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1、(10)申请公布号 CN 103126783 A (43)申请公布日 2013.06.05 CN 103126783 A *CN103126783A* (21)申请号 201310070758.8 (22)申请日 2013.03.06 A61D 19/02(2006.01) (71)申请人 成都大熊猫繁育研究基地 地址 610081 四川省成都市成华区外北熊猫 大道 1375 号 (72)发明人 侯蓉 张志和 蔡志刚 罗娌 刘玉良 王海瑞 黄河 (54) 发明名称 利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用 LH 结果优化大熊猫 适时人工授精方法， 其以雌。
2、性大熊猫雌二醇真实 峰值及其出现时刻为基础检测出了雌性大熊猫 LH 峰值及其出现时刻， 然后依据 LH 峰值时刻或 / 和雌二醇真实峰值时刻、 LH 峰值时刻与雌二醇真 实峰值时刻的时间间隔、 大熊猫是否出现发情高 峰行为等条件， 将正常排卵大熊猫个体安排在 LH 峰值时刻后的 14 小时 30 小时范围内进行初次 人工授精 , 将延迟排卵大熊猫个体安排在雌二醇 真实峰值时刻之后的 30 小时 36 小时内进行初 次人工授精， 68小时候后再进行第二次人工授 精， 最终大熊猫妊娠率由过去的 50.00% 提高到现 在的 66.67%， 达到自然交配 65.63% 产仔率水平， 将初次人工授精时。
3、间范围由 24 小时缩短到 16 小 时， 取得了重大技术进步。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103126783 A CN 103126783 A *CN103126783A* 1/1 页 2 1. 一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法， 包括以下步骤 ： （1） 春季繁育期间， 按时间要求对雌性大熊猫进行尿样收集， 然后对尿样采用酶联免疫 吸附试验检测出雌性大熊猫雌二醇真实峰值及其出现时间 ； （2） 以出现雌性大。
4、熊猫雌二醇真实峰值的时刻为时间起点 0 小时， 采用酶联免疫吸附 试验检测 0 小时到 48 小时内全部尿样的 LH 值， 找出 LH 峰值及其出现时间 ； （3） 依据 LH 峰值时刻或 / 和雌二醇真实峰值时刻、 LH 峰值时刻与雌二醇真实峰值时刻 的时间间隔、 雌性大熊猫是否出现发情高峰行为等条件共同确定初次人工授精时机。 2. 根据权利要求 1 所述的一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法， 其特征在 于 ： 当雌性大熊猫LH峰值时刻与雌二醇真实峰值时刻的时间间隔小于16小时、 且在雌二醇 真实峰值时刻后30小时以内雌性大熊猫出现发情高峰行为时， 在LH峰值时刻后的1430 小。
5、时内、 且雌性大熊猫出现发情高峰行为时进行初次人工授精。 3. 根据权利要求 1 所述的一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法， 其特征在 于 ： 当雌性大熊猫LH峰值时刻与雌二醇真实峰值时刻的时间间隔大于16小时、 且在雌二醇 真实峰值时刻后 30 小时以内雌性个体未出现发情高峰行为时， 在雌二醇真实峰值时刻后 的 30 36 小时内、 且雌性大熊猫出现发情高峰行为时进行初次人工授精。 4.根据权利要求13所述的任何一种利用LH结果优化大熊猫适时人工授精方法， 其 特征在于 ： 初次人工授精完成 6 8 小时后进行第二次人工授精。 5.根据权利要求13所述的任何一种利用LH结果优化大。
