Α－布黎烯,其制法及用途.pdf

摘要
申请专利号：	CN200610136194.3	申请日：	2006.10.13
公开号：	CN1955151A	公开日：	2007.05.02
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回\|\|\|公开
IPC分类号：	C07C13/47(2006.01); C07C7/04(2006.01); A61K31/015(2006.01); A61K36/53(2006.01); A61P7/02(2006.01); A61P29/00(2006.01)	主分类号：	C07C13/47
申请人：	扬生生化科技股份有限公司;
发明人：	许惠惇; 杨文嘉; 蔡英杰
地址：	中国台湾台北市
优先权：	2005.10.14 US 11/249,475
专利代理机构：	中原信达知识产权代理有限责任公司	代理人：	杨青;樊卫民
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内容摘要

本发明揭示一种α－布黎烯(α－Bulnesene)，是从广藿香(Pogostemoncablin)植物精油中分离所得。从广藿香的气生部分(aerial parts)蒸馏所得的精油中，分离获得α－布黎烯。本发明的α－布黎烯可以抑制血小板活化因子(PAF)或花生四烯酸(AA)引发的血小板凝集。本发明并揭示使用α－布黎烯作为抗发炎药物。本发明α－布黎烯的化学式如上，其中，R1，R2及R3为H，C1－C4的烷基或异丙基。

权利要求书

1.  一种α-布黎烯，其化学式如下：

其中，R1，R2及R3为H，C1-C4的烷基或异丙基。

2.  1β，4-二甲基-7β-异丙烯-1，2，3，5，6，7，8，8aα-八氢薁。

3.  一种化合物，其光谱特性包括：MS：m/z 316(M⁺75)，180(60)，167(100)，150(37)，137(71)；IR光谱：γ_max KBr(cm^-1)3417，1645，1575，1519，1269，1158；λmax 3.50，5.76μ；NMR光谱：两条宽单谱线在τ5.36-5.62(2H，环外亚甲基)及两条窄单谱线在τ8.37。

4.  一种α-布黎烯的制备方法，包括下列步骤：
从包括广藿香的植物中萃取出精油；
以色谱分析区分该精油的为多个馏分；
由该各馏分中挑选表现抑制血小板凝集作用的馏分；
细分该挑选出之馏分成为小馏分；
由该各小馏分中挑选表现显著之抑制血小板凝集作用之小馏分；及
由所得的小馏分中分离α-布黎烯。

5.  如权利要求4所示的方法，其中该血小板凝集包括PAF诱导的血小板凝集。

6.  如权利要求4所示的方法，其中该血小板凝集包括花生四烯酸诱导的血小板凝集。

7.  如权利要求4所示的方法，其中该α-布黎烯的化学式为：

其中，R1，R2及R3为H，C1-C4的烷基或异丙基。

8.  如权利要求7所示的方法，其中该α-布黎烯为1β，4-二甲基-7β-异丙烯-1，2，3，5，6，7，8，8aα-八氢薁。

9.  一种抗发炎药品，其有效成分包括α-布黎烯。

10.  如权利要求9所示的抗发炎药品，其中该α-布黎烯的化学式如下：

其中，R1，R2及R3为H，C1-C4的烷基或异丙基。

11.  如权利要求9所示的抗发炎药品，其中该α-布黎烯为1β，4-二甲基-7β-异丙烯-1，2，3，5，6，7，8，8aα-八氢薁。

12.  一种制备抗发炎药品的方法，包括下列步骤：
从包括广藿香的植物中萃取出精油；
以色谱分析区分该精油为多个馏分；
由该各馏分中挑选表现抑制血小板凝集作用的馏分；
细分该挑选出的馏分成为小馏分；
由该各小馏分中挑选表现显著的抑制血小板凝集作用的小馏分；
由所得的小馏分中分离α-布黎烯；及
制备含该α-布黎烯为有效成分的抗发炎药品组成物。

