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猪血去蛋白提取物凝胶剂及其制备方法
    技术领域 本发明涉及猪血去蛋白提取物制剂， 尤其涉及猪血去蛋白提取物凝胶剂， 更具体 的说， 涉及一种由各种原因引起的皮肤、 眼部炎症损伤的治疗药物及其制备方法， 它是猪血 去蛋白提取物的一种新剂型， 属于生物制药技术领域。
     背景技术
     外科的创伤、 烧伤、 烫伤以及包括褥疮、 肢体与皮肤溃疡等疾病是十分常见的皮肤 病。目前， 治疗这方面疾病的用药种类及治疗方法较多， 对于大面积Ⅰ o- Ⅲ o 烧伤的治疗暴 露治疗法， 即用灯烤或红外线照射治疗， 以减少渗出抗感染， 对于小面积烧伤多数以膏剂、 酊剂等涂敷暴露或半暴露治疗， 这些方法不足之处在于抗感染及抗渗出能力差， 疗程长， 痛 苦大， 留疤率高， 耗资大， 特别是患者长期裸体暴露产生心理障碍， 严重影响睡眠及食欲， 对 创面愈合造成一定影响。
     对于眼球表炎症， 一般采用抗生素类药物配合维生素类和微量激素类 ( 含眼药 ) 进行治疗， 这种治疗效果不甚理想， 尤其对急性炎症病变， 对经久不愈性眼球表溃疡 ( 碱烧 伤溃疡， 放射性溃疡和神经性营养障碍性溃疡 ) 及感染性溃疡尚无满意治疗方法， 常引起 视力消失， 造成患者终身残疾。
     目前同类品种治疗上述创伤、 烧伤、 烫伤以及眼角膜损伤的药物均以小牛血为原 料的去蛋白提取物， 而近年来由于疯牛病的肆虐， 疯牛病检测方法的局限性、 疯牛病病毒灭 活的限制性等因素， 世界卫生组织严格限制使用牛血原料产品， 广大民众对牛源性生物制 品也产生严重的恐慌心理。专利号 ZL200510083041.2， 专利名称 “一种小牛血去蛋白提取 物凝胶剂” 和专利号 ZL200810010480.4， 专利名称 “含有小牛血去蛋白提取物眼用制剂组合 物” ， 提供了一种治疗上述疾病的药物， 但此技术是以小牛血为原料的去蛋白提取物药物制 剂， 受疯牛病检测方法的局限性、 疯牛病病毒灭活的限制性等因素， 使得药物效果不理想， 在临床应用上受到广泛的限制 ； 以小牛血为原料的凝胶制剂只是单纯使用水溶性凝胶剂基 质润滑性差， 易失水， 有效成分易挥发， 不能较好的发挥药效， 其治疗时间长， 延长了患者的 痛苦。
     虽然猪血去蛋白提取物具有促进细胞对氧和葡萄糖的摄取等作用， 但不能直接用 于患者临床应用， 并且此提取物是水溶液， 储存条件困难， 只能冷冻保存， 不仅耗电量大， 一 旦停电将直接影响其质量。并且现有的猪血去蛋白提取物为注射制剂， 其注射剂主要为治 疗脑血管疾病， 并无皮肤、 眼球炎症损伤治疗研究的报道。 发明内容
     为了解决上述技术问题， 本发明提供了一种治疗各种原因引起损伤的猪血去蛋白 提取物凝胶剂， 其具有迅速止痛、 杀菌效果好、 能有效抑制渗出、 创面迅速形成具有一定韧 性的且通透性好的保护膜、 结痂快、 愈合后不留伤疤、 疗程短、 易于储存、 治愈率高的特点。
     为了达到上述目的， 本发明是通过下述技术方案实现的 ：猪血去蛋白提取物凝胶剂， 它主要是由下述原料药按所述重量份数比制备而成 ： 猪血 去蛋白提取物溶液 20-50 份、 甲基纤维素 2-6 份、 甘油 10-15 份、 尼泊金甲乙酯 0.2-0.5 份。
     所述的最佳重量份数比为猪血去蛋白提取物溶液 35 份、 甲基纤维素 4 份、 甘油 12.5 份、 尼泊金甲乙酯 0.35 份。
     所述的猪血去蛋白提取物凝胶剂， 它还包括 pH 调节剂， pH 调节剂为 0.1mol/L 氢氧化钠或 0.1mol/L 盐酸， pH 调节剂的用量为将猪血去蛋白提取物凝胶剂的 pH 调节至 6.0-8.0。
     所述的猪血去蛋白提取物凝胶剂的制备方法， 取符合所述重量份数的甲基纤维素 和甘油加入到容器中， 用玻璃棒搅拌， 分散均匀， 充分润湿后加注射用水重量份数为 20-40 的注射用水， 再加入符合所述重量份数的加尼泊金甲乙酯， 搅拌均匀， 加 0.1mol/L 氢氧化 钠或 0.1mol/L 得盐酸， 调节 pH 值至 7.5-8.0， 115 ℃高压灭菌 30min， 取出， 冷却， 得基质 备用 ； 在无菌条件下向基质中加入符合所述重量份数的猪血去蛋白提取物溶液， 再加入 8.5-27.8 份的注射用水， 再用 0.1mol/L 氢氧化钠或盐酸调节 pH 至 6.0-8.0， 混匀使成凝胶 状， 用灭菌的玻璃棒搅拌均匀， 无菌分装， 即得猪血去蛋白提取物凝胶。