6、熊猫适时人工授精方法， 其 人工授精包括以下步骤 ： （1） 准备大熊猫精液 ； （2） 麻醉大熊猫， 大熊猫仰卧保定， 仔细清洗大熊猫阴门周围 ； （3） 将开殖器缓慢旋转插入大熊猫阴道， 借助手电筒或其它光源观察阴道内尿道开口 以及子宫颈开口 ； （4） 将大熊猫输精器缓慢插入大熊猫子宫颈口， 用注射器吸取精液， 连接到输精器上， 将精液缓慢注入子宫颈内 ； 取下注射器并注入少量空气， 借以排尽输精器内残余精液 ； （5） 解开大熊猫保定绳， 让大熊猫自然苏醒。 6.根据权利要求4所述的一种利用LH结果优化大熊猫适时人工授精方法， 其人工授精 包括以下步骤 ： （1） 准备大熊猫精液 ； 。
7、（2） 麻醉大熊猫， 大熊猫仰卧保定， 仔细清洗大熊猫阴门周围 ； （3） 将开殖器缓慢旋转插入大熊猫阴道， 借助手电筒或其它光源观察阴道内尿道开口 以及子宫颈开口 ； （4） 将大熊猫输精器缓慢插入大熊猫子宫颈口， 用注射器吸取精液， 连接到输精器上， 将精液缓慢注入子宫颈内 ； 取下注射器并注入少量空气， 借以排尽输精器内残余精液 ； （5） 解开大熊猫保定绳， 让大熊猫自然苏醒。 7. 根据权利要求 5 所述的一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法， 其特征在 于 ： LH 值采用犬促黄体生成激素试剂盒检测。 8. 根据权利要求 6 所述的一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授。
8、精方法， 其特征在 于 ： LH 值采用犬促黄体生成激素试剂盒检测。 权 利 要 求 书 CN 103126783 A 2 1/7 页 3 利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用于圈养动物适时人工授精的方法， 特别是涉及一种利用 LH 结 果优化大熊猫适时人工授精方法。 背景技术 0002 大熊猫是我国特有的珍稀濒危野生动物， 其自身繁殖能力偏低， 雌性大熊猫一年 只有一次发情期， 而一次发情期中只有 1 3 天接受自然交配， 其排卵时间可能只有一天， 并且圈养大熊猫自然交配比例偏低， 目前只有 50% 左右的大熊猫自然交配， 有一半左右的 大熊猫需要。
9、通过人工授精完成繁殖， 所以， 确定大熊猫适时适时配种时机是大熊猫繁育的 关键技术。 0003 目前所提出的大熊猫适时繁殖或人工授精观点全部基于雌激素 E2峰值， 即雌激素 峰值出现时间来提出。申请人于 2012 年 07 月 02 日提出了申请号为 201210223931.9、 发 明名称为 大熊猫适时人工授精方法 ， 以大熊猫雌二醇真实峰值出现时刻为时间起点 0 小 时， 在之后的24小时48小时的范围内对大熊猫进行第一次人工授精， 第一次人工授精完 成68小时候后再进行第二次人工授精， 最终大熊猫妊娠率取得了显著提高， 与过去相比 大熊猫人工授精妊娠率由 20.41% 提高到 42.1。
10、1%、 翻了一倍多。 0004 但是， 由于大熊猫排卵还涉及促黄体生成激素等其他多个因素， 因此仅仅依据雌 激素峰值出现时间来判断适时配种时间是有缺陷的。 0005 促黄体生成激素是促性腺激素的一种， 简称为 LH， 它作用于成熟的卵胞， 能引起排 卵并生成黄体。目前关于大熊猫 LH 的研究鲜有报道。 0006 曾国庆、 蒋广泰、 杨克勤等 . 血清和尿液中促黄体素、 孕酮和 17- 雌二醇含量的 变化 . 动物学报 .1990.36(1):63-69， 对大熊猫 LH 进行了初步研究， LH 检测采用体外生物 测定法， 对 4 只次大熊猫血液以及尿液中 LH 含量及其变化进行了初步测定， 只。