13.  如权利要求12所示的方法，其中该血小板凝集包括PAF诱导的血小板凝集。

14.  如权利要求12所示的用途，其中该血小板凝集包括花生四烯酸诱导的血小板凝集。

说明书

α-布黎烯，其制法及用途
技术领域
本发明是关于一种α-布黎烯(α-Bulnesene)，其制法及用途，特别是由广藿香精油中所制得的α-布黎烯，及其作为抗发炎(anti-inflammation)药物，特别是抗血小板活化因子(anti-PAF)药物的用途。
背景技术
血小板凝集在血栓形成和止血中扮演重要角色。在血管发生损害时，血小板最开始的反应是不可逆的附着到血管受损的表面，接着并激化血小板。这些现象主要是由某些激动剂(agonists)的作用而发生，例如血小板活化因子(platelet-activating factor-PAF)、花生四烯酸(arachidonic acid-AA)等等。当血小板被这些凝集激动剂活化时，将产生形状改变，分泌作用(secretary process)，最后在其表面表现血纤维蛋白原质受体。血纤维蛋白原黏附到其特定受体组合与糖蛋白(glycoprotein-GP)IIb/IIIa复合体，则是血小板栓形成的必要条件。然而，许多证据显示血小板也是急性冠状动脉疾病、心肌梗塞和血栓引发中风的重要原因，这些疾病在已开发国家中已成为主要死因。
血小板的活化可藉由减弱或避免激动剂引发反应的方式加以反制。抗血小板药剂可透过某些机制抑制血小板的活性。例如阿司匹林(asperin)就是一种非特异性(nonspecific)环氧合酶抑制剂(cyclooxygenase inhibitor)，可抑制血栓烷(thromboxane A₂-TXA₂)的产生，在临床上已证明对血栓栓塞(thromboembotic)疾病的治疗有其效果。然而，当前的抗血小板药物在其活动和功效的模式上仍然相当多的限制。对血小板作用更深入到分子层次的理解，将有助于研发新颖的抗血小板药物。
广藿香(Pogostemon cablin(唇形花科))是P.cabin Bentham的气生部份，在中国传统医学中用来作为治疗一般感冒和杀真菌剂。这种植物对于香料工业是重要的，广泛地种植在印尼、马来西亚、中国和巴西，以获取其精油(广藿香油)。研究人员已经针对广藿香的水萃取物(water extract)和其精油的组成物进行研究，并从中发现几种单萜烯(monopenoids)及倍半萜烯(sesquiterpenoids)。除此之外，数种类黄酮(flavonoids)及生物碱(alkaloids)也已经从广藿香分离且识别出来。虽然广藿香的化学成份已有频繁的研究，但是并没有关于从广藿香的精油中抽取具生物活性的化合物的报导。
根据生物活性分馏植物的萃取物时常用来发现植物所含的活性化合物。各式各样的植物精油在传统上及在实验都证明有生物活性。许多研究并尝试识别主要的活性化合物。最近的研究显示，倍半萜烯可能抑制化学突变原(mutagens)所引致的诱变作用(mutagenesis)。另外，也发现许多种的药物学活动，例如，抗致癌物(anticarcinogenic)活动和抗氧化(antioxdative)活动。然而，利用倍半萜烯抑制PAF引发的血小板凝集，此前并无报导。
台湾专利申请案第94122377号(美国专利申请案第10/880,651号)揭示一种包含广藿香精油的草药组成物，作为抑制或预防过敏症状的用途。该组成物包括：藿香(Houxiang berba)的精油、羌活(Qianghuoherba)的精油及辛夷(Xinyi herba)的精油。根据该发明，该组成物确具抗过敏效果。然而，组合物的有效化学成分尚未揭露。
发明内容
本发明的目的在于从草药的精油中分离有效的化学成份，以抑制和预防过敏症状。
本发明的另一目的乃在提供一种由草药精油分离的新颖抗发炎药物。
本发明的另一目的也在提供一种新颖的抗过敏药物的制备方法。
本发明的另一目的也在提供一种新颖的、可减少副作用的抗过敏药物。
本发明的另一目的也在提供一种新颖的化合物，用来抑制过敏激动剂，如血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸(AA)。
本发明揭示一种从广藿香精油中分离的α-布黎烯。本发明的α-布黎烯化学式为：