     所述的分装是分装至药用聚乙烯复合软管中。 本发明的猪血去蛋白提取物凝胶剂具有如下优点及效果 ： 本发明药物采用猪血为原料， 与同类牛血产品相比具有高安全性、 高生物活性的产品 优势， 并且药物中加入甘油作为保湿剂。由于猪血去蛋白提取物凝胶原料易得、 成本低， 生 产工艺先进、 周期短、 收率高， 与同类牛血产品相比具有价格优势。与以小牛血为来源的生 物制品比较， 本发明以猪血为来源的生物制品其原料易得、 成本低、 高安全性、 高生物活性 等优势， 弥补牛血制品存在的潜在风险， 本发明猪血去蛋白提取物凝胶剂的安全性和治疗 效果明显高于小牛血去蛋白凝胶。 经过试验数据可知， 本发明制剂与小牛血制剂相比， 治疗 皮肤损伤具有迅速止痛， 杀菌效果好， 能有效抑制渗出， 创面迅速形成具有一定韧性的且通 透性好的保护膜， 结痂快， 愈合后不留伤疤 ； 能有效的治疗角膜上皮层细胞的营养性损伤、 创伤性角膜炎、 免眼性角膜炎、 角膜糜烂及异物性角膜损伤等眼科炎症。使用方便， 无副作 用， 治愈率高。
     本发明采用猪血去蛋白提取物溶液制成的含有小分子肽、 核苷酸和寡糖类等的生 物活性成分凝胶制剂， 内含氨基酸、 肽、 羟基酸、 核苷酸等有机物。 其主要的药理作用是能在 细胞水平上促进组织细胞线粒体对氧和葡萄糖的摄取和利用、 ATP 合成、 营养物的运送、 新 陈代谢及组织再生、 修复等。
     本发明采用的基质易于涂展、 无油腻感， 能吸收组织渗出液不妨碍正常功能， 由于 单用甲基纤维素润滑性较差， 易失水、 霉变， 故加入保湿剂甘油和抑菌剂尼泊金甲乙酯， 保 持药物稳定性。 猪血去蛋白提取物凝胶剂既可用于治疗各种原因引起的皮肤损伤、 溃疡、 褥 疮、 整容、 整形及矫形等外科手术后损伤， 又可用于治疗眼科手术后引起的角膜、 结膜的创 伤、 炎症及溃疡， 包含角膜上皮层细胞的营养性损伤、 创伤性角膜炎、 免眼性角膜炎、 神经麻 痹性角膜炎、 角膜移植手术并发症及预防并发症、 角膜糜烂及异物性角膜损伤等。并且采 用药用聚乙烯复合软管， 与普通铝管比较， 能有效保证药品无菌环境， 避免增加药品染菌几 率。
     猪血去蛋白提取物能刺激细胞对氧和葡萄糖的摄取、 利用， 出尽细胞的增殖， 抑制
     细胞的损失， 但不能直接用于患者临床应用， 并且此提取物是水溶性， 储存条件困难， 只能 冷冻保存， 本发明研发的凝胶剂则解决了这一问题， 给药方便。
     除了本发明采用了猪血去蛋白提取物外， 其它原料与小牛血去蛋白凝胶的原料也 不同， 本发明经过大量实验筛选得出甲基纤维素、 甘油、 尼泊金甲乙酯混合作为基质， 由实 验数据可以看出， 甲基纤维素、 甘油、 尼泊金甲乙酯这几种辅料不仅起到了基质的作用， 同 时与猪血去蛋白提取物产生了协同作用， 进而提高了药物的治疗效果， 稳定性好。
     具体实例方式 下面结合实施例多本发明做进一步详细说明， 但本发明的保护范围不受实施例所限。
     下述的实施例中的实验方法如无特别说明， 均为常规方法。
     下述的实施例中的百分含量如无特别说明， 均为质量百分含量。
     实施例 1 ： 猪血去蛋白提取物溶液的制备 ： 按照专利号为 ZL200510046289.1， 发明名称为 “从猪 血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法” 中描述的制备方法 ： 取非传染区经检验 合格的健康猪， 采用无菌采血， 去纤维蛋白， 得去纤维蛋白血 40L， 反复冻融 （-20℃～ 40℃） 2-4 次 ； 于 2-8℃条件下在胶体磨中匀浆 2 分钟， 重复 3 次 ； 取匀浆液于 4000 转 / 分钟离心 20 分钟后， 弃去沉淀 ； 取上清液， 分别用截留分子量 100000D、 30000D、 10000D、 6000D 的中空纤 维超滤柱超滤， 得滤液 D 28.8L ； 将超滤液 D 经低温 （25℃） 减压浓缩 （至总固体含量 40mg/ ml 以上） ， 得猪血去蛋白提取物溶液 4800g。
     实施例 2 ： 猪血去蛋白提取物凝胶的制备 ： 本实施例含猪血去蛋白提取物 20%， 制成 1000 支猪血 去蛋白提取物凝胶。
     取 10L 的容器， 取甲基纤维素 100g， 甘油 500g， 用玻璃棒搅拌， 分散均匀， 充分润湿 后加注射用水 2000g， 加尼泊金甲乙酯 10g， 搅拌均匀， 加 0.1mol/L 氢氧化钠适量， 调节 pH 值至 7.5-8.0， 115℃高压灭菌 30min， 取出， 冷却， 得基质备用 ； 无菌条件下向基质中加入猪 血去蛋白提取物溶液 1000g， 再加注射用水至总重 5000g， 用 0.1mol/L 氢氧化钠或盐酸调节 pH 至 6.0-8.0， 混匀使成凝胶状， 用灭菌的玻璃棒搅拌均匀， 无菌分装， 5g/ 支， 共得 1000 支 猪血去蛋白提取物凝胶。
     实施例 3 ： 猪血去蛋白提取物凝胶的制备 ： 本实施例含猪血去蛋白提取物 27.5%， 制成 1000 支猪 血去蛋白提取物凝胶。