11、是对发情期 尿液样品每天采集了一次， 而血液样品全部在人工授精麻醉动物时进行， 结果初步发现大 熊猫在发情高峰期出现 LH 峰值， LH 峰值出现在雌激素峰值后。 0007 林增云、 朱忠勇、 陈玉春 . 大熊猫发情排卵期尿中 LH、 E2内分泌的研究 . 成都 : 四 川科学技术出版社 .1991.66-70， 采用了不同的测定方法 （采用碘标人类促黄体生成激素 hLH 放射免疫测定法） 对 2 只次大熊猫 LH 进行了测定， 发情高峰期每天收集一份尿样， 结果 与曾国庆的结果有所差异， 大熊猫 E2和 LH 在发情高峰第二天或者第三天， 同步达到最大峰 值。 0008 李学兵、 黄祥明、 。
12、李光汉等 . 大熊猫发情期尿激素的 ELISA 测定与适时配种 . 成都 国际大熊猫保护学术研讨会论文集.成都 ： 四川科学技术出版社.1994:247-250,采用酶联 免疫测定法对 6 只 9 次大熊猫发情期尿液 LH 进行了检测， 每天采集一份晨尿， LH 测定试剂 盒采用美国Tetcan公司提供， 其结果与曾国庆的结果比较类似， 发现大熊猫尿LH峰值出现 在雌激素峰值稍后 （当日、 次日或第三日） 。 0009 B a r b a r a S . D u r r a n t , N i c o l e R a v i d a , T h o m a s S p a d y e t 说 。
13、明 书 CN 103126783 A 3 2/7 页 4 al.2006New technologies for the study of carnivore reproduction. Theriogenology,60:1729-1736, 首次采用商品化狗血清 LH 测定试剂盒， 采用快速免疫色 谱 LH 测定法 （rapid immunochromatographic LH assay） 对 4 只 9 次大熊猫尿液中 LH 含 量及其变化进行了定性检测， 发现尿 LH 阳性检测结果出现在雌激素峰值下降后 24 小时。 0010 综合上述研究结果， 相对比较一致的结果是 ： 若以雌激素。
14、峰值作为 0 天， 大熊猫 LH 出现在雌激素峰值后 0 3 日， 但其确切时间不同研究结果有所不同。 0011 上述大熊猫 LH 研究报道存在以下问题 ： 首先检测个体数量少 （2 6 只） ， 代表性 差， 其次采样频率低， 难以获得大熊猫LH的准确变化曲线， 由于通常LH峰持续时间较短， 如 果采样频率低会漏掉真实的 LH 峰， 而上述研究采样多数为每天 1 次， 而 Barbara 则是随机 采样 ； 其次， 研究方法上定量判断方法采用生物学测定法， 或者人的 LH 测定试剂进行放射 免疫或酶联免疫测定， 而定性测定则采用狗血液 LH 测定试剂盒， LH 是一种糖蛋白激素， LH 由 。
15、和 两个糖基化亚基以非共价键方式连接形成的异二聚体。有研究结果表明， 大熊 猫 LH 的 和 两个糖基化亚基同源性与狗更高， 而与人的相似程度较低。大熊猫 LH 的 亚基与狗在核苷酸以及氨基酸水平的同源性达到 95% 和 90%， 而与人的只有 84% 和 74%， 大熊猫 LH 的 亚基与狗在核苷酸以及氨基酸水平的同源性达到 92%， 而与人只有 84% 和 75%， 因此大熊猫LH与狗的同源性高于与人的同源性。 因此理论上讲， 如果利用其它物种LH 测定试剂盒检测大熊猫LH， 采用狗的优于人的。 但是目前采用狗LH测定试剂盒检测大熊猫 LH 仅仅只有定性检测研究而没有定量检测研究。 001。