其中，R1，R2及R3为H，C1-C4的烷基或异丙基。
根据本发明，首先制备广藿香精油，接着分离出其主要成分。分离出来的成分进一步分离，获得α-布黎烯组成物。所得到的α-希黎烯表现明显的效果，可抑制由血小板活化因子(PAF)所引发的血小板凝集。PAF是由各种不同细胞所产生的炎症性磷脂介质(inflammatoryphospholipids mediator)，可引发过敏疾病、发炎、气喘、鼻炎、休克及心血管疾病。藉由上述方法获得抗过敏化合物。
上述及其它本发明的目的及优点，可由以下详细说明并参照图式而更形清楚。
附图说明
第1图显示由火焰电离探测器所得的广藿香精油气体色谱分析图。
第2图显示α-布黎烯对PAF(5nM)和AA诱导的血小板聚集(100μM)的抑制作用。
第3图显示α-布黎烯在PAF受体结合的竞争下的抑制作用。
第4图显示α-布黎烯对PAF诱导的Ca²⁺移动的作用示意图，其中第4a图显示含Fluo-3血小板以异丙醇(0.5％)预处理的案例，第4b图显示加入α-布黎烯(50μM)后的案例。第4c图显示在不同的α-布黎烯浓度下PAF诱导的Ca2+释放百分比。
表I显示广藿香精油1～4馏分及F3-1到F3-6小馏分抗PAF诱导的血小板凝集的抑制作用。
表II显示α-布黎烯在血小板中时，AA诱导的TXB₂的数量。
具体实施方式
概述
本发明揭示一种从广藿香精油中分离得到的抗过敏药物。该抗过敏药物确认为α-布黎烯，其化学式如下：

其中，R1，R2及R3为H，C1-C4的烷基或异丙基。
本发明的α-布黎烯表现明显的效果，可以抑制由血小板活化因子(PAF)引发的血小板凝集，且可能作为抗过敏药的有效成份。
使用传统的萃取技术取得广藿香精油，其方法包括蒸馏。利用传统的气体色谱分析仪(gas-chromatograph)与火焰电离探测器(flameionization detector)分析精油。控制炉温以分馏精油的主要成分。测试各馏分的抑制作用，以选出效果最显著的馏分，以进行进一步的分离。收集所有小馏分的产物，测试其抑制作用，将表现最优抑制作用的小馏分，进行纯化。以选择性四极(selective quadrupolar)型探测器纪录产物的质谱(mass spectra)。以电子碰撞获得离子化。依据各成分的光谱停留时间(retention time)及停留指数(retention index)辨识其成分。结果与已知的数据库(library)进行比对，以计算机寻找其配对。产物的分段图形(fragmentation pattern)与已知数据库或已知样本进行比对。
制备试样，并以商业上可取得的PAF拮抗剂(antagonist)作为正面参考化合物(positive control阳性对照组)。从纽西兰白兔的耳朵边缘动脉收集血液样本。处理样本血液，获得血小板含量丰富的血浆(PRP)与EDTA混合。以离心法从EDTA抗凝固的PRP获得血小板颗粒。血小板颗粒悬浮在Tyrode溶液培养。计算血小板数量。
血小板悬浮液与不同浓度的测试化合物溶剂一起搅拌。加入凝集诱导剂PAF以触发凝集。使用血小板凝集色层动力仪(plateletaggregation chromogenic kinetic system)，以透明度定义凝集作用。将含Ca²⁺-的Tyrode溶液最初的透明度(transmittance)定为0％凝集，并将血小板悬浮液的透明度定为100％凝集。将IC₅₀值定义为抑制50％凝集的样本的浓度。计算各化合物的抑制百分比。
α-布黎烯的分离
取得商业上可得到的蒸馏藿香精油。将广藿香精油作色谱分析，将各馏分以血小板凝集试样监测，以纯化其活性主成分。第1图显示由火焰电离探测器所得的广藿香精油气体色谱分析图。如图所示，以GC-TCD分离并辨识该具抑制活性的化合物的色谱分析，是在Hewlett-Packard 5890气体色谱仪进行，该色谱仪装备一导热性探测器。炉温保持在50℃4分钟后，以6℃/分钟的速度升温到272℃，保持在272℃经过3分钟。获得四馏分F1(停留时间15-23分钟)，F2(24-29分钟)，F3(30-39分钟)和F4(40-50分钟)。其中，F3显示了抑制PAF诱导的血小板凝集的抑制作用。表I显示广藿香精油馏1～4个别对PAF诱导的血小板凝集的抑制作用。
表I