     取 10L 的容器， 取甲基纤维素 150g， 甘油 562.5g， 用玻璃棒搅拌， 分散均匀， 充分润 湿后加注射用水 1750g， 加尼泊金甲乙酯 13.75g， 搅拌均匀， 加 0.1mol/L 氢氧化钠适量， 调 节 pH 值至 7.5-8.0， 115℃高压灭菌 30min， 取出， 冷却， 得基质备用 ； 无菌条件下向基质中 加入猪血去蛋白提取物溶液 1375g， 再加注射用水至总重 5000g， 用 0.1mol/L 氢氧化钠或盐 酸调节 pH 至 6.0-8.0， 混匀使成凝胶状， 用灭菌的玻璃棒搅拌均匀， 无菌分装， 5g/ 支， 共得 1000 支猪血去蛋白提取物凝胶。
     实施例 4 ： 猪血去蛋白提取物凝胶的制备 ： 本实施例含猪血去蛋白提取物 35%， 制成 1000 支猪血 去蛋白提取物凝胶。取 10L 的容器， 取甲基纤维素 200g， 甘油 625g， 用玻璃棒搅拌， 分散均匀， 充分润湿 后加注射用水 1500g， 加尼泊金甲乙酯 17.5g， 搅拌均匀， 加 0.1mol/L 氢氧化钠适量， 调节 pH 值至 7.5-8.0， 115℃高压灭菌 30min， 取出， 冷却， 得基质备用 ； 无菌条件下向基质中加入猪 血去蛋白提取物溶液 1750g， 再加注射用水至总重 5000g， 用 0.1mol/L 氢氧化钠或盐酸调节 pH 至 6.0-8.0， 混匀使成凝胶状， 用灭菌的玻璃棒搅拌均匀， 无菌分装， 5g/ 支， 共得 1000 支 猪血去蛋白提取物凝胶。
     实施例 5 ： 猪血去蛋白提取物凝胶的制备 ： 本实施例含猪血去蛋白提取物 42.5%， 制成 1000 支猪 血去蛋白提取物凝胶。
     取 10L 的容器， 取甲基纤维素 250g， 甘油 687.5g， 用玻璃棒搅拌， 分散均匀， 充分润 湿后加注射用水 1250g， 加尼泊金甲乙酯 21.25g， 搅拌均匀， 加 0.1mol/L 氢氧化钠适量， 调 节 pH 值至 7.5-8.0， 115℃高压灭菌 30min， 取出， 冷却， 得基质备用 ； 无菌条件下向基质中 加入猪血去蛋白提取物溶液 2125g， 再加注射用水至总重 5000g， 用 0.1mol/L 氢氧化钠或盐 酸调节 pH 至 6.0-8.0， 混匀使成凝胶状， 用灭菌的玻璃棒搅拌均匀， 无菌分装， 5g/ 支， 共得 1000 支猪血去蛋白提取物凝胶。 实施例 6 ： 猪血去蛋白提取物凝胶的制备 ： 本实施例含猪血去蛋白提取物 50%， 制成 1000 支猪血 去蛋白提取物凝胶。
     取 10L 的容器， 取甲基纤维素 300g， 甘油 750g， 用玻璃棒搅拌， 分散均匀， 充分润湿 后加注射用水 1000g， 加尼泊金甲乙酯 25g， 搅拌均匀， 加 0.1mol/L 氢氧化钠， 调节 pH 值至 7.5-8.0， 115℃高压灭菌 30min， 取出， 冷却， 得基质备用 ； 无菌条件下向基质中加入猪血去 蛋白提取物溶液 2500g， 再加注射用水至总重为 5000g， 用 0.1mol/L 氢氧化钠或盐酸调节 pH 至 6.0-8.0， 混匀使成凝胶状， 用灭菌的玻璃棒搅拌均匀， 无菌分装， 5g/ 支， 共得 1000 支猪 血去蛋白提取物凝胶。
     实施例 7 ： 猪血去蛋白提取物凝胶的制备 ： 本实施例含蛋白提取物 35%， 制成 1000 支猪血去蛋白 提取物凝胶。
     猪血去蛋白提取物溶液为实施例 1 方法制得， 用此猪血去蛋白提取物溶液替代小 牛血去蛋白提取物， 并按照专利号 ZL200510083041.2， 专利名称 “一种小牛血去蛋白提取物 凝胶剂” 描述的方法制备， 制成 1000 支猪血去蛋白提取物凝胶。
     实施例 8 ： 猪血去蛋白提取物凝胶的制备 ： 本实施例含蛋白提取物 35%， 制成 1000 支猪血去蛋白 提取物凝胶。
     猪血去蛋白提取物溶液为实施例 1 方法制得， 用此猪血去蛋白提取物溶液替代小 牛血去蛋白提取物， 并按照专利号 ZL200810010480.4， 专利名称 “含有小牛血去蛋白提取物 眼用制剂组合物” ， 制成 1000 支猪血去蛋白提取物凝胶。
     实施例 9 ： 猪血去蛋白提取物凝胶治疗家兔细菌性角膜炎试验 实验选用健康家兔 80 只， 体重 2.0-2.5kg， 雌雄各半， 雌性未孕。 随机分为模型对照组、
     小牛血去蛋白凝胶组 （专利号 ZL200810010480.4， 专利名称 “含有小牛血去蛋白提取物眼用 制剂组合物） 、 A 组、 B 组、 C 组、 D 组、 E 组、 F 组分别按照实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6、 实施例 8 的方法制备， 每组 10 只。各组家兔以 0.6% 的盐酸丁卡因注射液滴眼 2 ～ 3 滴， 轻轻按摩片刻， 待角膜反射消失后用 1ml 注射器抽取 0.1ml 含菌培养基 ( 含金 9 黄色葡萄球菌 2.5×10 ) 自角膜近中央处注入角膜实质内， 造成约 4mm 直径的白色水泡， 然后分笼饲养。以上动物造模 24h 后开始给药， 各组每日自 10:00 至 15:30， 2h 给药一次， 连续 2 周。每只动物于接种细菌 24h 后开始观察记录一般情况和角膜炎症肉眼表现。以上 动物分别于给药第 1 天开始按评分标准评分 （表 1） ， 连续 2 周， 然后进行统计学分析 （表 2） 。 第 14 天观察结束后取眼角膜作切片 HE 染色， 于显微镜下观察角膜厚度、 溃疡、 炎细胞浸润、 成纤维细胞增生等炎症表现。
