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本发明涉及包含生物可降解的聚合物、环糊精或其衍生物以及生物活性分子的纳米颗粒。所述纳米颗粒能缔合大量的生物活性分子，特别是疏水的生物活性分子，并且当它们被口服给药或通过有机体的任何其它粘膜给药时，其释放生物活性分子，从而提供该生物活性分子持续和恒定的血浆水平。

权利要求书
1.  包含生物可降解的聚合物、环糊精或其衍生物以及生物活性分子的纳米颗粒。

2.  如权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述生物可降解的聚合物是甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物。

3.  如权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述环糊精或其衍生物选自β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精及其混合物。

4.  如权利要求1所述的纳米颗粒，其包含两种或更多种生物活性分子。

5.  如权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述生物活性分子是小化学分子、蛋白质、肽、核苷、核苷酸、寡核苷酸、多聚核苷酸或核酸。

6.  如权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述生物活性的分子是药物、抗原或变应原。

7.  如权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述生物活性分子是疏水物质或P-糖蛋白酶的底物物质。

8.  如权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述生物活性分子选自放线菌素D、阿苯达唑、阿密曲替林、安普那韦、阿伐他汀、布尼洛尔、喜树碱、卡维地洛、塞利洛尔、环孢菌素、克霉唑、秋水仙碱、可的松、道诺霉素、异喹胍、地塞米松、洋地黄毒甙、地高辛、地尔硫卓、多西紫杉醇、多潘立酮、阿霉素、表柔比星、红霉素、雌二醇、依托泊苷、苯妥英、非索芬那定、FK506、氟尿嘧啶、庆大霉素、灰黄霉素、伊马替尼、印地那韦、伊曲康唑、左氧氟沙星、氯沙坦、洛伐他汀、甲苯哒唑、甲基强的松龙、甲氨喋呤、咪拉地尔、吗啡、奈非那韦、恩丹西酮、紫杉醇、吡喹酮、氢化泼尼松、泼尼松、奎纳定、雷帕霉素、利福平、沙奎那韦、西罗莫司、磺胺甲二唑、利托那韦、他克莫司、他林洛尔、替尼泊苷、特非那定、拓扑替康、去炎松、戊脉安、长春碱、长春新碱及其混合物。

9.  药物组合物，其包含至少权利要求1至8中任一权利要求所述的包含生物可降解的聚合物、环糊精或其衍生物以及生物活性分子的纳米颗粒和药物可接受的赋形剂、载体或佐剂。

10.  制备权利要求1至8中任一权利要求所述的纳米颗粒的方法，其包括在用水醇溶液使所述生物可降解的聚合物去溶剂化之前，将所述生物可降解的聚合物和(环糊精或其衍生物)：(生物活性分子)复合体，(CD:BAM复合体)，在有机溶剂中同时孵育的步骤；或者，将所述生物可降解的聚合物的纳米颗粒与包含所述[CD:BAM]复合体的水溶液孵育的步骤。

11.  药物组合物，其包含至少权利要求1至8中任一权利要求所述的包含生物可降解的聚合物、环糊精或其衍生物以及生物活性分子的纳米颗粒和药物可接受的赋形剂、载体或佐剂，其中所述生物活性分子是紫杉醇。

12.  如权利要求11所述的药物组合物，其中所述生物可降解的聚合物是PVM/MA共聚物。

13.  如权利要求11或12中任一权利要求所述的药物组合物，其中所述环糊精选自β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精及其混合物。

14.  如权利要求11所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒包含：
成分                                        与总量相比的重量％
甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物      75.00％-95.00％
β-环糊精                                   10.00％-24.99％
紫杉醇                                      0.01％-15.00％
或者，
成分                                        与总量相比的重量％
甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物      70.00％-95.00％
2-羟丙基-β-环糊精                          5.00％-24.99％
紫杉醇                                      0.01％-20.00％
或者，
成分                                        与总量相比的重量％
甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物      75.00％-95.00％
6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精                 5.00％-24.99％
紫杉醇                                      0.01％-20.00％