16、2 王建辰 .动物生殖调控 . 合肥 ： 安徽科学技术出版社 .1998, 张嘉保 .动物繁 殖学 . 长春 ： 吉林科学技术出版社 .1999 ： 96, 发现 LH 排卵峰对于触发排卵起着关键性的 作用， 不同动物在血中出现LH与触发排卵的间隔时间不尽相同， 但是在同一种动物其LH峰 值时间与触发排卵的间隔时间几乎是一致的， 因此利用 LH 指标作为大熊猫适时配种指标， 用于优化大熊猫适时人工授精技术从理论上讲是可行的。 但是目前没有任何相关研究以及 应用报道。 发明内容 0013 本发明要解决的技术问题是一种如何利用 LH 峰值出现的时机、 如何在 LH 峰值或 雌二醇真实峰值出现之后进。
17、行高效人工授精的利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方 法。 0014 为解决上述技术问题， 本发明一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法， 包 括以下步骤 ： 0015 （1） 春季繁育期间， 依照专利申请号 201210191762.5 所述， 按时间要求对雌性大 熊猫进行尿样收集， 然后对尿样采用酶联免疫吸附试验检测出雌性大熊猫雌二醇真实峰值 及其出现时间， 绘制出雌性大熊猫雌二醇值和孕酮值的变化曲线图 ； 0016 （2） 以出现雌性大熊猫雌二醇真实峰值的时刻为时间起点 0 小时， 采用酶联免疫 吸附试验检测0小时到48小时内全部尿样的LH值 ； 将雌性大熊猫排尿时间作为横坐。
18、标， 将 LH 值作为纵坐标， 在雌性大熊猫雌二醇值和孕酮值的变化曲线图上标出排尿时间及其对应 的 LH 值所确定的坐标点， 将坐标点依次连接起来， 绘制出 LH 值变化曲线图， 找出 LH 峰值及 其出现时间 ； 所述 LH 峰值为雌二醇真实峰值时刻后的最大 LH 值 ； 说 明 书 CN 103126783 A 4 3/7 页 5 0017 （3） 依据 LH 峰值时刻或 / 和雌二醇真实峰值时刻、 LH 峰值时刻与雌二醇真实峰值 时刻的时间间隔、 雌性大熊猫是否出现发情高峰行为等条件共同确定初次人工授精时机 ； 所述雌性大熊猫发情高峰行为是指雌性大熊猫出现翘尾、 待配姿势、 压尾反射、 。
19、后退接近雄 兽等现象， 特别是待配姿势。 0018 所述的一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法， 当雌性大熊猫 LH 峰值时 刻与雌二醇真实峰值时刻的时间间隔小于 16 小时、 且在雌二醇真实峰值时刻后 30 小时以 内雌性大熊猫出现发情高峰行为， 此时可以确定雌性大熊猫为正常排卵个体 ； 因此在 LH 峰 值时刻后的 14 30 小时内、 且雌性大熊猫出现发情高峰行为时进行初次人工授精。 0019 所述的一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法， 当雌性大熊猫 LH 峰值时 刻与雌二醇真实峰值时刻的时间间隔大于 16 小时、 且在雌二醇真实峰值时刻后 30 小时以 内雌性个体。
20、未出现发情高峰行为， 此时可以确定雌性大熊猫为延迟排卵个体 ； 因此在雌二 醇真实峰值时刻后的 30 36 小时内、 且雌性大熊猫出现发情高峰行为时进行初次人工授 精。 0020 所述的任何一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法， 在初次人工授精完 成 6 8 小时后进行第二次人工授精。 0021 所述的任何一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法， 其人工授精包括以 下步骤 ： 0022 （1） 准备大熊猫精液 ； 0023 （2） 麻醉大熊猫， 大熊猫仰卧保定， 仔细清洗大熊猫阴门周围 ； 0024 （3） 将开殖器缓慢旋转插入大熊猫阴道， 借助手电筒或其它光源观察阴道内尿道。