     表 1 病变评分标准表2金黄色葡萄球菌型角膜炎治疗后的不同时间症状评分比较 （ ±s）* ** 注： 与模型对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01结果显示 ： 模型对照组在接种 24h 出现明显的角膜炎反应， 大量的分泌物， 充血严重 ； 角膜肿胀， 呈白色混浊， 难以窥见虹膜和瞳孔， 角膜表面可见细小溃疡 ； 接种 10-14 天眼睑 严重粘连。猪血去蛋白提取物凝胶实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6 组与模 型对照组比较， 有显著统计学差异 （P ＜ 0.01） ， 以最佳配比组 （实施例 4） 效果最为显著， 给 药 3-4 天出现分泌物减少， 眼睑粘连， 混合性充血和眼睑肿胀减轻， 角膜菌斑缩小， 可隐约 窥见虹膜 ； 给药 7-10 天分泌物较少甚至消失， 角膜透明度增加， 个别可恢复光泽并清晰窥 见虹膜 ； 后期治疗组多数角膜分泌物少， 角膜光滑透明度好。实施例 8 组连续使用 14 天未 见症状好转。 小牛血去蛋白凝胶虽然与模型对照组比较， 有统计学差异 （P ＜ 0.05） ， 但其治 疗效果远不及猪血别， 并且恢复周期较长。
     病理检查结果 ： 模型组角膜显著增厚， 多数角膜上皮剥脱， 角膜伤口可达 1/2 基质 层， 周围可见大量坏死组织和炎细胞浸润， 严重者甚至出现穿孔。 猪血去蛋白提取物凝胶实 施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6 组角膜结构较完整， 伤口处由纤维细胞覆盖， 愈合较好， 感染后角膜炎性细胞浸润和角膜肿胀等明显缓解。实施例 8 组可见大量坏死组 织和炎细胞浸润。 小牛血去蛋白凝胶组角膜略增厚， 周围可见少量坏死组织和炎细胞浸润。
     实施例 10 ： 猪血去蛋白提取物凝胶治疗家兔角膜碱烧伤试验 实验选用健康家兔 80 只， 体重 2.0-2.5kg， 雌雄各半， 雌性未孕。 随机分为模型对照组、 小牛血去蛋白凝胶组 （专利号 ZL200810010480.4， 专利名称 “含有小牛血去蛋白提取物眼用 制剂组合物） 、 A 组、 B 组、 C 组、 D 组、 E 组、 F 组分别按照实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6、 实施例 8 的方法制备， 每组 10 只。各组家兔以 0.6％的盐酸丁卡因注射液滴眼 2 ～ 3 滴， 轻轻按摩片刻， 待角膜反射消失后， 上开睑器， 由助手按住白兔， 固定其头部 ( 尽 量不用全麻， 以免动物死亡 ) 事先剪好的直径约 8mm 的滤纸片沾取 1mol/L NaOH， 注意不要 太湿， 刚刚浸透即可， 用镊子小心夹起， 贴于兔角膜中央 1 分钟， 离开。用无菌生理盐水冲眼 5min， 约半瓶盐水， 注意贴滤纸片时一定不要触及眼睑及第三眼睑， 以免引起睑球粘连。以 上动物造模 48h 后， 开始给药， 每日 5 次， 每次 2 滴。角膜碱性化学伤后， 给药前及给药后 1、 2、 6、 10 和 14 天的 15:00 进行裂隙灯检查， 荧光素染色照相， 照片经计算机图像分析， 计算 角膜上皮愈合率 ( 详见表 3)。用药后 14 天处死动物， 沿巩膜缘稍后取下角膜， 进行光镜检 查。
     表3角膜碱烧伤治疗后角膜上皮愈合率比较 （%， ±s）8102302514 A CN 102302515说明* ** 注： 与模型对照组比较， P ＜ 0.05 ； P ＜ 0.01 表 3 结果显示 ： 猪血去蛋白提取物凝胶实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 69书组别 模型对照组 小牛血组 A组 B组 C组 D组 E组 F组第0天 38.5±8.4 37.3±9.3 39.2±8.7 37.9±7.9 38.9±7.8 39.4±8.4 41.6±10.0 39.1±7.5第1天 40.2±11.3 38.2±10.4 57.2±10.9* 58.9±10.2* 60.2±10.1* 58.6±11.2* 59.2±11.2* 42.3±10.1第2天 53.1±9.3 45.1±10.1 72.6±11.4** 73.1±9.7** 75.2±11.2** 73.7±10.3** 74.3±12.0** 60.8±10.7第6天 63.2±10.1 61.5±9.5 86.9±11.2** 87.5±11.7** 90.7±10.9** 88.4±11.0** 90.0±8.9** 