说明书包含环糊精和生物活性分子的纳米颗粒及其用途
发明领域
本发明涉及具有生物粘附特征的纳米颗粒，其包含生物可降解的聚合物、环糊精或其衍生物以及生物活性分子。本发明还涉及制备该纳米颗粒的方法以及含有所述纳米颗粒的组合物及其应用。
发明背景
在过去的数年中，已经开发了生物可降解的聚合纳米颗粒作为药物给药、特别是通过口服途径给药的载体的用途。纳米颗粒通常被定义为由天然或合成的聚合物形成的、尺寸小于一微米的固体颗粒型胶体系统。取决于其制备中所采用的方法，能获得两种类型的结构：纳米球或纳米胶囊。纳米球具有其中分散有活性成分的聚合基质型结构，而纳米胶囊具有被诸如聚合壳的壳包围的含有活性成分的核。由于这些系统的高比表面，活性成分还能在纳米颗粒系统的表面被吸收。
口服途径是用于医药产品给药的最广泛和最吸引人的途径。该途径的用途与患者对药物接受的明显增加以及较低卫生成本有关。然而，当通过该途径给药时，相当一部分药物具有非常低的功效。这种现象能被归结于一种或数种如下的限制药物的口服生物利用度的因素：(i)活性分子通过粘膜(通常与亲水药物缔合)的低渗透性、(ii)胃肠环境(存在极端pH值、酶等)中的低稳定性、(iii)药物从剂型中不完全的释放、(iv)活性成分在胃肠环境(与疏水药物缔合)中的低溶解性以及(v)首过效应。
在许多情况下，纳米颗粒系统允许明显地增加生物活性分子的生物利用度并因此提供新的给药策略。使用这些载体后获得的生物利用度的改善能够通过聚合纳米颗粒的发展与胃肠粘膜道的生物吸附相互作用的能力来解释。因此，当口服给予纳米颗粒悬浮液时，这些载体能与粘膜的某些组分相互作用并发展与其的粘附相互作用。取决于某些物理化学参数(例如聚合物的性质、大小、表面电荷或在载体中存在的某些涂层或配体)，纳米颗粒的生物粘附特征能够变化并在某些情况下，允许到达肠上皮细胞表面并可能发展与胃肠道非常特定的区域的生物粘附相互作用。所有的这些现象导致了(i)与粘膜表面紧密接触的剂型的停留时间的增加，或(ii)载体(与药物物质)在某些区域特定的定位。一旦纳米颗粒被粘膜粘附，其能通过数种机制促进被携带的药物的吸收及进入体循环。
通过其封装或与纳米颗粒的缔合增加了口服生物利用度的药物的示例性实例包括鲑鱼降钙素、呋塞米(furosemide)、阿伐醇(avarol)、双香豆素(dicumarol)、硝苯地平、氟嘧啶、质粒等。
乳酸与乙醇酸的单聚物和共聚物(PLGA)是特别重要的制备微粒系统的生物可降解的聚合物，因为它们具有很好的组织相容性，是无毒的并已经被用作可重吸收的缝合材料很多年了。这些(共)聚合物可溶于诸如氯仿、二氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯的有机溶剂，不溶于水性介质；然而，取决于其分子量及其组成，其能捕获水并或大或小地膨胀。在这些聚合物的缺点中，需要强调的是与其携带的许多抗原相比，PLGA是更疏水的。而且，PLGA的水合作用和降解都是在腐蚀相(erosion phase)中释放抗原的基本要求。由于聚合物降解产物，乳酸和乙醇酸的积累，该腐蚀导致了更酸性的微环境；pH能降至2-3的尺度。在这些情况下，被释放的蛋白质发生水解并在酸化的介质中聚集，并且许多抗原失去其抗原能力。最后，其高成本能限制其用途并促成寻找其它廉价的材料。
作为聚酯的替代选择，用其它聚合物制备的纳米颗粒被证明适合于药物的口服给药。最常用的聚合物之一是壳聚糖。壳聚糖是类似于纤维素的聚合物，其来自甲壳纲动物外骨骼的主要成分甲壳素的脱乙酰作用。能将壳聚糖制成不同大小的包含药物的纳米颗粒。壳聚糖颗粒能增加粘膜表面的蛋白质吸收，诱导紧密结点的瞬时开放。此外，壳聚糖能具有免疫调节效果，在不存在抗原时在体外刺激细胞因子产生并在粘膜水平改善天然的Th2/Th3平衡。
甲基乙烯基醚与马来酸酐的共聚物(PVM/MA)最近被认为是制备纳米颗粒的生物可降解的材料(Arbos et al.，J.Control.Release，83(2002)321-330)。这些PVM/MA共聚物广泛地用作增稠剂、水溶液的稳定剂、牙齿粘附成分、透皮贴剂和用于口服片剂。在这些聚酐的主要优势中，应强调其低成本、低口服毒性和能容易地与含有羟基或氨基基团的分子反应的官能团的可用性(Arbos et al.，J.Control.Release，89(2003)19-30)。因此，在水性介质中，酸酐基团被水解产生两个羧基基团，并且该反应允许将配体与聚合链或制备的纳米颗粒表面容易地结合。
环糊精(CD)是通过酶促淀粉降解获得的一类环状低聚糖。其由互相结合的α-1，4-吡喃葡萄糖单位形成，从而形成了具有疏水内部空腔的截头锥型结构。CD能含有多于15个α-1，4-吡喃葡萄糖单位，尽管丰度最高的CD包含6(α-CD)、7(β-CD)或8(γ-CD)个α-1，4-吡喃葡萄糖单位。在药物应用中，β-CD及其衍生物是最常用的，尤其是2-羟丙基-β-环糊精(OH-β-CD)。与原始化合物(β-CD)相比，这种CD具有高度水溶性、较低毒性以及更疏水的空腔。通过使用环糊精形成的复合体能为主分子提供稳定性和增加的水溶性，这能导致该分子(如药物)生物利用度的增加和/或副作用的减少。而且，文献中已经描述了增加脂质体和微粒负载容量的能力。CD还能调节被封装的药物的释放谱。
许多抗肿瘤剂通过肠胃外给药，这引起了一些问题。在与抗肿瘤剂的口服给药有关的主要优势中，应强调患者生存质量的提高以及卫生成本的降低。这种给药途径会允许将癌细胞持续地暴露于合适和持续的浓度水平的抗肿瘤药物下，这能改善治疗指数并减少副作用。然而，当被口服给药时，这些药物的大部分(如紫杉醇)具有低生物利用度。
1971年首次描述了提取自短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树的产物紫杉醇(Bristol Myers Squibb Company)，并且自1993年以来，其是全世界最常用的抗癌症化疗剂。紫杉醇在细胞水平起作用，促进微管蛋白的聚合。因此，在紫杉醇的存在下形成的微管是非常稳定并且无功能的，从而通过使细胞分裂的微管的动态和功能无能而导致细胞死亡。在欧洲，这种药物被标示为单独药剂(individual agent)和与其它肿瘤学疗法联合，用于治疗晚期和转移的卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。
这种药物的主要缺点是其差的口服生物利用度，这是由于其低水溶性并主要由于首过代谢效应。口服给药后，紫杉醇是P-糖蛋白以及诸如BCRP和MRP2的ABC(ATP结合盒)超家族其它成员的底物。蛋白质转运蛋白ABC超家族在有机体对毒性化合物和某些抗癌剂的防御中起主要作用。所述蛋白质(P-糖蛋白、MRP2和BCRP)位于肠、肝和肾的膜的顶端区域，介导生物异源物质和毒素向肠、胆腔和尿的泵送。而且，P-糖蛋白和MRP2都与CYP3A4、谷胱甘肽S-转移酶以及UDP-葡萄糖醛酸转移酶共同地一起定位，这涉及调节被给予的药物的口服生物利用度的协同作用。
由于前述原因，为了将其用于临床实践并通过静脉内途径使用，将紫杉醇配制在由Cremophor EL∶乙醇(1∶1)形成的载体中。为了防止和最小化Cremophor EL通过静脉内途径的毒性作用和改善药物的治疗指数，最近上市了基于将药物封装于被称为的白蛋白纳米颗粒中的制剂(Green et al.Annals of Oncology 17：1263-1268，2006)。
因此需要开发药物给药系统，其能在口服给药时增加许多活性成分的生物利用度，特别是那些具有亲脂性和/或是P-糖蛋白的底物的药物(如紫杉醇)。有利地，所述给药系统应具有生物粘附特征，应具有并入可变的量的亲脂性药物的能力，并且，理想地，应能防止P-糖蛋白对被运送的药物的影响。通过本发明提供的纳米颗粒能实现这些目标。
发明概述
足够令人惊讶的是，现在已经发现诸如甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物的生物可降解的聚合物的纳米颗粒与结合了生物活性分子的环糊精的缔合允许获得具有物理化学特性和与胃肠粘膜发生生物粘附的特性的纳米颗粒，这使其成为所有类型的生物活性分子，特别是诸如紫杉醇的疏水(亲脂)生物活性分子的转运蛋白的非常有趣的系统。所述纳米颗粒能延长其口服给药后在粘膜中的停留时间。而且，所述纳米颗粒能改善可以是P-糖蛋白底物的生物活性分子的生物利用度。同样地，所述纳米颗粒能用作高毒性药物(如细胞抑制剂)给药的系统，因为其在高达24小时的时间段内，提供持续和恒定的生物活性分子的血浆水平，这实现了可能的医院灌流替代疗法，允许减少用这些类药物进行治疗的卫生成本。
因此，本发明提供了为有效地通过粘膜给药，特别是通过口服途径给药，而具有缔合大量生物活性分子，特别是具有疏水性的生物活性分子的纳米颗粒。由于它们具有合适的、有助于纳米颗粒(含有生物活性分子)与粘膜表面的相互作用的生物粘附特性，它们能运送大范围的生物活性分子，特别是具有亲脂性的生物活性分子，尤其是，当被口服给药或通过有机体的任何其它粘膜给药时，它们能释放生物活性分子，提供其持续和恒定的血浆水平。如果被运送的生物活性分子是P-糖蛋白的底物，本发明的纳米颗粒能防止该蛋白质对要考虑的生物活性分子的影响。
本发明提供的纳米颗粒包含生物可降解的聚合物、环糊精或其衍生物，以及生物活性分子。具体地，已经发现容易制备由聚乙烯基甲基醚与马来酸酐的共聚物与β-环糊精(β-CD)、2-羟丙基-β-环糊精(OH-β-CD)或6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精(NH-β-CD)形成的纳米颗粒，并且其提供优异的生物粘附、大小和ζ电位，使其适合于疏水性生物活性分子(如紫杉醇)的给药。而且，已经发现选择其制备中使用的环糊精的类型允许适当地调节这些纳米颗粒的特性，使得其能够根据要被运送的生物学分子的类型和/或药物制剂的给药方式而有利地使用。最后，已经发现在这些纳米颗粒中并入紫杉醇允许以非常重要的方式增加其口服生物利用度，从而使P-糖蛋白在胃肠粘膜水平的影响最小化。
因此，在第一方面，本发明涉及包含生物可降解的聚合物、环糊精或其衍生物、以及生物活性分子，用于运送生物活性分子的纳米颗粒。在一具体实施方案中，生物可降解的聚合物是甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物。在另一具体实施方案中，环糊精是β-CD、OH-β-CD或NH-β-CD。
在一具体实施方案中，存在于本发明的纳米颗粒中的生物活性分子是紫杉醇。在这种情况下，纳米颗粒允许惊人地增加紫杉醇的口服生物利用度，由于紫杉醇的物理化学特性(高亲脂性)以及其是位于胃肠道的P-糖蛋白的底物的事实，其口服吸收几乎为零。
在另一方面，本发明涉及包含所述纳米颗粒的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及制备所述纳米颗粒的方法。
附图概述
图1示出与PMV/MA纳米颗粒缔合的环糊精的量根据所用CD的类型[β-CD：β-环糊精；OH-β-CD：2-羟丙基-β-环糊精；NH-β-CD：6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精]以及制备纳米颗粒前将后者与甲基乙烯基醚和马来酸酐(PVM/MA)的共聚物孵育的时间的变化。结果示出平均值±标准偏差(n＝8)。
图2是将基于PVM/MA的含有β-环糊精(β-CD-NP)的纳米颗粒的冻干样品用扫描电子显微术获得的结果的照片。
图3示出于37±1℃下，在模拟的胃介质(在第一个小时中：0-1h)并在模拟的肠介质(1至24h)中孵育后，RBITC从含有环糊精的纳米颗粒(β-CD-NP：基于PVM/MA的含有β-CD的纳米颗粒；OH-β-CD-NP：基于PVM/MA的含有OH-β-CD的纳米颗粒；NH-β-CD-NP：基于PVM/MA的含有NH-β-CD的纳米颗粒)和对照纳米颗粒(NP)中的释放。数据示出平均值±标准偏差(n＝3)。
图4是示出口服给予10mg用RBITC进行荧光标记的纳米颗粒后，代表(A)基于PVM/MA的含有羟丙基-β-CD(OH-β-CD-NP)的纳米颗粒；(B)基于PVM/MA的含有β-CD的纳米颗粒以及(C)对照纳米颗粒(NP)在胃肠道粘膜中分布的柱形统计图。X轴代表不同的粘膜部分；Y轴代表粘附至粘膜的纳米颗粒部分；Z轴代表给药后的时间。
图5示出通过将在全部胃肠道中粘附的纳米颗粒部分获得的生物粘附曲线相对于时间表示而获得的生物粘附曲线。表示的制剂是(●)OH-β-CD-NP；(▲)β-CD-NP；和(■)对照NP。数值示出平均值±标准偏差(n＝3)。
图6是示出口服给予10mg的单一剂量2小时后，通过荧光显微法观察的粘附至大鼠回肠的对照纳米颗粒(A)和OH-β-CD-NP(B、C)的一组照片。
图7示出根据所用的环糊精的类型和初始添加的药物的量，被封装于不同制剂的紫杉醇(PTX)量的变化。结果示出平均值±标准偏差(n＝6)。PTX-NP：含有紫杉醇的常规PVM/MA纳米颗粒；PTX-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和β-CD纳米颗粒；PTX-OH-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和OH-β-CD纳米颗粒；以及PTX-NH-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和NH-β-CD纳米颗粒。