21、 开口以及子宫颈开口 ； 0025 （4） 将大熊猫输精器缓慢插入大熊猫子宫颈口， 用注射器吸取精液， 连接到输精器 上， 将精液缓慢注入子宫颈内 ； 取下注射器并注入少量空气， 借以排尽输精器内残余精液 ； 0026 （5） 解开大熊猫保定绳， 让大熊猫自然苏醒。 0027 所述的任何一种利用 LH 结果优化大熊猫适时人工授精方法， 其 LH 值采用犬促黄 体生成激素试剂盒检测。 0028 在研究过程中， 以出现大熊猫雌二醇真实峰值的时刻为时间起点 0 小时， 采用酶 联免疫吸附试验检测 0 小时到 48 小时内的全部尿样 LH 值 ； 作出 LH 变化曲线， 以 LH 的最大 值作为 LH。
22、 峰值， 以出现 LH 峰值的尿样排泄时间作为大熊猫 LH 峰值时刻， 计算出大熊猫 LH 峰值时刻与雌二醇真实峰值时刻的时间间隔 ； 采用 SPSS 统计软件及描述性数据频率分析 方法分析了40只次大熊猫发情期尿LH峰值与雌二醇真实峰值的间隔时间 （h） ， 结果见下表 1 ： 0029 表 1. 大熊猫发情期尿 LH 峰值与雌二醇真实峰值间隔时间 （h） ： 说 明 书 CN 103126783 A 5 4/7 页 6 0030 0031 注 ： N 表示样本数 ； a 表示存在多个众数、 显示最小值。 0032 从表 1 可以看到， 大熊猫 LH 峰值与雌二醇真实峰值间隔时间变异范围较大。
23、， 从最 小的 0 小时到最大的 30.22 小时， 平均为 13.67 小时， 其中大多数 （60%） 的个体在 11.9 小 时到 15.72 小时即在约 12 16 小时之间。 0033 研究结果表明， 雌性大熊猫 LH 峰值时刻与雌激素峰值时刻间隔时间在不同个体 间差异很大， 在 0 30.22 小时之间， 而 LH 峰值时刻到排卵的时间间隔通常是确定的。研 究过程还首次发现， 相对于雌二醇真实峰值时刻， 有部分大熊猫个体存在延迟排卵现象。 由 于 60% 雌性大熊猫个体 LH 峰值到雌二醇真实峰值间隔时间在 16 小时以内， 因此可以依据 雌性大熊猫 LH 峰值时刻与雌二醇真实峰值时。
24、刻的时间间隔是否在 16 小时以内， 初步判断 雌性大熊猫是否正常或延迟排卵 ； 再结合在雌二醇真实峰值时刻后的 30 小时内雌性大熊 猫是否出现发情高峰行为， 进一步确定雌性大熊猫是否正常或延迟排卵。 0034 由于 LH 峰值的出现在雌激素峰值之后， 而大熊猫 LH 峰值出现时间与触发排卵的 间隔时间几乎是一致， 因此， 确定 LH 峰值及其出现时间对成功进行大熊猫人工授精尤为重 说 明 书 CN 103126783 A 6 5/7 页 7 要。 0035 若以 LH 峰值时刻作为参照， 可将初次人工授精时间分为早期人工授精组 （LH 峰值 时刻后的 0 14 小时） 和晚期人工授精组 （。
25、LH 峰值时刻后的 14 30 小时） ， 比较两者产仔 率差异， 结果见表 2 ： 0036 表 2. 相对于 LH 峰值时刻的人工授精时机对妊娠结果的影响 0037 配种时机产仔未产仔 总数产仔率 % 早期人工授精组0330 晚期人工授精组51683.33 合计54955.56 0038 采用卡方检验对早期与晚期人工授精组产仔率进行差异显著性检测， 从表 2 可以 看到， 早期人工授精组妊娠率显著低于晚期组， 概率 P=0.0480.05, 差异显著。基于上述结 果可将大熊猫适时人工授精时间优化为 ： 适宜的初次人工授精时机为雌激素真实峰值后、 并且在 LH 峰值时刻后的 14 30 小时。