70.0±9.9第 10 天 55.7±12.0 62.5±11.4* 84.4±11.4** 85.2±9.7** 88.7±10.7** 83.9±11.5** 84.2±13.0** 66.7±11.2*第 14 天 64.2±8.9 68.3±10.2 94.2±11.8** 93.8±9.9** 95.9±11.5** 94.6±11.2** 93.1±11.0** 79.8±10.7*7/13 页102302514 A CN 102302515说明书8/13 页组在给药第 1-2 天的角膜上皮愈合率与模型对照组相比均已呈现显著差异 （P<0.05） ； 至给 药第 6 天， 上皮愈合率已达到近 90% 左右 （P<0.01） ， 而模型对照组的仅为 63.2%（P<0.01） ； 至给药第 14 天时， 愈合率均恢复到 93% 左右 （P<0.01） ， 小牛血去蛋白凝胶组仅为 68.3%。 在 治疗过程中， 最佳配比组 （实施例 4） 对于角膜上皮愈合率优于其他组别。 猪血去蛋白提取物 凝胶实施例 8 组至给药第 10 -14 天时， 愈合率与模型对照组相比有统计学差异 （P<0.05） ， 但第 14 天的愈合率只为 79.8%， 明显低于其他实施例组。 小牛血去蛋白凝胶组仅在第 10 天 时与模型对照组比较有差异， 愈合率仅为 68.3%。
     病理检查结果 ： 正常兔角膜由上皮细胞层、 前弹力层、 基质层、 后弹力层和内皮细 胞层组成， 上皮细胞层由 5-6 层细胞组成， 排列规则。角膜碱烧伤后， 上皮层完全脱落， 前弹 力层模糊， 角膜基质暴露、 水肿、 增厚， 凝固性坏死， 内皮细胞面见纤维素性渗出及少数炎性 细胞浸润 ； 至给药第 14 天， 猪血去蛋白提取物凝胶实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6 组的角膜原烧伤区已被 4-6 层上皮细胞覆盖， 上皮细胞极向明显， 细胞间连接紧 密， 前弹力层、 基质层、 后弹力层和内皮细胞层基本恢复正常 ； 前弹力层已显现清晰， 水肿减 轻； 小牛血去蛋白凝胶组大部分兔眼原烧伤区的角膜上皮细胞亦已有增殖再生， 但新生上 皮层表面细胞部分脱落， 大部分基质纤维变性和水肿 ； 模型对照组兔眼原烧伤区的角膜上 皮细胞已见增殖再生， 但细胞层数不均一， 前弹力层模糊， 角膜基质见部分水肿。
     实施例 11 ： 猪血去蛋白提取物凝胶对大鼠深Ⅱ°烫伤的影响试验 Wistar 大鼠 80 只， 体重 1.5-1.7kg， 雌雄各半， 按 36mg/kg 的剂量腹腔注射戊巴比妥 钠麻醉， 背部用电动推剪毛。 仰卧位将大鼠固定于造模木板上， 使其背部皮肤暴露于模板孔 内， 将模板置于 85℃电热恒温水浴锅内， 造成大鼠深Ⅱ°烫伤 ( 烫伤时间为 12 秒 )。用纱 布轻轻擦干创面水渍， 0.3% 碘伏清洁消毒。 大鼠按烫伤面积均分为 8 组， 每组 10 只， 分别为 模型对照组， 小牛血去蛋白凝胶组 （专利号 ZL200510083041.2， 专利名称 “一种小牛血去蛋 白提取物凝胶剂” ） 、 A 组、 B 组、 C 组、 D 组、 E 组、 F 组分别按照实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6、 实施例 7 的方法制备。试验药和阳性对照药均匀地涂于烫伤部位， 模型 对照组不给药， 上敷生理盐水纱条或抗生素纱条， 外敷透气性敷料。隔日给药一次， 连续 14 天。观察大鼠第 7、 15 天的创面结痂面积和脱痂愈合时间， 对实验数据进行 t 检验。 表4 各药物组对大鼠深Ⅱ°烫伤各项指标的影响 （ ±s， n=10）
     注： 与模型对照组比较， *P ＜ 0.05 ； **P ＜ 0.01实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6 与模型对照组比较， 有统计学差异， 第 7 天和第 15 天的创面结痂面积显著缩小， 脱痂愈合时间显著缩短， 尤以最佳配比组 （实施例 4） 更为显著 ； 实施例 7 组虽采用猪血为原料， 但由于辅料的差别， 直至第 15 天创面面积才 有缩小差异 （P<0.05） 。小牛血去蛋白凝胶组与模型对照组比较无统计学差异。
     实施例 12 ： 猪血去蛋白提取物凝胶对大鼠皮肤创伤的影响 Wistar 大鼠 80 只， 体重 1.5-1.7 千克， 雌雄兼用 ( 雌性为未孕者 )。腹腔注射 1% 戊巴 比妥钠 30mg/kg 麻醉， 剃去背中部毛， 用碘酒消毒， 在相同部位用特制打孔器切割 2 个圆形 2 创面， 直径约 2cm， 面积约 4cm ， 深至皮下， 形成机械损伤动物模型。 大鼠随机分为 8 组， 每组 10 只， 分别为模型对照组， 小牛血去蛋白凝胶组 （专利号 ZL200510083041.2， 专利名称 “一 种小牛血去蛋白提取物凝胶剂” ） 、 A 组、 B 组、 C 组、 D 组、 E 组、 F 组分别按照实施例 2、 实施 例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6、 实施例 7 的方法制备。每天观察术后表皮、 肉芽组织生 长情况， 动态观察创面愈合过程计算创面愈合率 ； 于给药前和给药后第 3、 5、 7、 10、 14 天用 透明薄膜描记创面面积。 愈合率＝ ( 原创面面积－现创面面积 )/ 原创面面积 ×100%， 评价 创面的愈合速度。