图8是表示根据向实验室动物给予不同PTX制剂后的时间，紫杉醇(PTX)的血浆浓度的一组图。结果示出平均值±标准偏差。(A)静脉内途径，剂量：10mg/kg。商业紫杉醇制剂。(B)口服途径，剂量：10mg/kg。商业紫杉醇制剂；PTX-β-CD：含有紫杉醇的β-CD复合体；PTX-OH-β-CD：含有紫杉醇的OH-β-CD复合体；PTX-NH-β-CD：含有紫杉醇的NH-β-CD复合体。(C)口服途径，剂量：10mg/kg。PTX-NP：含有紫杉醇的常规PVM/MA纳米颗粒；PTX-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和β-CD纳米颗粒；PTX-OH-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和OH-β-CD纳米颗粒；PTX-NH-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和NH-β-CD纳米颗粒；含有紫杉醇商业制剂。对于商业紫杉醇制剂和PTX-NP获得的值重叠并显示于X轴(表9)。
发明详述
纳米颗粒
一方面，本发明涉及纳米颗粒，下文中称为本发明的纳米颗粒，其包含生物可降解的聚合物、环糊精或其衍生物、以及生物活性分子。
本发明的纳米颗粒具有合适的物理化学特性、对胃肠粘膜的特异性和生物粘附的特性，这使得其成为潜在的用于运送生物活性分子、尤其是亲脂性生物活性分子(如紫杉醇等)和/或是P-糖蛋白底物的生物活性分子的系统。一般地，本发明的纳米颗粒能够改善生物活性分子的生物利用度，并且具体地能够改善亲脂性生物活性分子和/或是P-糖蛋白底物的生物活性分子的生物利用度。实际上，本发明的纳米颗粒能延长其口服给药后在粘膜中的停留时间。同样地，本发明的纳米颗粒能用作运送诸如细胞抑制剂的具有高毒性的生物活性分子的系统，因为其在高达24小时的时间段内，提供这些药物持续和恒定的血浆水平，这允许设计医院灌注的替代疗法，导致减少用这些类型药物治疗的卫生成本。
本文所用的术语“纳米颗粒”涉及平均大小小于1.0微米(μm)的球体或类似形状。一般地，本发明的纳米颗粒的平均粒径为1纳米至999纳米(nm)，优选10nm至900nm。在一具体实施方案中，本发明的纳米颗粒的平均粒径为100nm至400nm。
“平均大小”被理解为在水性介质中共同移动的纳米颗粒群体的平均直径。能通过本领域技术人员已知的标准程序测量这些系统的平均大小，并且在下文所述的实施例所附的试验部分中示例性地描述这些标准程序。平均粒径能够主要受下列因素影响：存在于本发明的纳米颗粒中的生物可降解的聚合物的量和分子量、环糊精或其衍生物的性质和量以及生物活性分子的性质和量(一般地，所述成分的量或分子量越高，纳米颗粒的平均大小越大)、以及诸如搅拌速度等的制备所述纳米颗粒的方法的某些参数。
生物可降解的聚合物
本发明的纳米颗粒包含生物可降解的聚合物。本文所用的术语“生物可降解的”涉及这样的聚合物：其在期望的应用中(本发明中，期望的应用是体内治疗)，一旦该聚合物在25℃至40℃的温度下，暴露于pH为1至9，通常为4至9的生理学溶液时，该聚合物在可接受的时间段内溶解或降解。
本领域已知的几乎任何引起纳米颗粒形成的生物可降解的聚合物均能被用于实施本发明。所述生物可降解的聚合物的示例性的、非限制性的实例包括诸如聚乳酸、聚乙醇酸等的多羟基酸及其诸如乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)等的共聚物；聚酸酐；聚酯；诸如壳聚糖等的多糖。所述生物可降解的聚合物的分子量可在大范围内变化，只要其满足形成纳米颗粒并且是生物可降解的确定条件。
在一具体实施方案中，所用的生物可降解的聚合物是酸酐形式的甲基乙烯基醚与马来酸酐的共聚物(PVM/MA)。在一具体实施方案中，例如，能使用以商品名AN销售的PVM/MA共聚物。在一具体实施方案中，所述PVM/MA共聚物的分子量为100kDa至2,400kDa，优选200kDa至2,000kDa，更优选180kDa至250kDa。这种生物可降解的聚合物(PVM/MA)是特别有利的，因为由于其低毒性(口服途径的LD50＝8-9g/kg)和优异的生物利用度，其被广泛地用于制药技术。而且，由于量及其成本，其容易获得。由于其酸酐基团的存在，这种生物可降解的聚合物(PVM/MA)能与不同的亲水物质反应，而不需要借助于通常的具有相当毒性的有机试剂(戊二醛、碳二亚胺衍生物等)。在水性介质中，PVM/MA共聚物是不溶的，但其酸酐基团被水解而产生羧基基团。溶解是缓慢的并取决于其发生的条件。由于PVM/MA中可用的官能团，通过在水性介质中简单的孵育即可发生与带有诸如氢氧化物或氨基的亲核基团的分子的共价结合。
国际专利申请WO 02/069938描述了PVM/MA共聚物纳米颗粒，其内容被并入本说明书作为参考。作为示例，能通过共聚物的去溶剂化容易地获得所述PVM/MA共聚物纳米颗粒，通过向该共聚物的有机溶液中添加第一极性溶剂(与共聚物的溶液混溶)然后添加诸如水醇溶液的第二非溶剂液体来实现该去溶剂化。任选地，能添加交联剂。
环糊精及其衍生物
除了生物可降解的聚合物之外，本发明的纳米颗粒包含环糊精或其衍生物。
本说明书中所用的术语“环糊精”包括由通过α-1，4(α-1，4-吡喃葡萄糖)糖苷键连接的葡萄糖单位形成的任何环状低聚糖。这些单位是通过环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)引起的淀粉降解的分子内转糖苷反应的结果。
“环糊精”能含有超过15个α-1，4-吡喃葡萄糖单位，尽管丰度最高的环糊精含有6、7或8个α-1，4-吡喃葡萄糖单位，其分别形成所谓的α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)或γ-环糊精(γ-CD)。所有这些环糊精有具有疏水内部空腔和亲水外表面的截头锥型结构。这是由于羟基基团朝向环糊精的外侧，而在其疏水内部空腔中，其被亚甲基基团的氢以及醚类型的氧所覆盖。因此，其能充当完全或部分地捕获客体分子的主体。在一具体实施方案中，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。
本说明书中所用的术语“环糊精衍生物”包括任何具有至少一个被修饰的末端羟基基团的环糊精。环糊精的化学修饰能改变其物理化学性质，改善溶解性、稳定性并控制其所结合的分子(客体分子)的化学活性。已经描述了通过环糊精的OH基团的反应并入烷基、芳基、羧基烷基、氰基烷基、羟基烷基、磺基烷基、氨基、叠氮基、杂环基、乙酰基、苯甲酰基、琥珀酰基基团和其它含有磷、硫等的基团(Robyt(1998)“Essentials of carbohydrate chemistry(碳水化合物化学的要点)”，Ed.Charles R.Canto，Springer Advanced Text in Chemistry)。在一具体实施方案中，至少一个所述末端羟基基团被修饰，用下列基团取代氢：诸如甲基、乙基、丙基等的直链或支链的C1-C8烷基基团；诸如叔丁基二甲基硅烷基等的三(C1-C8)烷硅基；诸如2-羟基乙基、2-羟基丙基等的C1-C8羟基烷基；任选地用诸如乙酰基、琥珀酰基等羧基基团取代的(C1-C8)烷基羰基；诸如苯甲酰基的芳基羰基；诸如氰基甲基、氰基乙基的(C1-C2)氰基烷基；被任选地取代的氨基；叠氮基；磺基；(C1-C4)磺基烷基；或诸如葡糖基、甘露糖基等的糖类基团。在另一具体实施方案中，CD的两个或更多个末端羟基基团，例如β-CD中存在的2、3、4、5、6或7个末端羟基基团被任何的所述基团修饰。
母体环糊精(即无衍生作用)，尤其是β-CD，与无环的糖类相比，具有有限的水溶性，这部分地是由于结晶状态的环糊精的分子间的强键。而且，β-CD能在仲羟基基团间形成分子内氢键，从而产生不利的溶液的焓并因此产生低水溶性。用诸如甲氧基或乙氧基的疏水基团取代任何氢键会导致水溶性的增加。例如，β-CD在室温下的水溶性是1.85％(w/v)，但随着甲基化程度(甲基-β-CD)的增加，其水溶性上升高达150倍。另一特别重要的环糊精衍生物是用环氧丙烷处理β-CD后得到的2-羟丙基-β-环糊精(OH-β-CD)，其水溶性为60％(w/v)。同样地，这些衍生物能改善毒理学谱、封装生物活性分子的能力以及调节其释放谱。母体环糊精的主要问题是肠胃外给药后的肾毒性，主要对于CD，是由于其低水溶性。因此，诸如OH-β-CD的大部分亲水性衍生物降低了这些肾毒性问题，因为其能被更容易地消除。相同的情况不发生于甲基化的β-CD衍生物，尽管其比β-CD更可溶，由于其与内源脂质相互作用的能力更强，其并不免于导致全身毒性，这限制了其肠胃外用途。相反地，口服给药后进行的毒性研究表明，环糊精及其衍生物通过这种途径是无毒的。
环糊精是水溶性大分子，其被认可用于药物的口服、肠胃外和局部给药。环糊精在药物的口服给药中的应用主要是由于因增加溶解性、增加药物在胃肠道和/或制剂中的稳定性而改善的药物口服生物利用度。另外，对某些药物，环糊精在降低药物本身导致的局部刺激、控制药物在整个胃肠道中的释放或掩盖不需要的感官特征等方面的潜力是有趣的。在美国和欧洲上市的、与OH-β-CD缔合用于口服给药的伊曲康唑(itraconazole)就属于这种情况，当其以单独的方式给药时，其明显地降低了在胃肠道中产生的刺激。
另外，使用环糊精还因为其增加药物通过皮肤和粘膜的渗透性的能力，这引起药物的更好和更均匀的吸收。这导致药物给药后其活性的增加，例如，氟他胺(flutamide)与OH-β-CD之间形成的复合体显著改善了口服给药后药物的吸收。
在一具体实施方案中，所述环糊精衍生物是α-环糊精衍生物或β-环糊精衍生物或γ-环糊精衍生物。能用于实施本发明的环糊精衍生物的示例性的、非限制性的实例包括乙基-β-CD、七(2，3，6-三-O-乙基)-β-CD、2-羟丙基-β-CD、2-O-2-羟丙基-β-CD、2-羟乙基-β-CD、琥珀酰化的β-CD衍生物、琥珀酰化的2-羟丙基-β-CD衍生物、丁基-β-CD、七(2，6-二-O-正丁基)-β-CD、七(2，6-二-O-正戊基)-β-CD、甲基-β-CD、甲基-β-CD、羧甲基-β-CD、羧乙基-β-CD、七(2，6-二-O-甲基)-β-CD、七(2，3，6-三-O-甲基)-β-CD、乙酰基-β-CD、七(3-O-乙酰基-2，6-二-O-正戊基)-β-CD、七(3-O-乙酰基-2，6-二-O-甲基)-β-CD、磺基-β-CD、磺丙基-β-CD、正丁基-β-CD、七(3-O-正丁酰基-2，6-二-O-戊基)-β-CD、2-氰基乙基-β-CD、6-一脱氧-6-单叠氮基-β-CD、七(2，3，6-三-O-苄基)-β-CD、七(2，3，6-三-O-苯甲酰基)-β-CD、6-一脱氧-6-单氨基-β-CD、七(2，6-二-O-正戊基-3-O-三氟乙酰基)-β-CD、七(2，3，6-三-O-正辛基)-β-CD、七(2，3-二-O-乙酰基-6-O-叔丁基二甲基硅烷基)-β-CD、七(6-O-叔丁基二甲基硅烷基)-β-CD、七(6-O-叔丁基二甲基硅烷基-2，3-二-O-甲基)-β-CD、七(2，6-二-叔丁基二甲基硅烷基)-β-CD、七(2，3，6-三-O-三氟乙酰基)-β-CD、七(2，6-二-O-甲基-3-O-正戊基)-β-CD。
环糊精或其衍生物与生物可降解的聚合物之间的重量比能在大范围内变化，在一具体实施方案中，所述环糊精(或其衍生物)∶生物可降解的聚合物的重量比为1∶1-10，优选1∶1-5，更优选约1∶4。在一具体实施方案中，所述生物可降解的聚合物是PVM/MA。
如上文所述，在药物应用中，β-CD及其衍生物是最常用的，尤其是2-羟丙基-β-环糊精(OH-β-CD)，因为其具有高水溶性、低毒性以及比β-CD更疏水的空腔。
在一具体实施方案中，存在于本发明的纳米颗粒中的环糊精不带有任何被取代的羟基基团。在一具体实施方案中，所述环糊精是含有7个α-1，4-吡喃葡萄糖单位的β-环糊精(β-CD)。尽管β-CD∶生物可降解的聚合物的重量比是1∶1-10，优选1∶1-5，1∶4的比率提供好的结果。作为示例，约0.25mgβ-CD/mg生物可降解的聚合物提供了有效的缔合。在这种情况下，与纳米颗粒缔合的β-CD的量是约90微克/mg纳米颗粒。这些纳米颗粒的特征是通常具有球形的形状并且大小接近150nm。
在另一具体实施方案中，存在于本发明的纳米颗粒中的环糊精是更亲水的β-CD衍生物，例如包含一个或多个羟基烷基基团(如羟丙基)的羟基化的β-CD衍生物。在一优选的具体实施方案中，使用2-羟丙基-β-环糊精(OH-β-CD)。OH-β-CD∶生物可降解的聚合物的重量比是1∶1-10，优选1∶1-5，尽管1∶4的重量比提供了好的结果。作为示例，约0.25mgOH-β-CD/mg生物可降解的聚合物提供了有效的缔合。在这种情况下，与纳米颗粒缔合的β-CD的量是约65微克/mg纳米颗粒。这些纳米颗粒的特征是通常具有球形的形状并且大小接近150nm。