26、内、 在大熊猫出现发情高峰行为时进行。 0039 2010 年 2011 年间成都大熊猫繁育研究基地采用本发明技术随机选择部分发情 大熊猫进行适时人工授精 （本发明组） ， 与20052010年度采用申请号为201210223931.9、 发明名称为 大熊猫适时人工授精方法 的技术 （常规组） 相比， 在排除健康及年龄对结果的 影响、 只统计其中健康与适龄 （6 19 岁） 个体的公平原则下， 其妊娠率结果见表 3 ： 0040 表 3. 采用本发明技术与常规人工授精技术产仔率比较 0041 人工授精分组妊娠数未妊娠数合计妊娠率 % 常规组771450.00 本发明组42666.67 合计11。
27、92055.00 0042 从表3可以看到， 采用本发明组技术对6只次健康适龄大熊猫进行人工授精， 产仔 率高达66.67%， 已经达到自然交配65.63%产仔率水平 （冯文和.张安居等.1997.不同配种 方式对大熊猫产仔效果的影响.四川大学学报.自然科学版.34:43-47.） ， 并高于常规组人 工授精技术， 比常规人工授精技术妊娠率提高了 16.67%。 0043 另外， 对于部分雌性大熊猫存在延迟排卵现象， 应实施延迟配种。 0044 由于本发明以雌性大熊猫雌二醇真实峰值及其出现时刻为基础准确地检测出了 雌性大熊猫LH峰值及其出现时刻， 然后依据LH峰值时刻或/和雌二醇真实峰值时刻、。
28、 LH峰 值时刻与雌二醇真实峰值时刻的时间间隔、 雌性大熊猫是否出现发情高峰行为等条件， 将 正常排卵雌性大熊猫个体安排在 LH 峰值时刻后的 14 小时 30 小时范围内进行初次人工 授精 , 将延迟排卵雌性大熊猫个体安排在雌二醇真实峰值时刻之后的 30 小时 36 小时内 说 明 书 CN 103126783 A 7 6/7 页 8 进行初次人工授精， 初次人工授精完成68小时候后再进行第二次人工授精， 最终大熊猫 妊娠率由过去的50.00%提高到现在的66.67%， 已经达到自然交配65.63%产仔率水平， 并将 适宜的初次人工授精时间范围由过去的 24 小时缩短到现在的 16 小时， 。
29、取得了重大技术进 步。 附图说明 0045 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 0046 图1为本发明典型正常排卵雌性大熊猫个体的雌二醇值、 孕酮值和LH值的变化曲 线图 ； 0047 图2为本发明典型延迟排卵雌性大熊猫个体的雌二醇值、 孕酮值和LH值的变化曲 线图。 0048 图中标识 ： 1- 雌性大熊猫雌二醇值的变化曲线， 2- 雌性大熊猫孕酮值的变化曲 线， 3- 雌性大熊猫 LH 值的变化曲线， A- 雌二醇真实峰值坐标点 ,B-LH 峰值坐标点， Ec ng/ mg Cr 表示为肌酐校正后的雌二醇浓度值， Pg ng/mg Cr 表示为肌酐校正后的孕酮浓度值， 。
30、LH mIU/mg Cr 表示为肌酐校正后的 LH 浓度值。 具体实施方式 0049 实施例一 ： 0050 本发明首先依照专利申请号 201210191762.5 所述， 在春季繁育期间， 按时间要求 对雌性大熊猫进行尿样收集， 对尿样采用酶联免疫吸附试验检测出雌性大熊猫雌二醇真实 峰值及其出现时间， 如图 1 所示， 绘制出雌性大熊猫雌二醇值和孕酮值的变化曲线图， 得到 雌二醇真实峰值坐标点 A。然后以坐标点 A 的时刻为时间起点 0 小时， 使用上海拜沃生物 科技有限公司的犬促黄体生成激素试剂盒， 采用酶联免疫吸附试验检测0小时到48小时内 全部尿样的 LH 值 ； 将雌性大熊猫排尿时间。