     表5各药物组对大鼠皮肤创伤的影响 （±s， n=10）注： 与模型对照组比较， *P ＜ 0.05 ； **P ＜ 0.01 创面的一般观察 ： 猪血去蛋白提取物凝胶实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施 例 6 各组与模型组比较， 创面修复情况有明显的差别。术后 3 天猪血去蛋白提取物凝胶实 施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6 各组伤口开始出现少许红晕， 表明肉芽组织 已在生长， 而猪血去蛋白提取物凝胶实施例 7 组、 模型对照组和小牛血去蛋白凝胶组伤口 湿润 ； 给药 3-5 天， 实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6 各组肉芽组织生长明 显， 局部已长出薄层或点状上皮， 创缘皮肤收缩明显 ； 给药 7-10 天， 实施例 2、 实施例 3、 实 施例 4、 实施例 5、 实施例 6 各组伤口干燥、 无感染， 创面已基本为肉芽组织填充， 而实施例 7 组、 模型对照组和小牛血去蛋白凝胶组伤口湿润， 有渗出物， 收缩不明显， 仅见薄层肉芽， 未 见明显新生上皮。给药 14 天， 实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6 各组创面基 本愈合， 而实施例 7 组、 模型对照组和小牛血去蛋白凝胶组修复欠佳。
     动态观察创面愈合情况 ： 猪血去蛋白提取物凝胶实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6 各组与模型对照组比较， 有统计学差异， 治疗第 14 天时， 最佳配比组 （实施 例 4） 差异更为显著 （P<0.01） ， 能明显加速皮肤创伤愈合， 效果优于小牛血去蛋白凝胶组和 猪血去蛋白提取物凝胶实施例 7 组。
     实施例 13 ： 猪血去蛋白提取物凝胶对豚鼠肝细胞呼吸活力的影响试验 系用瓦氏呼吸检压仪测定豚鼠肝细胞匀浆的呼吸活力， 从测得的耗氧量计算出呼吸活 力 QO2（μl·O2/mg·h） 和刺激指数 （SI） 。
     供试品制备 ： A 组、 B 组、 C 组、 D 组、 E 组、 F 组、 G 组分别按照实施例 2、 实施例 3、 实施例 4、 实施例 5、 实施例 6、 实施例 7、 实施例 8， 小牛血去蛋白凝胶 1 组 （按照专利号 ZL200510083041.2， 专利名称 “一种小牛血去蛋白提取物凝胶剂” 中描述的方法制备） 、 小牛 血去蛋白凝胶 2 组 （专利号 ZL200810010480.4， 专利名称 “含有小牛血去蛋白提取物眼用制 剂组合物） 。
     肝细胞分离 ： 断头处死豚鼠， 取肝重 2g， 于冷生理盐水中剥除血管等纤维成分， 置 于 Hank’ s 液中漂洗 1~2 次， 置 1:10 的 Hank’ s 液中， 反复吹打制成细胞悬液。将悬液注入 离心管， 室温放置 5~10 分钟， 吸去上层脂肪等杂物， 反复三次， 200 目纱网过滤即得肝细胞 悬液， 备用。 检测 ： 采用瓦氏微量呼吸检压仪方法。
     反 应 瓶 中 先 加 入 Soerensen 缓 冲 液 1.1ml， 加 供 试 品 0.2ml， 然后加肝匀浆液 1.0ml， 加 10% 氢氧化钠溶液 0.2ml 于具一小滤纸条的反应瓶中间小杯。由于肝匀浆本身有 耗氧作用， 故实验时以 Soerensen 缓冲液 0.2ml 代替供试品， 其余试剂同样品管， 作为空白 管。将装好的反应瓶按管号与测压计相连， 置 37℃恒温水浴中。开动振荡器振摇 10 分钟 （75 次 / 分） 使反应瓶内外温度一致。 将测压计右侧柱液面调至 150mm， 记下左侧液面初读数 （A） ， 然后关闭三向活塞， 开始计时， 反应 30 分钟记时后将测压计右侧柱液面再调至 150mm， 记下左侧液面读数 （B） 。 打开三向活塞， 重复上述过程， 进行下一个 30 分钟的反应并记下左 侧液面初读数 （C） 及 30 分钟后的液面读数 （D） 。实验过程中必须附加一套供校正用的温压 计， 在反应瓶中加 2.5ml 的 Soerensen 缓冲液， 使其在与试验管完全相同的条件下试验， 观 察其压力的变化 （△ C） ， 以消除试验过程中温度及大气压的影响。