在另一具体实施方案中，存在于本发明的纳米颗粒中的环糊精是具有一个或多个不同于羟基的末端官能团的CD衍生物，例如具有一个或多个被任选取代的氨基基团的CD衍生物。氨基基团能依次被取代并具有诸如C1-C4烷基的其它官能团；所述被取代的氨基基团的示例性实例包括甲胺、乙胺、二乙胺等。在一优选的具体实施方案中，所述氨基基团是不带有取代基的游离氨基基团(-NH2)。在进行的一些分析中，已经观察到通过所述基团，口服给药的本发明的纳米颗粒在某些肠道部分聚集，这允许特异性的给药。在一具体实施方案中，存在于本发明的纳米颗粒中的环糊精衍生物是6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精(NH-β-CD)。NH-β-CD∶生物可降解的聚合物的重量比是1∶1-10，优选1∶1-5，尽管1∶4的比例提供了好的结果。这些纳米颗粒的特征是通常具有球形的形状并且大小接近150nm。
在一具体实施方案中，存在于本发明的纳米颗粒中的环糊精或其衍生物选自β-环糊精(β-CD)、2-羟丙基-β-环糊精(OH-β-CD)、6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精(NH-β-CD)及其混合物。
发明者进行的一些分析表明，基于生物可降解的聚合物的含有环糊精的纳米颗粒允许在这些载体(纳米颗粒)和胃肠道表面成分之间形成直接生物粘附相互作用。当生物活性分子通过任何途径(如口、直肠、阴道、眼或鼻的途径)给药以接近粘膜时，这种紧密接触对于提高生物活性分子的生物利用度是有趣的。
能通过基于例如国际专利申请WO 02/069938中描述的溶剂置换法的方法获得基于生物可降解的聚合物(如PVM/MA)的含有环式糊精的纳米颗粒(空纳米颗粒，即没有生物活性分子)。作为示例，能通过两种可选的方法获得包含生物可降解的聚合物(如PVM/MA)和环糊精或其衍生物的所述空纳米颗粒，具体地，通过在有机相中同时孵育生物可降解的聚合物(如PVM/MA)和环糊精或其衍生物(如β-CD、OH-β-CD或NH-β-CD)这两种成分[选择1]，或通过将生物可降解的聚合物(如PVM/MA)纳米颗粒与环糊精或其衍生物(如β-CD、OH-β-CD或NH-β-CD)的水溶液孵育[选择2]。
生物活性分子
除了生物可降解的聚合物和环糊精或其衍生物，本发明的纳米颗粒包含生物活性分子。
本文所用的术语“生物活性分子”涉及以预防或治疗目的，向优选人类的个体给予的任何物质；即能用于疾病的治疗、治愈、预防或诊断或改善人或动物的身体或精神的健康的任何物质。所述“生物活性分子”术语通常包括药物和抗原及变应原。
本发明的纳米颗粒能并入一个或多个生物活性分子，而与其溶解性特征无关，尽管所述纳米颗粒已经证明是用于给予疏水生物活性分子的尤其有用的系统。
当其通过任何途径(如口、直肠、鼻、阴道、眼的途径等)给药以接近有机体的任何粘膜时，本发明的纳米颗粒允许调节其含有的生物活性分子的分布。
所述生物活性分子的化学性质能在从小分子至大分子化合物(肽、多聚核苷酸等)的大范围内变化。
在一具体实施方案中，所述生物活性分子是肽或蛋白质。本文所用的术语“肽”涉及由通过肽键结合的氨基酸形成的化合物，并包括寡肽(由10个或更少的氨基酸形成)和多肽(由多于10个氨基酸形成)。同样地，本文所用的术语“蛋白质”涉及由通过肽键结合的氨基酸的直链形成的高分子量大分子；蛋白质能由一条或数条肽链形成。
在另一具体实施方案中，所述生物活性分子是核苷、核苷酸、寡核苷酸、多聚核苷酸或核酸。本文所用的“寡核苷酸”是通过5’-3’磷酸二酯键结合的核苷酸的聚合物，其长度等于或少于50个核苷酸，而“多聚核苷酸”是通过5’-3’磷酸二酯键结合的核苷酸的聚合物，其长度大于50个单位。同样地，术语“核酸”也涉及通过5’-3’磷酸二酯键结合的核苷酸的聚合物；取决于核苷酸是核糖核酸或脱氧核糖核酸，核酸将分别是RNA或DNA。核酸在活有机体的细胞中有不同的功能，例如，储存遗传信息并将其向下一代传递(DNA)或在蛋白质合成中表达该信息(mRNA和tRNA)，它们是细胞器的结构成分，例如核糖体(rRNA)，核酸催化某些化学反应(核糖核酸酶)并参与基因表达的调控机制(通过RNA干扰中mRNA或dsRNA的互补RNA)。
在另一具体实施方案中，所述生物活性分子是小(有机或无机)分子；通常，通过化学合成或半合成方法获得这些分子，或者，从其来源中分离这些分子。在一具体实施方案中，所述小(有机或无机)分子具有相对低的分子量，一般等于或小于5,000，通常等于或小于2,500，有利地，等于或小于1,500。许多治疗活性成分具有这些特征从而能用于实施本发明。
尽管存在于本发明的纳米颗粒中的生物活性分子能是亲水性物质和疏水性物质，在一具体实施方案中，本发明的纳米颗粒尤其用于给予疏水性生物活性分子。因此，在一具体实施方案中，存在于本发明的纳米颗粒中的生物活性分子是疏水性物质。本文所用的“疏水性物质”是由于其性质或组成而不非常溶解于水性介质的物质，在20℃、pH为1至7.5和大气压力的条件下，其通常的溶解度低于1％(每100ml水性溶剂1克活性成分)。
基本上任何疏水性生物活性分子均能用于实施本发明。能存在于本发明的纳米颗粒中的疏水性生物活性分子的示例性、非限制性的实例包括抗寄生物剂(如阿苯达唑(albendazole)、甲苯哒唑(mebendazole)、吡喹酮(praziquantel)等)、抗真菌剂(如克霉唑(clotrimazole)、伊曲康唑等)、抗生素(如磺胺甲二唑(sulfamethizole)、庆大霉素(gentamicin)、灰黄霉素(griseofulvin)等)、强心剂(如地高辛(digoxin)等)、抗肿瘤剂(如喜树碱(camptothecin)、甲氨喋呤(methotrexate)、多西紫杉醇(docetaxel)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、紫杉醇等)、免疫抑制剂(如他克莫司(tacrolimus)、环孢菌素(cyclosporine))、(糖)肾上腺皮质激素(如可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化泼尼松(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、去炎松(triamcinolone)等)等。
在另一具体实施方案中，存在于本发明的纳米颗粒中的生物活性分子是P-糖蛋白的底物物质。实际上，本发明的纳米颗粒的重要应用在于其使P-糖蛋白对某些药物通过粘膜的吸收的负面影响最小化的能力。
已知P-糖蛋白(PGY1；酶EC 3.6.3.44)是在人类中被又称为MDR1(多药耐药性1)基因的ABCB1基因编码的蛋白。P-糖蛋白充当跨膜转运蛋白或泵，其将其底物(通常是药物和其它生物异源物质)从其细胞内区域运送至其细胞外区域。取决于其解剖学位置，P-糖蛋白通过三种主要方式起作用：(1)由于P-糖蛋白在肠细胞管腔膜的表达，P-糖蛋白限制药物物质在其口服给药后进入有机体；(2)由于P-糖蛋白在肝细胞的小管膜和肾近端小管细胞管腔膜的表达，一旦药物已经达到血液循环，则P-糖蛋白促进其在胆汁和尿中的消除；和(3)一旦在全身血液循环中，P-糖蛋白限制了药物在敏感组织中的渗透。
因此，P-糖蛋白的底物物质涉及诸如生物异源物质的具有与P-糖蛋白的细胞内区域相结合的亲和力的物质，使得其能够根据下列反应通过ATP消耗被传送至细胞外：
ATP+H2O+生物异源物质(内部)＝ADP+磷酸盐+生物异源物质(外部)
能够作为生物活性分子存在于本发明的纳米颗粒中的已知的P-糖蛋白底物的示例性的、非限制性的实例包括抗肿瘤剂(如多西紫杉醇、依托泊苷(etoposide)、伊马替尼(imatinib)、紫杉醇、替尼泊苷(teniposide)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、蒽环类(如阿霉素(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)等)等)、β-肾上腺素受体拮抗剂(如布尼洛尔(bunitrolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、他林洛尔(talinolol)等)、Ca2+通道阻断剂(如地尔硫卓(diltiazem)、咪拉地尔(mibefradil)、戊脉安(verapamil)等)、强心药物(如洋地黄毒甙(digitoxin)、地高辛、奎纳定(quinidine)等)、抗病毒剂(如安普那韦(amprenavir)、印地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)等)、类固醇(如地塞米松、甲基强的松龙(methylprednisolone)等)、免疫抑制剂(如环孢菌素A(cyclosporine A)、西罗莫司(sirolimus)、他克莫司等)、止吐药物(多潘立酮(domperidone)、恩丹西酮(ondansetron)等)、抗生素(如红霉素(erythromycin)、左氧氟沙星(levofloxacin)等)、降血脂剂(如阿伐他汀(atorvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)等)、组胺H1受体拮抗剂(如非索芬那定(fexofenadine)、特非那定(terfenadine)等)、和其它治疗组的药物(如阿密曲替林(amitriptyline)、秋水仙碱(colchicine)、异喹胍(debrisoquine)、伊曲康唑、氯沙坦(losartan)、吗啡(morphine)、苯妥英(phenytoin)、利福平(rifampin)、放线菌素D(actinomycin D)、拓扑替康(topotecan)、雌二醇(estradiol)、雷帕霉素(rapamycin)、FK506等)，等等(Fromm MF；Trends 2004；25：423-429)。
在一具体实施方案中，所述生物活性分子是疏水物质或P-糖蛋白酶的底物物质，其选自放线菌素D、阿苯达唑、阿密曲替林、安普那韦、阿伐他汀、布尼洛尔、喜树碱、卡维地洛、塞利洛尔、环孢菌素、克霉唑、秋水仙碱、可的松、道诺霉素、异喹胍、地塞米松、洋地黄毒甙、地高辛、地尔硫卓、多西紫杉醇、多潘立酮、阿霉素、表柔比星、红霉素、雌二醇、依托泊苷、苯妥英、非索芬那定、FK506、氟尿嘧啶、庆大霉素、灰黄霉素、伊马替尼、印地那韦、伊曲康唑、左氧氟沙星、氯沙坦、洛伐他汀、甲苯哒唑、甲基强的松龙、甲氨喋呤、咪拉地尔、吗啡、奈非那韦、恩丹西酮、紫杉醇、吡喹酮、氢化泼尼松、泼尼松、奎纳定、雷帕霉素、利福平、沙奎那韦、西罗莫司、磺胺甲二唑、利托那韦、他克莫司、他林洛尔、替尼泊苷、特非那定、拓扑替康、去炎松、戊脉安、长春碱、长春新碱及其混合物。
在一优选实施方案中，存在于本发明的纳米颗粒中的生物活性分子是紫杉醇。
在一具体实施方案中，本发明的药物组合物包括含有一种或多种不同药物的本发明的纳米颗粒。所述药物的示例性的、非限制性的实例包括属于不同治疗组的药剂，例如抗肿瘤剂、β-肾上腺素受体拮抗剂、镇痛剂、Ca2+通道阻断剂、强心药物、抗病毒剂、类固醇、免疫抑制剂、止吐药物、抗生素(如抗菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗寄生物剂等)、降血脂剂、组胺H1受体拮抗剂、抗炎剂、神经保护剂(neuroprotector)、抗过敏剂、平喘剂、抗生素、肺表面活性物质等。
能观察到某些是P-糖蛋白底物的生物活性分子具有疏水性。同样地，本发明提供的用于生物活性分子给药的系统考虑了多个治疗组的药物给药的可能性。
在另一具体实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的纳米颗粒，该纳米颗粒含有一种或多种不同的用于疫苗目的的抗原或者一种或多种不同的用于免疫治疗目的的变应原作为生物活性分子。
本说明书中所用的术语“抗原”涉及当被导入个体时，能够被个体的免疫系统识别和/或能够在个体中诱导导致B和/或T细胞激活的体液免疫应答或细胞免疫应答的任何物质；作为示例，所述术语包括从高等有机体或诸如细菌、病毒、寄生生物、原生动物、真菌等的微生物获得的任何天然或重组的免疫原性产物，其含有一种或多种抗原决定簇，例如所述有机体的结构成分；毒素，例如外毒素。几乎任何抗原均能用于制备负载有抗原的本发明的纳米颗粒。作为非限制性的示例，术语“抗原”包括：
-“微生物”抗原，即微生物的抗原，其包括但不限于传染性病毒、细菌、真菌和寄生生物；所述抗原包括天然或人工来源的完整的微生物及其部分、片段和衍生物，以及与微生物天然抗原相同或类似，并对该微生物诱导特异性免疫应答的合成或重组产物；从这个意义上讲，如果化合物诱导了像微生物的天然抗原的免疫应答一样的(体液和/或细胞)免疫应答，则该化合物类似于该微生物的天然抗原；本领域的技术人员常规地使用所述抗原；和
-“肿瘤”抗原，即与肿瘤或癌症(“肿瘤标记”)有关的诸如肽的物质，其能引起免疫应答，尤其是当存在于MHC分子的环境中时，所述MHC例如Her2(乳腺癌)；GD2(神经母细胞瘤)；EGF-R(恶性胶质母细胞瘤)；CEA(髓样甲状腺癌)；CD52(白血病)；人黑素瘤gp100蛋白；人黑素瘤Melan-A/MART-1蛋白；酪氨酸酶；NA17-A nt蛋白；MAGE-3蛋白；p53蛋白；HPV16E7蛋白；所述抗原的抗原性片段等。