馏分编号 IC₅₀值(μg/ml) F1 F2 F3 小馏分F3-1 小馏分F3-2 小馏分F3-3 小馏分F3-4 小馏分F3-5 小馏分F3-6 F4 CV-3988 ＞100 ＞100 5.5±0.1 ＞100 ＞100 14.5±0.6 6.7±0.4 4.2±0.3 ＞100 ＞100 1.4±0.1

收集F3组成物。修改色谱分析法步骤，把F3分成更细分的小馏分。将炉温保持在50℃4分钟，然后以10℃/分钟的速度从50℃升温到170℃，维持10分钟，在以3℃/分钟的速度升温到272℃，保持在272℃共3分钟。
将F3进一步分馏，并且收集对6个小馏分，分别为F3-1(停留时间24-27分钟)，F3-2(27-28分钟)，F3-3(28-30分钟)，F3-4(30-31.5分钟)，F3-5(31.5-33分钟)，F3-6(33-38分钟)，均如第1图所示。小馏分F3-5显示了最强的抗PAF诱导的血小板凝集的抑制作用，如表I所示。表I显示广藿香精油1～4馏分及F3-1到F3-6小馏分抗PAF诱导的血小板凝集的抑制作用。
将F3-5的抑制活性化合物分离。从光谱资料及其物理特性，可确认产物为α-布黎烯，是一种由广藿香所存在的倍半萜烯环化酶patchoulol synthase(广藿香醇合成脢)所得的倍半萜烯产物，其化学式如下：