     计算 ： QO2（μl·O2/mg·h） =[（A-B+C-D） ×K1- △ C×K2]/G/I（QO2 ≥ 4.0） 式中 K1 为空白或样品的反应瓶常数， K2 为温压计的反应瓶常数， G 为每 1ml 肝匀浆的 干重 （mg） ， G= △ W/2-9.3， 9.3 为 Soerensen 缓冲液的干重 （mg） ， I 为反应时间 （小时） 。
     刺激指数 （SI） = 供试品 QO2/ 空白 QO2（SI ≥ 2.5） 表 6 猪血去蛋白提取物凝胶对豚鼠肝细胞呼吸活力影响的实验结果
     组别 A组 B组 C组 D组 E组 F组 G组 QO2 值 （μl·O2/mg·h） 5.21 5.14 5.29 5.10 4.99 3.78 3.82 12 SI 值 3.08 3.04 3.13 3.02 2.95 2.24 2.26102302514 A CN 102302515 凝胶 1 组 3.92 凝胶 2 组 3.97说明书2.32 2.3511/13 页通过对肝细胞呼吸活性的研究显示， A 组、 B 组、 C 组、 D 组、 E 组均可影响组织细胞内线 粒体有氧呼吸的链式反应， 影响氧化还原酶活性， 对细胞的呼吸活性有相同的作用， 最佳配 比组 （实施例 4） 对活性作用略高于其他组别。而猪血去蛋白提取物凝胶实施例 7、 实施例 8 组的 QO2 值和 SI 值均不符合规定要求。该试验方法检测两种专利的小牛血去蛋白凝胶 QO2 值和 SI 值均处于边缘值， 活性检测不稳定。
     实施例 10 ： 猪血去蛋白提取物凝胶稳定性数据 ： 1、 样品制备 ： A 组、 B 组、 C 组分别按照实施例 4、 实施例 7、 实施例 8， 小牛血去蛋白凝胶 1组 （按照专利号 ZL200510083041.2， 专利名称 “一种小牛血去蛋白提取物凝胶剂” 中描述 的方法制备） 、 小牛血去蛋白凝胶 2 组 （专利号 ZL200810010480.4， 专利名称 “含有小牛血去 蛋白提取物眼用制剂组合物） 。
     2、 样品检验项目 2.1 高分子量物质 ： 采用高效液相色谱法 （ 《中国药典》 2010 年版三部附录Ⅲ B） 试验， 使用 TSK-G2000SW 柱， 以乙腈－三氟醋酸－水 (40:0.1:60) 为流动相， 流速为 1ml/min， 检测 波长为 214nm。
     称取胰岛素 （M.W ＝ 5800） 适量， 用流动相配成浓度为 2.5mg/ml 的溶液作为对照 品溶液。
     取本品适量加乙腈 40ml 溶解， 滤过， 取续滤液作为供试品溶液。
     取对照品溶液和供试品溶液各 20μl， 注入液相色谱仪， 记录色谱图。将先于胰 岛素峰保留时间的峰视为高分子物质， 如有高分子量物质存在， 按面积归一化法计算， 高 分子量物质含量不得过 2.0%， 并确定高分子量物质最大分子量， 最大分子量限度不大于 10000Da。
     2.2 呼吸活性测定 ： 2.2.1 肝匀浆液的制备 ： 取体重 200— 300g 的雄性豚鼠一只， 颈部打击处死 （处死前需 禁食至少 24 小时） ， 立即切断颈动脉放血， 打开腹腔取出肝脏， 置冰水浴中的 Soerensen 缓 冲液中 （注意 ： 不要损伤胆囊或胆管） 。称取 5.5g 的肝脏， 并切割为大小相同的 7 块， 每块用 7ml 的 Soerensen 缓冲液匀浆 （注意 ： 以上操作必须在冰水浴中进行） 。 2.2.2 测定法 ： 预先把测压计反应瓶洗净并干燥， 备用 ； 装好测压液于测压管内， 调节液面至 150mm ； 反应瓶中先加入 Soerensen 缓冲液 1.1ml， 加供试品 0.2ml， 然后加肝匀 浆液 1.0ml ； 加 10% 氢氧化钠溶液 0.2ml 于具一小滤纸条的反应瓶中间小杯 ； 由于肝匀浆本 身有耗氧作用， 故实验时以 Soerensen 缓冲液 0.2ml 代替供试品， 其余试剂同样品管， 作为 空白管 ； 将装好的反应瓶按管号与测压计相连 （注意密闭， 勿使漏气） ， 置 37℃恒温水浴中 ； 开动振荡器振摇 10 分钟 （75 次 / 分） 使反应瓶内外温度一致。将测压计右侧柱液面调至 150mm， 记下左侧液面初读数 （A） ， 然后关闭三向活塞， 开始计时， 反应 30 分钟记时后将测压 计右侧柱液面再调至 150mm， 记下左侧液面读数 （B） 。打开三向活塞， 重复上述过程， 进行下 一个 30 分钟的反应并记下左侧液面初读数 （C） 及 30 分钟后的液面读数 （D） ； 实验过程中 必须附加一套供校正用的温压计， 在反应瓶中加 2.5ml 的 Soerensen 缓冲液， 使其在与试验
     管完全相同的条件下试验， 观察其压力的变化 （△ C） ， 以消除试验过程中温度及大气压的影 响； 取 2.0ml 肝匀浆， 置恒重的装有海沙的称量瓶中， 110℃干燥至恒重， 计算两次的重量差 △ W（mg） 。