本说明书中所用的术语“变应原”涉及个体对其敏感并导致免疫反应的物质，例如，花粉变应原提取物、昆虫变应原提取物、食物或食物产品变应原提取物、存在于昆虫唾液、螯或刺中并在个体中诱导敏感性反应的成分、存在于植物中并在个体中诱导敏感性反应的成分等，例如诸如禾本科花粉、变应原性黑麦草提取物、变应原性洋橄榄(橄榄)提取物等的花粉蛋白提取物；诸如来自尘螨等的昆虫蛋白提取物、变应原性食物成分提取物等。几乎任何变应原都能用于制备本发明组合物的负载有变应原的纳米颗粒；然而，在一具体实施方案中，所述变应原是卵白蛋白(OVA)，其是广泛地用作试验变应原模型的蛋白质。
能够含有本发明的纳米颗粒的生物活性分子的示例性的、非限制性的实例包括细菌抗原：细胞质、周质、胞外被膜抗原(如内膜蛋白、外膜蛋白、脂多糖及杂配物(mixed complex)、与细胞壁缔合的蛋白质等)等；表面结构抗原(如菌毛、多糖蛋白质复合物(glycocalix)、鞭毛等)，其包括诸如布鲁氏菌(Brucella sp.)、沙门氏菌(Salmonella sp.)的细胞内病原体的表面结构抗原；真核微生物的可溶解的抗原和表面抗原；病毒抗原，如基质、衣壳、被膜、内部(包括酶的)抗原、动物物种(螨等)变应原、植物(禾本科等)变应原等。
能通过基于诸如国际专利申请WO 02/069938中描述的溶剂置换法的方法获得本发明的纳米颗粒，该溶剂置换法包括(i)形成(环糊精或其衍生物)-(生物活性分子)复合体，在下文中称为[CD:BAM]复合体，和(ii)在形成纳米颗粒之前，将所述[CD:BAM]复合体并入生物可降解的聚合物的有机溶剂的溶液中。
简单地说，所述[CD:BAM]复合体的形成包括向环糊精或其衍生物(CD)的水溶液中添加生物活性分子(BAM)的诸如例如乙醇的醇的有机溶剂的溶液。搅拌混合物直至达到平衡。通过诸如减压蒸发或任何用于除去溶剂的其它系统的任何合适的常规方法除去水和有机溶剂(如乙醇)。
存在于所述[CD:BAM]复合体中的CD∶BAM的摩尔比能在大范围内变化，除了其它因素以外，该比率取决于所述复合体中存在的环糊精或其衍生物(CD)和生物活性分子；然而，在一具体实施方案中，存在于所述[CD:BAM]复合体中的CD∶BAM的摩尔比是1∶1-4，通常是1∶1-2。在一具体实施方案中，当生物活性分子是紫杉醇时，所述[CD:BAM]复合体中的CD∶BAM的摩尔比是1∶1。
能在形成纳米颗粒之前，以下列方式将所述[CD:BAM]复合体并入到生物可降解的聚合物的有机溶剂的溶液中：向生物可降解的聚合物的溶液中添加所述复合体，然后在搅拌下(例如通过使用超声、磁力或机械搅拌器)以及约20℃至30℃的温度下，将生物可降解的聚合物(如PVM/MA)和[CD:BAM]复合体这两种成分在包含生物可降解的聚合物(如PVM/MA)的有机相(如丙酮)中，同时孵育通常是10分钟至60分钟的合适时间段(在一具体实施方案中，当生物活性分子是紫杉醇时，能在室温(25℃)下孵育培育30分钟的时间段)；通过以这种方式操作，通常获得[CD:BAM]复合体与生物可降解的聚合物的高度缔合。简单地说，该步骤包括在有机溶剂(如丙酮)中同时溶解和/或分散生物可降解的聚合物和[CD:BAM]复合体。将混合物在室温下，搅拌孵育一定的时间段。优选地，生物可降解的聚合物的浓度为0.001％w/v至10％w/v，并且所述[CD:BAM]复合体的浓度为0.001％w/v至5％w/v。任选地，若需要，向所述溶液中添加一定体积与聚合物溶液可混溶的极性溶剂(如乙醇)。另外，任选地，若需要，如WO 02/069938中描述的那样，能使用交联剂改善纳米颗粒的稳定性。能使用的交联剂的示例性实例包括二胺化的分子(如1，3-二氨基丙烷等)、多糖或简单的糖类、蛋白质、以及一般地具有能与存在于生物可降解的聚合物中的基团反应的官能团的任何分子，例如，与存在于PVM/MA中的酸酐基团反应。然而，一般不需要交联，因为交联由于存在环糊精或其衍生物而同时发生。如果期望交联，应添加少量任何指出的产品。
然后，为了形成本发明的纳米颗粒，向前述混合物中添加类似体积的第二非溶剂液体，优选水醇溶液。在一具体实施方案中，使用药物品质的水(根据应用，纯化水或注射用水(wfi))。优选地，有机相∶水醇溶液体积比在1∶1至1∶10的范围内。当出现乳状悬浮时，即刻在介质中形成了纳米颗粒。能通过诸如减压蒸发的任何合适的方法除去有机溶剂，而纳米颗粒保留在稳定的水性悬浮液中。若需要，能通过诸如离心、超速离心、切向过滤或包括使用真空的蒸发的常规方法可能地纯化所述纳米颗粒。最后，若需要，能够将纳米颗粒冻干以用于长期贮存和保存。为了有利于冻干，能够使用诸如蔗糖、乳糖或甘露糖醇的普通冷冻防护剂，优选其浓度为0.1％至10％重量比。
或者，能通过包括将生物可降解的聚合物(如PVM/MA)纳米颗粒与包含[CD:BAM]复合体的水溶液孵育的方法获得基于生物可降解的聚合物的本发明的纳米颗粒。简单地说，该替代选择包括将生物可降解的聚合物溶解于诸如丙酮的有机溶剂中。然后，向该溶液中添加一定体积的诸如乙醇的水醇溶液，最后向该溶液中添加类似体积的水。当出现乳状悬浮时，即刻在介质中形成了纳米颗粒。通过类似于上文的方法中描述的方式，例如通过减压蒸发，除去有机溶剂，而纳米颗粒保留在稳定的水性悬浮液中。然后在包含前述获得的[CD:BAM]复合体的水溶液中孵育生物可降解的聚合物的纳米颗粒。在类似于对于上文的方法所描述的条件下，在合适的温度下和搅拌下(如通过使用超声、磁力或机械搅拌器)将生物可降解的聚合物的纳米颗粒与[CD:BAM]复合体的孵育进行一定的时间段(一般地，在20℃至30℃的温度下，孵育10分钟至60分钟的时间段)。然后通过诸如离心的常规方法纯化纳米颗粒，最后，若需要，按照相同的前述方法将其冻干。
存在于本发明的纳米颗粒中的BAM∶生物可降解的聚合物的重量比能在大范围内变动，除了其它因素，该比例取决于存在于所述纳米颗粒中的生物可降解的聚合物(如PVM/MA)和生物活性分子；然而，在一具体实施方案中，存在于本发明的所述纳米颗粒中的BAM∶生物可降解的聚合物的重量比是1∶4-20，优选1∶10。
存在于本发明的纳米颗粒中的[CD-BAM]复合体∶生物可降解的聚合物的比率能在大范围内变动，除了其它因素，该比例取决于存在于所述纳米颗粒中的生物可降解的聚合物(如PVM/MA)、环糊精或其衍生物以及生物活性分子(BAM)；然而，在一具体实施方案中，存在于本发明的所述纳米颗粒中的[CD-BAM]复合体∶生物可降解的聚合物的重量比是1∶1-20，有利地是1∶2-20，优选3∶10(约1∶3.3)。
在一具体实施方案中，生物可降解的聚合物是PVM/MA。
在另一具体实施方案中，生物活性分子是紫杉醇。
在另一具体实施方案中，环糊精衍生物是β-环糊精(β-CD)、2-羟丙基-β-环糊精(OH-β-CD)或6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精(NH-β-CD)。
在另一具体实施方案中，生物活性分子是紫杉醇并且(环糊精或其衍生物)∶紫杉醇的摩尔比是1∶1。
在一具体实施方案中，[CD:BAM]复合体是摩尔比为1∶1的β-CD∶紫杉醇复合体，并且紫杉醇∶生物可降解的聚合物(如PVM/MA)的重量比是1∶4-20，尽管接近1∶10的比率提供了好的结果。作为示例，每mg聚合物对应摩尔比为1∶1的β-CD∶紫杉醇的复合体中约0.25mg的紫杉醇提供了有效的缔合。在这种情况下，与纳米颗粒缔合的药物的量是约40微克紫杉醇/mg纳米颗粒。这些纳米颗粒的特征是形状为球形并且大小接近300nm。
在另一具体实施方案中，[CD:BAM]复合体是摩尔比为1∶1的OH-β-CD复合体，并且紫杉醇∶生物可降解的聚合物(如PVM/MA)的重量比是1∶4-20，尽管接近1∶10的比率提供了好的结果。作为示例，每mg聚合物对应摩尔比为1∶1的OH-β-CD∶紫杉醇的复合体中约0.25mg的紫杉醇提供了有效的缔合。在这种情况下，与纳米颗粒缔合的药物的量是约170微克紫杉醇/mg纳米颗粒。这些纳米颗粒的特征是形状为球形并且大小接近300nm。
在另一具体实施方案中，[CD:BAM]复合体是摩尔比为1∶1的NH-β-CD复合体，并且紫杉醇∶生物可降解的聚合物(如PVM/MA)的重量比是1∶4-20，尽管接近1∶10的比率提供了好的结果。作为示例，每mg聚合物对应摩尔比为1∶1的OH-β-CD∶紫杉醇的复合体中约0.25mg的紫杉醇提供了有效的缔合。在这种情况下，与纳米颗粒缔合的药物的量是约100微克紫杉醇/mg纳米颗粒。这些纳米颗粒的特征是形状为球形并且大小接近300nm。
在另一具体实施方案中，当配制在含有β-CD的本发明的纳米颗粒中的剂量为10mg/kg的紫杉醇被口服给药时，在约5小时内达到最大血浆浓度(Cmax)后，获得了至少24小时的恒定和持续的血浆水平。最大血浆浓度(Cmax)与商业制剂的静脉内给药后获得的最大血浆浓度相似。通过这种制剂获得的紫杉醇血浆曲线下面积(AUC)比以相同剂量静脉内给药的商业医药产品获得的紫杉醇血浆曲线下面积大约5倍。这种制剂的特征是其提供的有机体中药物的平均停留时间(MRT)比商业制剂的静脉内给药后获得的平均停留时间长约4倍。
在另一具体实施方案中，当配制在含有OH-β-CD的本发明的纳米颗粒中的剂量为10mg/kg的紫杉醇被口服给药时，在约6小时内达到最大血浆浓度(Cmax)后，获得了至少24小时的恒定和持续的血浆水平。最大血浆浓度比商业制剂的静脉内给药后获得的最大血浆浓度大2倍。通过这种制剂获得的紫杉醇血浆曲线下面积(AUC)比以相同剂量静脉内给药的商业药剂获得的紫杉醇血浆曲线下面积大约5倍。这种制剂的特征是其提供的有机体中药物的平均停留时间(MRT)比商业制剂的静脉内给药后获得的平均停留时间长约3.5倍。
在另一具体实施方案中，当配制在含有NH-β-CD的本发明的纳米颗粒中的剂量为10mg/kg的紫杉醇被口服给药时，在约4.7小时内达到最大血浆浓度(Cmax)后，获得了至少24小时的恒定和持续的血浆水平。最大血浆浓度约是商业制剂的静脉内给药后获得的最大血浆浓度的一半。通过这种制剂获得的紫杉醇血浆曲线下面积(AUC)与以相同剂量静脉内给药的商业医药产品获得的紫杉醇血浆曲线下面积类似。这种制剂的特征是其提供的有机体中药物的平均停留时间(MRT)比商业制剂的静脉内给药后获得的平均停留时间长约3倍。
药物组合物
另一方面，本发明涉及包含至少本发明的纳米颗粒和药物可接受的赋形剂、载体或佐剂的药物组合物。
一般地，所述生物活性分子将与环糊精或其衍生物形成复合体，并且所述复合体将主要在本发明的纳米颗粒内；然而，能发生的是，含有生物活性分子的复合体的相当大部分与纳米颗粒的表面结合，尽管其大部分在本发明的纳米颗粒内部(如被封装)。
当本发明的纳米颗粒以接近有机体的任何粘膜的途径(包括口、直肠、鼻、阴道或眼的途径)给药时，其能用于调节缔合的生物活性分子的分布。另外，其也能被肠胃外给药。
药物组合物的实例包括用于口、颊、舌下、局部、眼、鼻、阴道或肠胃外给药的任何流体组合物(纳米颗粒的悬浮液或分散体)；用于其局部、眼、鼻或阴道给药的凝胶、软膏、乳膏或香脂形式的任何组合物；或用于其口服给药的任何固体组合物(片剂、胶囊剂)。在一具体实施方案中，药物组合物被口服给药。在另一具体实施方案中，所述药物组合物被肠胃外给药。
描述的药物组合物对于每一制剂会包含合适的赋形剂。例如，在片剂或胶囊剂形式的口服制剂的情况下，若需要，将包括粘合剂、崩解剂、润滑剂、填充剂、肠溶衣等。通过混合、湿法或干法造粒和并入本发明的纳米颗粒常规地制备口服固体制剂。还能使药物组合物适应于以诸如无菌溶液、悬浮液或冻干产品的形式并以合适的剂型进行的其肠胃外给药；在这种情况下，所述药物组合物将包括诸如缓冲剂、表面活性剂等的合适的赋形剂。在任何情况下，将根据所选的药物剂型选择赋形剂。在C.Faulíi Trillo的专著“Tratado de Farmacia Galénica”，10th Edition，1993，Luzán 5，S.A.de Ediciones中能找到关于药物的不同药物剂型及其制备的综述。
本发明的纳米颗粒中并入的生物活性分子的比例能在大范围内变化，例如，其能高达相对于纳米颗粒总重量的25％重量比。然而，在每一情况下，合适的比例将取决于被并入的生物活性分子。
被给药的本发明的纳米颗粒的剂量能在大范围内变化，例如每kg体重约0.01mg至约10mg，优选每kg体重0.1mg至2mg。
以下通过一些并不限制而是说明本发明的实施例描述本发明。
实施例
以下的实施例描述了基于生物可降解的聚合物(PVM/MA)的包含环糊精的纳米颗粒(实施例1-5)和基于生物可降解的聚合物(PVM/MA)的包含环糊精和生物活性分子的纳米颗粒(实施例6和7)的制备和表征，其中所述生物活性分子与环糊精缔合和/或与形成所述纳米颗粒的基质的生物可降解的聚合物(PVM/MA)缔合。所述实施例示出纳米颗粒发展与粘膜的生物粘附相互作用及促进诸如紫杉醇的生物活性分子的口服吸收的能力。在所述实施例中能观察到，当使用紫杉醇作为生物活性分子时，其被并入基于PVM/MA并包含环式糊精，尤其是2-羟丙基-β-环式糊精的所述纳米颗粒中，允许获得至少24小时的药物物质恒定和持续的血浆水平。
以下描述了用于制备和表征所述纳米颗粒的一般方法。
A.含有环糊精和任选的生物活性分子的纳米颗粒的制备
