘤生长抑 制率的数据方差分析。 0036 表 1 0037 说 明 书 CN 101934066 A5/5 页 7 0038 并且小鼠表征指标之一的体重随给药时间的变化并不明显(见图6)。
22、。 初步提示在 高剂量长期给药情况下， 表现出毒性较低、 安全性较高的特点。 0039 实施例 4 ActV 通过诱导肿瘤细胞凋亡实现抗乳腺癌的活性 0040 利用 Annexin V-FITC/PI 双染法检测 ActV 对人乳腺癌细胞 MCF-7、 MDA-MB 435 和 人永生化正常乳腺上皮细胞 MCF-10A 早期凋亡影响。流式细胞仪检测的结果显示 ( 图 7)， 在ActV分别以不同浓度处理MCF-7(0.025M， 0.05M， 0.1M)和MDA-MB-435(0.015M， 0.03M， 0.06M)细胞8hr后， 随着ActV浓度的升高， 凋亡的MCF-7和MDA-MB-4。
23、35细胞比 例均逐步增高， 呈明显浓度依赖性。但是对于人永生化正常乳腺上皮细胞 MCF-10A， 以相同 的剂量 (0.025M， 0.05M， 0.1M) 处理 8hr 后， 并未观察到明显的凋亡现象。 0041 利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 (TUNEL) 检测经 ActV 作 用后， 体外诱导肿瘤细胞系的凋亡。人乳腺癌细胞 MCF-7 和 MDA-MB435 分别经 0.1M 和 0.06M的ActV作用24小时后， 出现大量TUNEL染色阳性的细胞， 而对照组未经ActV作用 的细胞基本未见 TUNEL 染色阳性出现。另外， 同样以 0.1M 的 ActV 处理人永。
24、生化正常乳 腺上皮细胞 MCF-10A， TUNEL 阳性的凋亡细胞则相对很少。见图 8。结果表明， ActV 的作用 能够诱导人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB 435凋亡， 而相同剂量对人永生化正常乳腺上皮细 胞 MCF-10A 处理后， 引起的凋亡现象缺相对很弱。 0042 进一步在分子水平上检测 ActV 的凋亡作用， 则利用 Western Blotting 技术检测 ActV处理人乳腺癌细胞MCF-7、 MDA-MB435后凋亡相关蛋白的表达水平。 分别按照浓度梯度 和时间梯度两条线索， 对凋亡相关的蛋白 Caspase9、 Caspase8、 Caspase3 和 PARP 的。
25、前体和 切割带进行检测， 发现随着药物浓度的增加和处理时间的延长， 上述蛋白的前体逐渐减少， 切割带逐渐增加， 见图 9。-Tubulin 作为上样的对照。结果显示， ActV 作用后的 MCF-7、 MDA-MB435 细胞同时通过 Caspase 依赖的内源性和外源性途径发生细胞凋亡。另外， 因 MCF-7 细胞 caspase3 基因缺失， 所以没有检测 caspase3 的剪切情况。 0043 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当 理解， 可以对本发明的技术方案进行修。
26、改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。 说 明 书 CN 101934066 A1/8 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 101934066 A2/8 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 101934066 A3/8 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 101934066 A4/8 页 11 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101934066 A5/8 页 12 图 6 说 明 书 附 图 CN 101934066 A6/8 页 13 图 7 说 明 书 附 图 CN 101934066 A7/8 页 14 图 8 说 明 书 附 图 CN 101934066 A8/8 页 15 图 9 说 明 书 附 图 。