     2.2.3 计算 ： QO2（μl•O2/mg•h） =[（A-B+C-D） ×K1- △ C×K2]/G/I（QO2 ≥ 4.0μl•O2/mg•h） 刺激指数 （SI） = 供试品 QO2/ 空白 QO2 （SI ≥ 2.5） 式中 K1 为空白或样品的反应瓶常数 ； K2 为温压计的反应瓶常数 ； G 为每 1ml 肝匀浆的 干重 （mg） ， G= △ W/2-9.3， 9.3 为 Soerensen 缓冲液的干重 （mg） ； I 为反应时间 （小时） 。
     2.3 多肽测定 ： 2.3.1 标准曲线的制备 ： 取带塞试管 6 支， 按顺序精密加入牛血清白蛋白标准液 0.00， 0.50， 0.70， 0.90， 1.10， 1.30ml， 再 依 次 加 水 1.60， 1.10， 0.90， 0.70， 0.50， 0.30ml， 再精密 加碱性铜试液 4.0ml 摇匀， 室温放置 10 分钟， 依次精密加入福林试液 0.4ml 摇匀， 加塞， 于 30℃恒温水浴保温 30 分钟， 冷却后， 在 660nm 的波长处测定吸收度， 以吸收度 A 为纵坐标， 白蛋白标准溶液浓度 C 为横坐标， 绘制 C-A 曲线， 或用最小二乘法回归， 求得回归方程。
     2.3.2 供试品测定 ： 取猪血去蛋白提取物凝胶 1g， 精密称定， 加水 10ml 溶解， 滤 过， 取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液 0.80ml， 以下照标准曲线制备， 自 “再 依次精密加碱性铜试液……” 起， 同法操作， 测定吸收度， 自标准曲线或回归方程求得供试 液的 mg 数。每支含多肽不低于 0.85mg。
     2.4 氨基酸测定 ： 2.4.1 色谱条件 ： 高效液相色谱仪 （岛津 LC-10ATvp） ； 流动相 A ： 称取 22.5g 醋酸钠， 加 水 1900ml， 溶解后用冰醋酸调 pH6.0， 加乙腈 100ml， 混匀， 用 0.45µm 滤膜过滤 ； 流动相 B ： 70% 乙腈 ； 流速 ： 0.8ml/min ； 检测波长 ： 254nm ； 柱温 ： 40℃ ； 表 7 梯度条件时间 （min） 0.01 4 12 20 28 31 35 38 40 流速 (ml/min) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 缓冲液 A（%） 100 97 80 74 70 50 30 0 100 缓冲液 B（%） 0 3 20 26 30 50 70 100 02.4.2 氨基酸标准品的配制 ： 分别取氨基酸标准品各约 25.0mg， 精密称定， 于 50ml 量 瓶中， 用 0.1mol/L 的 HCl 溶液溶解， 并定容至刻度， 配成浓度均为 0.5mg/ml 的氨基酸标准 品溶液。
     正亮氨酸内标溶液 ： 称取正亮氨酸约 10mg， 加 0.1mol/L 盐酸溶液 10ml 溶解， 混 匀。
     精密吸取氨基酸标准品溶液 200µl， 分别置 1ml 离心管中， 每个离心管中精密加 入正亮氨酸内标溶液 20µl， 0.5mol/L 三乙胺乙腈液 80µl， 50mmol/L 异硫氰酸苯酯乙腈液 80µl， 摇匀， 室温放置 1 小时， 加正己烷 320µl， 振摇后放置 10 分钟， 取下层溶液， 用 0.45μm 微孔滤膜滤过， 即得。2.4.3 供试品制备 ： 精密吸取猪血去蛋白提取物口腔膏适量， 精密测定， 加水 10ml 溶解， 滤过， 滤液分别置 1ml 离心管中， 按前述 “衍生方法” 操作， 制得猪血去蛋白提取 物注射液的衍生物溶液。
     2.4.4 测定 ： 取氨基酸标准品衍生物溶液和供试品各 2μl 进样， 记录色谱图。每 支含氨基酸 0.8mg-1.2mg。
     3、 加速试验测定 在温度 40℃ ±2℃、 相对湿度 75%±5% 的条件下放置 6 个月， 在试验期间第 1 个月、 2个 月、 3 个月、 6 个月末分别取样一次， 考察样品高分子量物质、 呼吸活性、 多肽、 氨基酸测定。
     4、 各试验测定结果 表 8 加速试验结果表由各试验数据结果可知， 本发明所设计的处方长期加速放置 6 个月均不影响产品的活 性和质量， 临床使用不会产生过敏等不良反应。 由于各厂家对所规定的质量标准不同， 本发 明规定的质量标准要求高于其他同行业标准， 检测更为严格， 故小牛血去蛋白凝胶 1 组 （按 照专利号 ZL200510083041.2， 专利名称 “一种小牛血去蛋白提取物凝胶剂” 中描述的方法制 备） 、 小牛血去蛋白凝胶 2 组 （专利号 ZL200810010480.4， 专利名称 “含有小牛血去蛋白提取 物眼用制剂组合物） 的各项指标均不符合规定要求， 说明本发明所选用的辅料与猪血去蛋 白提取物有较好的协同作用， 并不影响药物效果。小牛血去蛋白凝胶所含有的指标性成分 较少， 直接影响产品的疗效， 不及猪血去蛋白提取物凝胶。15