制备基于生物可降解的聚合物(PVM/MA)、包含环糊精和任选的生物活性分子的纳米颗粒的方法是前述的基于聚合物的可控去溶剂化的一般方法[Arbos et al.，J.Control.Release，83(2002)321-330]的修改。为了该目的，在磁力搅拌下将甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物和一定量的环糊精或者通过常规方法(如Hamada et al.，JBiosci Bioeng 102(4)：369-71，2006)获得的环糊精：生物活性分子复合体溶解在丙酮中。孵育后，在磁力搅拌下，向该相中添加可混溶的有机溶剂(乙醇)和类似体积的去离子水，以在乳状悬浮出现时形成纳米颗粒。然后通过减压蒸发除去有机溶剂(乙醇和丙酮)，而颗粒保留在稳定的水性悬浮液中。任选地，能用水溶性的生物活性分子或为所得的纳米颗粒提供特异性靶向属性(targeting properties)的配体包被形成的纳米颗粒。在使纳米颗粒悬浮液均匀化后，将其减压蒸发直至除去这两种有机溶剂，例如通过使用诸如Büchi R-144旋转蒸发仪(Switzerland)的旋转蒸发仪。然后通过超速离心(Sigma 3k30，rotorNo.-12150，Germany)或切向过滤纯化悬浮液，并可能地在-80℃冷冻纳米颗粒，以用于随后的冻干和长期保存(Virtis Genesis，New York，United States)。
B.纳米颗粒的物理化学表征
纳米颗粒的表征涉及下文描述的一些研究。在物理化学研究中，测定了纳米颗粒的粒径和表面电荷，其中后者通过测量ζ电势而测定。通过光子相关光谱法(photon correlation spectroscopy)，使用Zetasizernano Z-S(Malvern Instruments/Optilas，Spain)，获得这两种参数。
通过两种方法计算方法的收率。在第一种方法中，使用没有冷冻防护剂的冻干样品的重量，根据公式I，重量分析地计算收率：
收率＝(冻干物的重量/初始重量)×100    [公式1]
其中
初始重量是加入到制剂中的生物可降解的聚合物(如PVM/MA)和环糊精的重量；并且
冻干物的重量是冻干过程后制剂的重量。
第二种方法基于通过与ELSD(蒸发光散射检测(evaporativelight-scattering detection))型检测器联用的高效液相色谱(HPLC)(Agueros et al.，J.Pharm.and Biomed.Anal.，39(2005)495-502)，通过下文描述的定量的方法进行的定量，其允许对环糊精和PVM/MA共聚物进行定量。在这种情况下，根据公式2计算收率：
收率＝(Q初始-QPVM/MA)×100    [公式2]
其中
Q初始是添加的PVM/MA的初始的量；并且
QPVM/MA是上清液中测定的PVM/MA的量。
通过扫描电子显微法(scanning electron microscopy)(Zeiss，DSM940A Germany)观察纳米颗粒的形态学。为了该目的，用约9nm的分子金层包被冻干的纳米颗粒(Emitech K550 Equipment，Sputter-Coater，United Kingdom)，并用Zeiss DMS 940A显微镜(United States)拍照。
为了证实存在与纳米颗粒缔合的环糊精(定量方法如下文所述)，使用LECO CHN-900型元素分析仪(LECO Corporation，United States)，对不同的纳米颗粒制剂进行了元素分析。
与纳米颗粒缔合的环糊精的量的定量
为了测定与纳米颗粒缔合的未被胺化的环糊精[如β-环糊精(β-CD)和2-羟丙基-β-环糊精(OH-β-CD)]的量，使用与ELSD型检测器联用HPLC方法。在1100系列LC型色谱仪(Agilent，Waldbornn，Germany)中进行分析，并使用Chem-Station G2171程序(Agueros et al.，J.Pharm.andBiomed.Anal.，39(2005)495-502)在惠普计算机中分析数据。
为了样品分析，用纯化水将纳米颗粒纯化过程后获得的上清液稀释至10ml。添加内标物(PEG 6000)后，取1ml等份的上清液作为样品。使用Zorbax Eclipse XDB-Phenyl色谱柱(Agilent 150mm×2.1mm)和水/乙腈的梯度混合物(参见表1)作为流动相，以0.25ml/min的流量分析该样品。
表1
流动相的梯度条件(A：乙腈；B：水)
 时间(min)  A(％)  B(％) 0  0  100 2  0  100 9  60  40 11  71  29 12  0  100
优化检测器(ELSD)的条件直至根据流动相使用的梯度达到最大灵敏度(雾化器温度：115℃；氮气流量：3.2ml/min)。在不到15分钟内色谱分离了不同的环糊精、PVM/MA和内标物(PEG 6000)。保留时间是：
对于PVM/MA是1.08±0.05分钟；
对于β-CD是4.58±0.07分钟；
对于OH-β-CD是10.27±0.06分钟；和
对于内标物是13.60±0.04分钟。
环糊精的定量极限是0.2mg/ml，聚合物(PVM/MA)的定量极限是0.05mg/ml。准确度不超过7％的极限。
在对与纳米颗粒缔合的胺化的环糊精[如6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精(NH-β-CD)]进行定量的情况下，使用了上文描述的方法的变种以防止环糊精和聚合物的峰的重叠。因此，使用加热至40℃的NH2-Zorbax色谱柱(Agilent 4.6×150mm，5μm)并使用流量为1ml/min的甲醇/水混合物(80/20v/v)作为流动相来分析样品。检测器(ELSD)的条件如下：雾化器温度：71℃并且氮气流量：1.9ml/min。在不到7分钟内色谱分离了6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精。保留时间是3.8±0.07分钟。
最后，与纳米颗粒缔合的环糊精(CD)的量被计算为初始添加的CD的量和上清液中定量的CD的量的差。
RBITC的定量
通过比色法，在540nm的波长下测定并入在纳米颗粒中的罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)的量(Labsystems iEMS Reader MF，Finland)。对于该定量，使用了范围是5μg/ml至50μg/ml的RBITC在0.1N NaOH中的校准曲线，r＝0.999。
RBITC的量被估计为添加的初始量和一定量的纳米颗粒在0.1NNaOH中全部水解(24h，37℃)后发现的量的差。
RBITC的释放
在100,000MWCO渗析管(VIVASPIN，Hannover，Germany)中进行RBITC从纳米颗粒中释放的动力学。为了该目的，在37±1℃下，将10mg纳米颗粒分散于1ml模拟的胃介质(0h-1h)或模拟的肠介质(1h至24h)(USP XXIII)中。在一定的时间，将纳米颗粒的悬浮液离心(5,000×g，15min)，并用比色法(λ＝540nm)定量滤液中RBITC的量。
紫杉醇的定量
用HPLC测定封装于纳米颗粒中的紫杉醇的量。在与二极管阵列UV检测系统联用的1100系列LC型色谱仪(Agilent，Waldbornn，Germany)进行分析。通过Chem-Station G2171程序在惠普计算机中分析数据。为了分离紫杉醇，使用加热至30℃的Phenomenex Gemini C18反相色谱柱(150mm×3mm；5μm)。流动相由磷酸调节溶液(pH＝2；0.01M)和乙腈的混合物(体积比为50/50)组成，并以0.5ml/min的流量泵送。在288nm进行检测。
为了分析新鲜样品，取100μl水性纳米颗粒悬浮液并用100μl乙腈将其破坏。将溶剂蒸发(离心蒸发器)，并将样品在所用的流动相中重建。将100μl等份进样至HPLC柱中进行分析。
C.生物粘附研究
使用先前描述的方案[Arbos et al.，Int.J.Pharm.，242(2002)129-136]，根据纳瓦拉大学伦理学委员会(Ethics Committee of theUniversity of Navarra)的规章和试验动物欧洲法规(86/609/EU)进行生物粘附研究。
为了该目的，将平均体重为225g的雄性Wistar大鼠(Harlan，Spain)保持在没有食物和水的正常条件下。将1ml包含10mg用RBITC标记的纳米颗粒的水性悬浮液向动物口服给药。在不同的时间(0.5、1、3和8小时)通过颈椎脱位处死动物。打开腹腔，移除胃肠道并将其分成6个解剖学区域：胃(Sto)、小肠(I1、I2、I3和I4)和盲肠(Ce)。纵向打开每一粘膜段并用PBS(pH 7.4)淋洗。依次将每一这些部分切成5个类似的部分，并用1ml的3M NaOH消化组织24小时。用2ml甲醇提取罗丹明，将其涡流搅拌1分钟然后在2,000×g下离心10分钟(5804R Centrifuge，Rotor A-4-44，Germany)。将1ml等份获得的上清液用水(3ml)稀释，并用荧光光谱法在λex 540nm和λem 580nm(GENios，Austria)进行分析以估计粘附至粘膜的纳米颗粒部分。通过向进行相同的提取步骤的对照组织片段中添加RBITC的3M NaOH的溶液(0.5μg/ml-10μg/ml)来制备校正线(r＞0.996)。
为了比较不同的制剂，研究了生物粘附动力学和曲线。为了该目的，将粘附的纳米颗粒部分对时间作图，从而获得生物粘附曲线。基于后者，并使用WinNonlin 1.5计算机应用(Pharsight Corporation，UnitedStates)，测定了如下的动力学生物粘附参数：Qmax、AUCadh、Tmax、MRTadh和Kadh(Arbos et al.，J.Control.Release，89(2003)19-30)。Qmax(mg)是粘附至胃肠粘膜的纳米颗粒的初始最大容量，这涉及其发展生物粘附相互作用的能力。AUCadh(mg.h)是粘附的纳米颗粒部分的曲线下面积，其代表生物粘附强度。MRTadh(h)是估计的制剂保持粘附至粘膜的平均时间。Kadh被定义为粘附在粘膜中的部分的消除速率。所有的这些参数都在0小时至8小时内进行估计。使用WinNonlin 1.5程序(Pharsight Corporation，United States)进行计算。
D.粘附至粘膜的纳米颗粒的观察
通过荧光显微法观察胃肠粘膜中含有环糊精和任选的生物活性分子的纳米颗粒的显示。为了该目的，使用含有RBITC的制剂。将所述制剂(10mg纳米颗粒)向实验室动物(雄性Wistar大鼠)口服给药并在两小时后将动物处死。处死后，提取胃肠道，收集小肠的不同部分，并且如上文的生物粘附研究中所描述的那样，将其用磷酸盐缓冲盐水(pH＝7.4；0.15M)洗涤。将不同的肠部分用O.C.T.TM(Sakura，Netherlands)处理，并在液氮中冷冻。然后在低温恒温器(2800 Frigocut E，Reichert-Jung，Germany)中，将组织样品切成5μm厚的部分，并将其固定至支持物以通过荧光显微法进行观察。
E.药代动力学研究
根据纳瓦拉大学伦理学委员会的规章以及试验动物欧洲法规(86/609/EU)，进行药代动力学研究。为了该目的，在给予制剂之前12小时，将平均体重为225g的雄性Wistar大鼠(Harlan，Spain)隔离于代谢笼中，不让其进食，但是允许其随意饮水。
将动物分成8个处理组(每组6个动物)并用并入任何如下制剂的10mg/kg(2.25mg)的单一剂量紫杉醇进行处理：
(i)的i.v.溶液(Bristol-Myers Squibb，Madrid，Spain)；
(ii)的口服溶液；
(iii)紫杉醇(PTX)-2-羟丙基-β-c环糊精(OH-β-CD)[PTX-OH-β-CD]复合体；
(iv)紫杉醇(PTX)-β-环糊精(β-CD)[PTX-β-CD]复合体；
(v)紫杉醇(PTX)-6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精(NH-β-CD)[PTX-NH-β-CD]复合体；
(vi)基于PVM/MA(NP)的紫杉醇(PTX)-2-羟丙基-β-环糊精(OH-β-CD)-纳米颗粒[PTX-OH-β-CD-NP]复合体；
(vii)基于PVM/MA(NP)的紫杉醇(PTX)-β-环糊精(β-CD)-纳米颗粒[PTX-β-CD-NP]复合体；和
(viii)基于PVM/MA(NP)的紫杉醇(PTX)-6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精-纳米颗粒[PTX-NH-β-CD-NP]复合体。
除了通过尾静脉给药(0.3ml)的i.v.溶液(商业制剂)的情况外，向动物给予溶解或分散于水中的1ml的不同制剂。
给药后，使用乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂，在不同的时间提取约300μl体积的血液，并通过腹膜内(i.p.)途径用等体积的生理盐水恢复动物(大鼠)的血液体积。将血液在5,000rpm下离心10分钟并将上清液(血浆)冷冻于-80℃。根据国际动物试验指南(WHO Chronicle，39(2)：51-56，1985；A CIOMS Ethical Code for Animal Experimentation)中包括的原则，通过纳瓦拉大学伦理学委员会认可的方案进行研究。