其中，R1，R2及R3为H，C1-C4的烷基或异丙基。
进一步分析化学产物，由MS、¹H，及¹³CNMR分光镜得知为1β，4-二甲基-7β-异丙烯-1，2，3，5，6，7，8，8aα-八氢薁[α-布黎烯]。该化合物为一种黄色液体且显示预期的光谱特性，如下：MS：m/z316(M⁺75)，180(60)，167(100)，150(37)，137(71)；IR光谱：γ_max KBr(cm^-1)3417，1645，1575，1519，1269，1158；λmax3.50，5.76μ；NMR光谱：两条宽单谱线在T5.36-5.62(2H，环外亚甲基(exocyclic methylene))，两条窄单谱线在T8.37(6H，二个甲基团附在双键)，均支持其具有α-布黎烯结构的认定。
α-布黎烯的抑制过敏作用
α-布黎烯溶解在异丙醇中。血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸(AA)、fluo-3/AM、indomethacin、乙二胺四乙酸(EDTA，二钠盐)及三氯乙酸(TCA)是由Sigma化学公司(美国密苏里州圣路易市)购得。Thromboxane B2和前列腺素E2酶免疫试剂是由CaymanChemical Co.(美国密西根州Ann Arbor市)购得。将特定放射值120Cimmol^-1的[³H]PAF1-O-[³H]octadecyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(PerkinElmer Science公司产品)溶解在纯乙醇，并立刻以含2.5毫克mL^-1牛血清蛋白(BSA)的食盐水稀释，备用。所有其它的化学药品均为可能的最高纯净等级。
血小板悬浮液的制备如下。从纽西兰白兔的耳朵边缘静脉收集血液。将血液以酸-柠檬酸盐-右旋葡萄糖抗凝剂(ACD，1∶6，v/v)处理，在室温下以1000×g离心8分钟。收集上层部分富含血小板的血浆(PRP)，与5mM最终浓度的EDTA混合。从PRP的EDTA组成物以2000×g离心12分钟后，获得血小板颗粒。血小板颗粒悬浮于无Ca²⁺的Tyrode溶液，在37℃下以apyrase(1单位mL^-1)培养15分钟。在2000×g下离心6分钟后，血小板颗粒最后悬浮在Tyrode’s溶剂与下列化合物的组成物中(单位mM)：氯化钠(137)、氯化钾(2.8)、氯化镁(2)、磷酸二氢钠(0.33)、氯化钙(1)、葡萄糖(5)及含HEPES(10)的BSA(0.35％)，pH7.3。调整血小板的浓度到2.5×10⁸个血小板/毫升。
α-布黎烯对血小板聚集的作用
利用改装的光穿透型PACK4血小板凝集色层动力仪量(美国德州Beaumont的Helena Laboratories)测混浊度，以定测定血小板凝集作用。在900rev min^-1下搅拌血小板悬浮液，在异丙醇(溶剂)或不同浓度的α-布黎烯中在37℃下培养2分钟。PAF(5nM)和AA(100μM)引发凝集。将Tyrode’s溶液的吸光度定为0％聚集。血小板悬浮的吸光度定为100％凝集。加入诱发剂后，量测4分钟内最高的光穿透度上升度，作为血小板凝集的程度。使用异丙醇为溶剂时，最终浓度定在0.5％(v/v)，以排除溶剂本身的影响。所有玻璃器皿为硅。
α-布黎烯的抑制作用在PAF和AA诱导的血小板凝集是明确的。第2图显示α-布黎烯对PAF(5nM)和AA诱导的血小板聚集(100μM)的抑制作用。PAF(5nM)和AA(100μM)两者都可引起清洗过的兔血小板大约70-80％的凝集。但如第2图所示，α-布黎烯(12.5-50μM)则明显抑制了PAF和AA诱导的血小板凝集，其效果因浓度而不同。其IC₅₀值各为24.47±2.45μM和42.47±5.97μM。反观CV-3988(单一的PAF受体拮抗剂)，虽可几乎完全抑制PAF诱导的血小板凝集，其IC₅₀值高达2.40±1.01μM。但并无法抑制AA诱导的血小板凝集。
α-布黎烯对血小板[³H]PAF结合的作用
[³H]PAF受体结合试样使用清洗过的兔血小板制备。反应组成物包含血小板悬浮液400μl，含或不含未标示(unlabeled)的PAF(1.5μM)的[³H]PAF(0.2nM，100,000dpm)50μl和50μl试验样本或对照溶液。反应组成物培养在4℃下2个小时，加入含BSA的食盐水5mL，以终止反应。使用Whtman GF/C玻璃纤维滤器分离无键结与有键结的配位体。滤器使用前先浸泡在冰水中。滤器以同一种溶液迅速地洗涤，烘干，并置入包含闪烁液体10mL的药水瓶。以液体闪烁计数器(BeckmanLS3801)测量其放射性。[³H]PAF键结的总放射量，在无超量未标记的PAF存在下，与有超量未标记的PAF存在下的差值，定为放射标记的配位体的特定结合度。在一批次实验中，[³H]PAF与不同浓度的PAF受体拮抗剂一起培养，以该拮抗剂对特异性结合的效果表示对照组的抑制作用百分比。IC₅₀值定义为抑制剂可阻止50％特定[³H]PAF结合到兔子血小板受体的最终浓度，如下：