样品的预处理
通过液-液萃取方法，使用叔丁基甲基醚作为萃取溶剂，从血浆中萃取紫杉醇。为了该目的，取血浆等份(0.1ml)，用水将其调节至1ml的体积，并向其中添加0.2μg多西紫杉醇作为内标物。然后添加4ml叔丁基甲基醚并搅拌1分钟。然后将样品在10,000rpm下离心10分钟，收集上清液(有机相)并将其在离心蒸发器(Savant，Barcelona，Spain)中蒸发。将获得的萃取液通过涡流搅拌1分钟，在200μl乙腈与磷酸调节溶液(pH＝2；0.01M)的混合物(50/50v/v)中重建。将所得溶液转移至进样瓶中。
分析方法：HPLC
通过具有紫外-可见检测的高效液相色谱(HPLC)进行紫杉醇的定量。使用多西紫杉醇作为内标物。在1100系列LC型色谱仪(Agilent，Waldbornn，Germany)中进行分析。通过Chem-Station G2171程序在惠普计算机中分析数据。为了分离紫杉醇，使用加热至30℃的150mm×3mm；5μm的Gemini C18反相色谱柱(Phenomenex)。流动相由磷酸调节溶液(pH＝2；0.01M)与乙腈的混合物(50/50的体积比)形成，并以0.5ml/min的流量驱动其通过色谱柱。在228nm下进行检测。
验证了分析方法，证实了在40ng/ml至3,200ng/ml的浓度范围内，检测器的响应与紫杉醇的血浆浓度之间的线性关系。
药代动力学分析
使用WiNNonlin 1.5药代动力学调节程序(Pharsight Corporation，Mountain View，United States)的非房室调节方法对紫杉醇给药后血浆浓度数据随时间的变化进行药代动力学分析。
计算了如下的药代动力学参数：最大浓度(Cmax)、达到Cmax的时间(tmax)、血浆水平曲线下面积(AUC0-inf)、平均停留时间(MRT)以及末端消除相中的生物学半衰期(t1/2z)、清除率(Cl)和稳态分布容积。
通过AUMC(一次矩血浆浓度的曲线下面积)的值与AUC的值的比计算平均停留时间(MRT)。清除率(Cl)被计算为剂量×生物利用度/AUC，稳态分布容积(Vss)被计算为清除率与被计算为1/MRT的末端清除常数(k)的比。
F.统计学分析
为了进行生物粘附和药代动力学研究，使用非参数“Mann-Whitney”测试来分析制剂。P＜0.05的值被认为是显著的。使用统计学软件程序(10，Microsoft，United States)进行所有的计算。
实施例1
用于获得纳米颗粒的生物可降解的聚合物(PVM/MA)与环糊精之间的缔合过程的优化
通过修改先前描述的方法[Arbos et al.，J.Control.Release，83(2002)321-330]后的可控去溶剂化制备纳米颗粒。为了该目的，在磁力搅拌下，将甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物和一定量的β-环糊精(β-CD)、2-羟丙基-β-环糊精(OH-β-CD)或6-一脱氧-6-单氨基-β-环糊精(NH-β-CD)在丙酮中孵育。孵育后，在磁力搅拌下，向该相中添加可混溶的有机溶剂(乙醇)和类似体积的去离子水，在出现乳状悬浮时形成纳米颗粒。在使纳米颗粒悬浮液均匀后，将其减压蒸发(Büchi R-144 rotary evaporator，Switzerland)直至除去这两种有机溶剂。然后用超速离心(Sigma 3k30，rotor No.-12150，Germany)纯化该悬浮液。将一部分获得的纳米颗粒冷冻于-80℃以用于其随后的冻干和长期保存(Virtis Genesis，New York，United States)。
图1示出制备纳米颗粒时，根据孵育时间，与具有生物可降解的聚合物(PVM/MA)的纳米颗粒缔合的环糊精的量。在所有的情况下，观察到了CD和聚合物之间最优的孵育时间。该孵育时间是30分钟。最后，必须强调的是，β-CD比其羟基化(OH-β-CD)或氨基化(NH-β-CD)衍生物更有效地与PVM/MA纳米颗粒缔合。
根据获得的结果，选择如下的试验条件用于随后的研究：
-环糊精∶PVM/MA共聚物的比例为1∶4；和
-孵育时间为30分钟。
实施例2
含有环糊精的纳米颗粒的制备
2.1含有环糊精的纳米颗粒的制备
通过修改先前描述的方法[Arbos et al.，J.Control.Release，83(2002)321-330]后的可控去溶剂化制备纳米颗粒。为了该目的，借助于超声(MicrosonTM或在冷却下在超声浴中1分钟)，将25mgβ-CD、OH-β-CD或NH-β-CD分散于2ml丙酮中。将该悬浮液添加至100mg甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物[AN 119]在3ml丙酮中的溶液中，并将混合物孵育30分钟。然后，在磁力搅拌下，向该相中添加10ml乙醇和10ml去离子水。将所得混合物均匀化5分钟。然后减压蒸发纳米颗粒悬浮液(Büchi R-144，Switzerland)直至除去这两种有机溶剂并用水将最终体积调节至10ml。然后通过超速离心纯化悬浮液(27,000×g，20分钟)(Sigma 3k30，rotor No.-12150，Germany)。除去上清液，并将残余物重悬浮于水或5％蔗糖水溶液中。可能地，将部分获得的纳米颗粒冷冻于-80℃，用于其随后的冻干和长期保存(Virtis Genesis，New York，United States)。
2.2获得的不同的基于PVM/MA的、含有环糊精的纳米颗粒的物理化学表征
物理化学特征的测定允许证实纳米颗粒如何具有与使用的CD无关的、类似的大小和表面电荷。而且，该电荷类似于未处理的纳米颗粒的电荷，因此，能认为大部分的CD位于纳米颗粒内部，而不吸附于其表面。表2概括了所分析的纳米颗粒的主要物理化学特征。
表2
基于PVM/MA的、含有环糊精的不同纳米颗粒制剂的物理化学特征
  制剂  大小(nm)  ζ电势(mV)  收率(％)  缔合的CD  (μg/mg)  缔合效率(％)  NP  179±2  -48.1±0.8  91.3±3.1  -  -  β-CD-NP  144±6  -51.1±8.8  94.4±5.3  88.4±9.9  30.2±7.8  OH-CD-NP  140±7  -52.1±3.7  91.1±4.1  68.4±4.3  22.8±4.7  NH-CD-NP  151±7  -49.3±2.4  86.2±3.9  71.2±8.4  25.4±5.4
数据示出平均值±标准偏差(SD)(n＝12)。试验条件：PVM/MA：100mg；环糊精：25mg；孵育时间：30min。数据示出平均值±标准偏差(SD)(n＝12)。NP：基于PVM/MA的、不含有环糊精的纳米颗粒。
从表2中可见，与使用的环糊精无关，纳米颗粒具有类似的大小和表面电荷。而且，该电荷类似于未处理的纳米颗粒的电荷，因此，能认为大部分的CD位于纳米颗粒内部，而不吸附于其表面。环糊精与基于PVM/MA的纳米颗粒之间的缔合允许获得大小小于常规纳米颗粒(NP)的纳米颗粒。如表2所示，基于PVM/MA的、含有环糊精的纳米颗粒所显示的大小接近150nm。这种大小的减少能与制备纳米颗粒的方法的高收率有关。通过在过程的末尾和在其冻干后测定其重量获得这些收率。制备收率被表示为百分数，其相对于PVM/MA共聚物和环糊精的初始质量来计算。
与纳米颗粒缔合的环糊精的量根据使用的低聚糖的类型而变化，对于β-CD为约90μg/mg，并且对于OH-β-CD和NH-β-CD为70μg/mg。在对不同制剂进行元素分析后，对与基于PVM/MA的纳米颗粒缔合的CD的存在进行证实。由于与对照纳米颗粒(NP)相比，含有缔合的CD的制剂中氧比例的重要升高以及碳百分比的降低，获得的结果(表3)证实存在缔合的CD。
表3
对照(NP)制剂和基于PVM/MA的、与CD缔合的纳米颗粒制剂的元素分析的结果
  制剂  C  (％)  H  (％)  O  (％)  N  (％)  NP  52.52  5.09  42.46  -0.07  β-CD-NP  42.37  5.94  51.61  0.08  OH-β-CD-NP  41.27  5.92  52.84  -0.04  NH-β-CD-NP  43.12  5.78  51.17  -0.07
NP：基于PVM/MA的、不含有CD的对照纳米颗粒(空)；β-CD-NP：基于PVM/MA的、含有β-CD的纳米颗粒；OH-β-CD-NP：基于PVM/MA的、含有OH-β-CD的纳米颗粒；NH-β-CD-NP：基于PVM/MA的、含有NH-β-CD的纳米颗粒。
通过扫描电子显微法(Zeiss，Germany)观察纳米颗粒的形态学，其后观察到均匀的、大小为80nm至200nm的、纳米颗粒通常的球形形状。图2示出将基于PVM/MA的、含有β-CD的纳米颗粒(β-CD-NP)的冻干样品进行扫描电子显微的结果。
实施例3
含有环糊精和RBITC的纳米颗粒的制备
通过修改先前描述的方法[Arbos et al.，J.Control.Release，83(2002)321-330]后的可控去溶剂化制备纳米颗粒。为了该目的，借助于超声(MicrosonTM或在冷却下在超声浴中1分钟)，将25mgβ-CD、OH-β-CD或NH-β-CD分散于2ml丙酮中。将该悬浮液添加至100mg甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物[AN 119]在3ml丙酮中的溶液中，并将混合物孵育30分钟。然后，在磁力搅拌下，向该相中添加10ml乙醇和10ml去离子水。将所得混合物均匀化5分钟。然后减压蒸发纳米颗粒悬浮液(Büchi R-144，Switzerland)直至除去这两种有机溶剂并用水将最终体积调节至10ml。然后向纳米颗粒添加罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)的水溶液，并将其在磁力搅拌下于室温孵育5分钟。然后通过超速离心纯化悬浮液(27,000×g，20分钟)(Sigma 3k30，rotor No.-12150，Germany)。除去上清液，并将残余物重悬浮于水或5％蔗糖水溶液中。可能地，将部分获得的纳米颗粒冷冻于-80℃用于其随后的冻干和长期保存(Virtis Genesis，New York，UnitedStates)。
将一定量的纳米颗粒在0.1N NaOH中完全水解(24h，37℃)，将RBITC的量估计为初始添加的量和与完全水解后发现的量的差。表4示出对于不同的被分析制剂的RBITC的值(μg RBITC/mg纳米颗粒)。
表4
与纳米颗粒缔合的RBITC(μg/mg)
  制剂  大小(nm)  RBITC(μg/mg)  NP  179±2  10.9±0.3  β-CD-NP  144±6  13.3±2.1  OH-β-CD-NP  140±7  12.4±1.3  NH-β-CD-NP  151±7  11.8±0.7
数据示出平均值±标准偏差(n＝8)。试验条件：PVM/MA：100mg；环糊精：25mg；孵育时间：30min。NP：基于PVM/MA的、不含有CD的对照纳米颗粒(空)；β-CD-NP：基于PVM/MA的、含有β-CD的纳米颗粒；OH-β-CD-NP：基于PVM/MA的、含有OH-β-CD的纳米颗粒；NH-β-CD-NP：基于PVM/MA的、含有NH-β-CD的纳米颗粒。
图3示出37±1℃下，在模拟的胃介质(0h至1h)和模拟的肠介质(1h至24h)中，RBITC从纳米颗粒中释放的动力学。在所有的情况下，证实了孵育24小时后释放的RBITC的百分比总是小于与纳米颗粒缔合的量的10％。因此，能假定在随后的生物粘附研究以及荧光显微法中获得的结果中，荧光强度对应于与纳米颗粒缔合的RBITC。
实施例4
含有环糊精的纳米颗粒在大鼠胃肠道中的生物粘附特征的评价
图4示出被分析的制剂的生物粘附谱，其表示根据前述的方法学，口服给药后30分钟、1h、3h和8h粘附于不同的胃肠道部分(胃、小肠：I1-I4、盲肠)的纳米颗粒部分。在所述图中能观察到，与环糊精缔合的纳米颗粒显示与对照纳米颗粒不同的生物粘附谱。在最近的工作中，证明了PVM/MA共聚物当被并入纳米颗粒中时，比以简单水溶液形式给药时的生物粘附潜力高得多(Arbos et al.，J.Control.Release，89(2003)19-30)。该事实与以前提出纳米颗粒的形状将促进与粘膜成分的初始接触和粘附相互作用的工作是一致的。
给药30分钟后，所有被分析的制剂都显示在胃和空肠(图4中的I2部分)中的生物粘附最大值。在任何情况下，似乎都观察到了与缔合了OH-β-CD的纳米颗粒的更强的相互作用。因此，给药后30分钟，能够说明制剂给药剂量的约12％-20％粘附至胃并且约14％-22％粘附至小肠。所述值与对于不含有CD的常规纳米颗粒(基于PVM/MA)所发现的值明显不同，其中不到10％和不超过12％的给药剂量分别粘附至胃和小肠。
给药1小时后，能观察到含有粘附至胃肠粘膜的环糊精的纳米颗粒部分如何减少并转移至道的末梢部分。在任何情况下，能观察到所述分布是均匀的并且没有任何制剂对胃肠道的任何区域显示出特异性。
为了比较不同制剂的粘附潜力，研究了生物粘附的动力学和曲线。为了该目的，将粘附的纳米颗粒部分相对于时间作图，从而获得生物粘附曲线。这些曲线示于图5。基于后者，并使用WinNonlin 1.5计算机应用(Pharsight Corporation，United States)，测定了如下的动力学生物粘附参数：Qmax、AUCadh、Tmax、MRTadh和Kadh(Arbos et al.，J.Control.Release，89(2003)19-30)。表5示出这些参数。
表5
不同纳米颗粒制剂的生物粘附参数
  Qmax(mg)  AUCadh(mg.h)  Kadh(h-1)  MRT(h) OH-β-CD-NP  3.5±0.5**  18.16±4.47*  0.098±0.084**  3.4±0.41*
  β-CD-NP  2.3±0.3  13.86±1.03  0.077±0.029**  3.5±0.10*  NP  2.1±0.2  10.49±2.10  0.292±0.03  2.7±0.23
结果示出平均值±标准偏差(n＝3)。*p＜0.05 OH-β-CD-NP和β-CD-NP vs.NP。**p＜0.01 OH-β-CD-NP和β-CD-NP vs.NP。Qmax(mg)：粘附至粘膜的纳米颗粒的最大量。AUCadh(mg.h)：生物粘附曲线下面积。Kadh(h-1)：粘附部分的消除速率。MRTadh(h)：粘附的纳米颗粒部分的平均停留时间。OH-β-CD-NP：基于PVM/MA的、含有OH-β-CD的纳米颗粒。β-CD-NP：基于PVM/MA的、含有OH-β-CD的纳米颗粒。NP：基于PVM/MA的、不含有CD的对照纳米颗粒(空)。
能观察到，缔合了OH-β-CD的纳米颗粒的特征是，AUCadh(测量生物粘附相互作用强度的参数)比对照纳米颗粒(NP)观察到的AUCadh大1.5倍。同样地，与环糊精缔合的制剂的粘附部分表现出明显低于对照NP的消除速率(Kadh)和约3.5小时的平均停留时间(MRTadh)。这些结果允许假定环糊精(尤其是OH-CD)的存在能促进与胃肠粘膜的相互作用并发展比NP强的与粘膜成分的粘附相互作用。
实施例5
对胃肠粘膜中含有环糊精的纳米颗粒的观察
通过荧光显微法观察与环糊精缔合的纳米颗粒在胃肠粘膜中的分布。为了该目的，向实验室动物给予用RBITC标记的不用制剂。给药2小时后，处死动物并检查小肠的不同部分。图6示出允许观察纳米颗粒在回肠样品中分布的某些照片。
根据体内生物粘附研究，与羟丙基-β-环糊精缔合的纳米颗粒具有比对照纳米颗粒更强的建立与粘膜的生物粘附相互作用的能力。常规的纳米颗粒不能到达肠细胞，尽管其能渗透沿粘膜排列的粘液层。相反地，与环糊精缔合的纳米颗粒粘附至小肠的肠细胞。
实施例6
含有包含紫杉醇的环糊精的纳米颗粒
制备含有包含紫杉醇的环糊精的纳米颗粒的方法分成两个不同的步骤：
1)紫杉醇-环糊精复合体的制备，其包括形成的复合体的形成和纯化；和
2)含有紫杉醇-环糊精复合体的纳米颗粒的制备。
紫杉醇-环糊精复合体的制备
为了该目的，制备环糊精(β-CD、OH-β-CD或NH-β-CD)的水溶液，将该溶液以80∶20(v∶v)的比率以及1∶1的药物∶环糊精的摩尔比添加到紫杉醇(PTX)药物的乙醇溶液中。将混合物在黑暗中于室温下保持磁力搅拌(300rpm)直至达到平衡(至少72小时)。然后减压蒸发除去乙醇并过滤(0.45μm)悬浮液以除去未溶解的药物晶体。最后，通过减压蒸发从最终水溶液中完全除去水，而紫杉醇-环糊精复合体保留下来，其外观为白色粉末。
包含紫杉醇-环糊精复合体的纳米颗粒的制备
通过修改先前描述的方法(Arbos et al.，上文所述)后的可控去溶剂化获得纳米颗粒。为了该目的，将一定量的先前在紫杉醇和环糊精(β-CD、OH-β-CD或NH-β-CD)之间形成的复合体分散于2ml丙酮中。将该悬浮液添加至100mg甲基乙烯基醚与马来酸酐(PVM/MA)的共聚物[AN 119]在3ml丙酮中的溶液，并将该混合物孵育30分钟。然后，在磁力搅拌下，向该相中添加10ml乙醇和10ml去离子水。将所得混合物均匀化5分钟。然后减压蒸发纳米颗粒悬浮液(BüchiR-144，Switzerland)直至除去这两种有机溶剂并用水将最终体积调节至10ml。然后通过超速离心纯化悬浮液(27,000×g，20分钟)(Sigma3k30，rotor No.-12150，Germany)。除去上清液，并将残余物重悬浮于水或5％蔗糖水溶液中。将部分获得的纳米颗粒冷冻于-80℃用于其随后的冻干和长期保存(Virtis Genesis，New York，United States)。
对将紫杉醇-环糊精复合体封装于纳米颗粒中的方法的优化
图7示出根据使用的环糊精的量和类型，含有环糊精和PTX的纳米颗粒中PTX含量的变化。首先必须强调的是，PTX自身，即没有与CD形成复合体，不能被包含在纳米颗粒中，从而在通过过滤纯化纳米颗粒的过程中被清除。因此，必须形成紫杉醇-环糊精(PTX-CD)复合体。对于使用的不同环糊精，观察到当PTX与OH-β-CD形成复合体时，如何获得最佳的封装效率，其次是NH-β-CD和没有取代的β-CD。
同样地，还分析了不同量的一直与相应的环糊精保持1∶1的摩尔比的PTX(5mg、7.5mg、10mg和25mg)，并观察到对于高于10mg量的PTX[PTX∶PVM/MA(1∶10)]，没有获得较大量的被封装的药物，因此，观察到NP中PTX-CD复合体的封装效率的下降。这些分析后，确定在分析条件下，包含于不同制剂中PTX的最优量是10mg，从而获得最佳的收率。表7示出根据用于形成复合体的不同环糊精初始添加10mg时，被封装的PTX的量。
表7
根据使用的环糊精的类型，与不同纳米颗粒制剂缔合的PTX的量(添加的紫杉醇的初始量：10mg)
  制剂  大小(nm)  PTX(μg/mg)  PTX-NP  204±4  0.29±0.13  PTX-β-CD-NP  298±6  40.5±5.12  PTX-OH-β-CD-NP  307±7  171.01±13.41  PTX-NH-β-CD-NP  310±6  99.26±10.13
结果示出平均值±标准偏差(n＝6)。PTX-NP：含有紫杉醇的常规PVM/MA纳米颗粒；PTX-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和β-CD纳米颗粒；PTX-OH-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和OH-β-CD纳米颗粒；以及PTX-NH-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和NH-β-CD纳米颗粒。
实施例7
口服给予不同紫杉醇制剂后的药代动力学研究
紫杉醇是药物，其特征是具有剂量依赖的药代动力学谱。因此，对于其在纳米颗粒中的制剂，需要事先测定商业紫杉醇制剂在以选择的剂量(10mg/kg)口服或静脉内给药后的药代动力学谱。
根据纳瓦拉大学伦理学委员会的规章以及试验动物欧洲法规(86/609/EU)，进行药代动力学。为了该目的，在给予制剂前12小时，将平均体重为225g的雄性Wistar大鼠(Harlan，Spain)隔离于代谢笼中，不让其进食，但是允许其随意饮水。
表8
药代动力学研究中使用的含有紫杉醇-环糊精复合体的不同制剂的药代动力学特征
  制剂  大小(nm)  PDI  ζ电势(mV)  收率(％)  PTX(μg/mg)  PTX-NP  204±4  0.07  -38.3±2.1  51.2±6.6  0.29±0.13  PTX-β-CD-NP  298±6  0.21  -39.3±5.2  63.3±2.9  40.5±5.12  PTX-OH-β-CD-NP  307±7  0.24  -42.1±1.4  68.6±4.4  171.01±13.41  PTX-NH-β-CD-NP  310±6  0.18  -34.5±3.9  59.5±4.6  99.26±10.13
结果示出平均值±标准偏差(n＝8)。PTX-NP：含有紫杉醇的常规PVM/MA纳米颗粒；PTX-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和β-CD纳米颗粒；PTX-OH-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和OH-β-CD纳米颗粒；以及TX-NH-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和NH-β-CD纳米颗粒。
表8概括了药代动力学研究中所分析的纳米颗粒的主要物理化学特征。对照纳米颗粒(PTX-NP)的大小接近200nm，其负表面电荷是-38mV。另外，含有被封装的PTX-CD复合体的纳米颗粒明显更大(接近300nm)并在所有的情况下表现出类似的ζ电势。最后，应该强调的是，PTX-CD复合体的存在对纳米颗粒的制备收率不施加任何影响，该收率在50％至60％之间变化。
药代动力学研究分为三个阶段。在第一研究中，将10mg商业紫杉醇制剂向两组雄性Wistar大鼠(n＝6)静脉内(i.v.)和口服给药。第二研究包括向由6只动物形成的大鼠组口服给予紫杉醇(10mg/kg)与(i)β-CD、(ii)OH-β-CD或(iii)NH-β-CD的溶液。最后，为了进行不同制剂的药代动力学研究，向不同组的动物口服给予纳米颗粒(i)PTX-OH-β-CD-NP、(ii)PTX-β-CD-NP、(iii)PTX-NH-β-CD-NP或(iv)PTX-NP的不同制剂。所选的紫杉醇剂量是10mg/kg。
给药后，使用乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂，在不同的时间(0分钟、10分钟、30分钟、60分钟、90分钟、180分钟、360分钟、480分钟、24小时和30小时)提取约300μl体积的血液，并用等体积的生理盐水通过腹膜内(i.p.)途径恢复动物(大鼠)的血液体积。使用WiNNonlin 1.5药代动力学调节程序(Pharsight Corporation，MountainView，United States)的非房室调节方法对紫杉醇给药后获得的结果进行药代动力学分析。
图8示出获得的结果。能观察到，常规制剂(商业紫杉醇)的i.v.给药在第一次取样中显示血浆浓度的峰值，然后显示随时间的两相下降。所述谱类似于其它作者描述的谱(Yeh et al.，Pharm Res 22(6)：867-74，2005)。当所述商业制剂被口服给药时(图8B)，紫杉醇的血浆浓度是零。当给予PTX:CD复合体时获得了类似的结果，它们均不能检测或定量紫杉醇随时间的显著水平。相反地，当含有环糊精和紫杉醇的纳米颗粒中的紫杉醇制剂被口服给药时，能证明这些制剂引起至少24小时的随时间的持续血浆水平。在所述纳米颗粒给药后4小时至高达24小时的时间段内，对于三种制剂能观察到以0级动力学释放药物的制剂通常的血浆浓度平稳状态。在任何情况下，PTX-β-CD-NP和PTX-OH-β-CD-NP制剂允许获得比PTX-NH-β-CD-NP制剂获得的血浆水平高得多的血浆水平(3-4倍)。而且，应当有趣地强调，常规纳米颗粒中紫杉醇的给药不允许吸收药物。
表9示出对给予不同的纳米颗粒紫杉醇制剂后获得的试验数据进行非房室分析后获得的药代动力学参数的值。从所述表中能观察到，根据制剂中使用的环糊精的类型，AUC和MRT的值变化非常明显。在口服PTX-OH-β-CD-NP和PTX-β-CD-NP制剂的情况下，获得了类似的AUC值。在这两种口服制剂(PTX-OH-β-CD-NP和PTX-β-CD-NP)中，分别在6小时和5小时的时间段内达到的最大浓度明显高于其余制剂中达到的最大浓度。对于三种含有环糊精的制剂，药物在有机体中的平均停留时间(MRT)类似。这些值比口服给予商业制剂后达到的值高3至5倍。
同样地，对于含有环糊精和紫杉醇的纳米颗粒的制剂，药物在末期的清除半衰期(T1/2z)类似，并且，在任何情况下，其小于静脉内给予商业制剂所获得的清除半衰期。
表9
被分析的不同制剂的药代动力学参数

*p＜0.05 PTX-OH-β-CD-NP、PTX-β-CD-NP和PTX-NHβ-CD-NP vs.商业制剂Mann Whitney U测试。
AUC0-inf：血浆水平曲线下面积；Cmax：最大浓度；Tmax：达到Cmax的时间；MRT：平均停留时间；T1/2z：末端清除期的生物学半衰期
Cl/F：清除率(Cl＝剂量×生物利用度/AUC)；Vss：稳态分布容积(Vss＝剂量×AUMC/AUC2)。相对于每一制剂的口服生物利用度值对清除率和分布容积的值进行标准化。
PTX-OH-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和OH-β-CD纳米颗粒；PTX-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和β-CD纳米颗粒；PTX-NH-β-CD-NP：含有紫杉醇的PVM/MA和NH-β-CD纳米颗粒；以及PTX-NP：含有紫杉醇的常规PVM/MA纳米颗粒。