抑制百分比(％)＝[100-(B/A×100)](％)
其中，A代表对照组累计百分比，B代表实验化合物的累计百分比。
0.2nM[³H]PAF在BSA(2.5mg mL^-1)存在下结合到兔子血小板(1.3×10⁸血小板mL^-1)的总量是09,131.17±4,534.02dpm(n＝6)，而非特异性的结合在1.5μM未标记的PAF存在下，总量是2,339.03±292.18。第3图显示α-布黎烯在PAF受体结合的竞争下的抑制作用。如第3图所示，α-布黎烯依其浓度不同，抑制[³H]PAF对兔子的血小板结合的效果也不同。α-布黎烯在[³H]PAF结合的IC₅₀值为17.62±5.68μM。反的，CV-3988(10μM)对[³H]PAF结合的抑制百分比为10.10±1.74％(n＝3)。
α-布黎烯对血小板的细胞内钙释放的作用
从PRP获得的血小板颗粒悬浮在无Ca²⁺-的Tyrode’s溶液中，在37℃以fluo-3/AM(2μM)培养30分钟。为了防止染料泄漏，实验中全程在缓冲液中加入二丙磺胺苯甲酸(2.5mM)。清洗后，含fluo-3血小板最后悬浮在无Ca²⁺-，无肝磷脂的Tyrode’s溶液，浓度1.3×10⁸个血小板mL^-1。
在加入PAF的前，含fluo-3的血小板与α-布黎烯在细胞外钙(extracellular calcium)(1mM)存在下，于37℃预培养2分钟。以萤光分光光度计(F4500型；日本东京日立公司)测量萤光度(Ex505nm，Em530nm)。在实验结束时，细胞分别以地芰皀宁(digitonin，20％)处理，再加入EGTA(50mM)，以分别获得最高和最低萤光度。以Ca²⁺染料分解常数(dye dissociation constant)864nM计算[Ca²⁺]_i作为fluo-3/AM的指针。
第4图显示α-布黎烯对PAF诱导的Ca²⁺移动的作用示意图，其中第4a图显示含Fluo-3血小板以异丙醇(0.5％)预处理的案例，第4b图显示加入α-布黎烯(50μM)后的案例。第4c图显示在不同的α-布黎烯浓度下PAF诱导的Ca2+释放百分比。如图所示，在含fluo-3血小板中，细胞内Ca²⁺浓度的静止水准是61.80±1.04nM。PAF(5nM)可诱发导致Ca²⁺浓度增加到167.01±5.17(第4a图)。α-布黎烯(2.5-50μM)则抑制了PAF诱导的细胞内Ca²⁺释放，效果因浓度而异，其IC₅₀值为19.62±1.32μM，如第4b图所示。
α-布黎烯对Thromboxane B₂和前列腺素E₂形成的作用
由于TXA₂非常不稳定且可能迅速转换成稳定的代谢产物TXB₂，在本实验系测量TXB₂的数量。在以AA(100μM)激发血小板6分钟后，加入1mM的EDTA及20μM的Indomethacin，以终止反应。在4℃以10,000×g离心5分钟，使用EIA试剂取得浮在表层的TXB₂和PGE₂，作为试样，其方式如制造商规定。
在加入AA后的第6分钟，测量Thromboxane B₂和前列腺素E₂在经洗清的兔血小板的形成量。表II显示α-布黎烯在血小板中时，AA诱导的TXB₂的数量。如表II所示，在兔血小板TXB₂量的静止水准是7.64±0.40ng mL^-1。AA(100μM)显著提高TXB₂形成量到568.51±42.63ng mL^-1。α-布黎烯(25-100μM)确可抑制AA诱导的TXB₂形成，其效果因浓度而异。Indomethacin(1μM)及呋格雷酸(furegrelate，300μM)分别选为阳性对照组，抑制百分比可达98.05±0.16％和6.49±0.78％。反的，在AA存在下仍会形称PGE₂。在兔血小板悬浮液中，无刺激作用下可形成PGE₂3.45±0.12ng mL^-1，加入AA可提高量达到20.31±0.57ng mL^-1。α-布黎烯(25-100μM)则可抑制PGE₂形成。PGE₂的形成可藉由Indomethacin抑制，但呋格雷酸(300μM)反而加以提高。
表II 组成物 PGE₂形成(ng/ml) Basal 对照组 Indomethacin(1μM) 呋格雷酸(300μM) α-布黎烯 25μM 37.5μM 50μM 100μM 3.45±0.12 20.31±0.57 7.60±0.32^** 31.65±0.65^** 18.74±1.42 15.47±0.81^** 12.36±0.54^** 9.57±0.14^**

发明的的有益效果
如上所述，本发明的α-布黎烯确能抑制PAF及花生四烯酸诱导的血小板凝集，IC₅₀值分别可达24.47±2.45μM及42.47±5.97μM。在细胞毒性(cytotoxicity)实验中，α-布黎烯(12.5-50μM)在兔血小板中并没有任何的毒性，甚至在30分钟后亦然(资料未显示)。表示α-布黎烯并非通过细胞毒性抑制血小板凝集。
综上所述，α-布黎烯为新颖的倍半萜烯，可用为PAF受体竞争性抑制剂。此外，α-布黎烯通过影响COX活动，也表现额外的抑制作用对外生的AA诱导的继发血小板凝集及TXA₂的形成。