31、作为横坐标， 将 LH 值作为纵坐标， 在图 1 上标出 排尿时间及其对应的LH值所确定的坐标点， 将坐标点依次连接起来， 绘制出LH值变化曲线 图， 找出 LH 峰值及其出现时间， 得到 LH 峰值坐标点 B。再后 , 计算出坐标点 A 与坐标点 B 的时间间隔为 9.92 小时， 小于 16 小时， 可初步确定雌性大熊猫为正常排卵个体 ； 再根据坐 标点A后的30小时内雌性大熊猫出现发情高峰行为， 可进一步确定雌性大熊猫为正常排卵 个体。最后， 对于正常排卵雌性大熊猫个体， 在坐标点 B 后的 14 30 小时内、 且雌性大熊 猫出现发情高峰行为时进行初次人工授精 ； 在初次人工授精完成 。
32、6 8 小时后进行第二次 人工授精。 0051 初次人工授精在大熊猫出现发情高峰行为或 / 和孕酮值呈上升趋势时进行， 第二 次人工授精在大熊猫出现发情高峰行为时进行， 两次人工授精都须按以下步骤操作 ： 0052 a. 准备大熊猫精液 ； 0053 b. 麻醉大熊猫， 大熊猫仰卧保定， 仔细清洗大熊猫阴门周围 ； 0054 c. 将开殖器缓慢旋转插入大熊猫阴道， 借助手电筒或其它光源观察阴道内尿道开 口以及子宫颈开口 ； 0055 d. 将大熊猫输精器缓慢插入大熊猫子宫颈口， 用注射器吸取精液， 连接到输精器 上， 将精液缓慢注入子宫颈内 ； 取下注射器并注入少量空气， 借以排尽输精器内残余。
33、精液 ； 说 明 书 CN 103126783 A 8 7/7 页 9 0056 e. 解开大熊猫保定绳， 让大熊猫自然苏醒。 0057 实施例二 ： 0058 本发明首先依照专利申请号 201210191762.5 所述， 在春季繁育期间， 按时间要求 对雌性大熊猫进行尿样收集， 对尿样采用酶联免疫吸附试验检测出雌性大熊猫雌二醇真实 峰值及其出现时间， 如图 2 所示， 绘制出雌性大熊猫雌二醇值和孕酮值的变化曲线图， 得到 雌二醇真实峰值坐标点 A。然后以坐标点 A 的时刻为时间起点 0 小时， 使用上海拜沃生物 科技有限公司的犬促黄体生成激素试剂盒， 采用酶联免疫吸附试验检测0小时到48小。
34、时内 全部尿样的 LH 值 ； 将雌性大熊猫排尿时间作为横坐标， 将 LH 值作为纵坐标， 在图 2 上标出 排尿时间及其对应的LH值所确定的坐标点， 将坐标点依次连接起来， 绘制出LH值变化曲线 图， 找出 LH 峰值及其出现时间， 得到 LH 峰值坐标点 B。再后 , 计算出坐标点 A 与坐标点 B 的时间间隔为23.17小时， 大于16小时， 可初步确定雌性大熊猫为延迟排卵个体 ； 再根据坐 标点A后的30小时内雌性大熊猫未出现发情高峰行为， 可进一步确定雌性大熊猫为延迟排 卵个体。最后， 对于延迟排卵雌性大熊猫个体， 在坐标点 A 后的 30 36 小时内、 且雌性大 熊猫出现发情高峰。
35、行为时进行初次人工授精 ； 在初次人工授精完成 6 8 小时后进行第二 次人工授精。 0059 初次人工授精在大熊猫出现发情高峰行为或 / 和孕酮值呈上升趋势时进行， 第二 次人工授精在大熊猫出现发情高峰行为时进行， 两次人工授精都须按以下步骤操作 ： 0060 a. 准备大熊猫精液 ； 0061 b. 麻醉大熊猫， 大熊猫仰卧保定， 仔细清洗大熊猫阴门周围 ； 0062 c. 将开殖器缓慢旋转插入大熊猫阴道， 借助手电筒或其它光源观察阴道内尿道开 口以及子宫颈开口 ； 0063 d. 将大熊猫输精器缓慢插入大熊猫子宫颈口， 用注射器吸取精液， 连接到输精器 上， 将精液缓慢注入子宫颈内 ； 取下注射器并注入少量空气， 借以排尽输精器内残余精液 ； 0064 e. 解开大熊猫保定绳， 让大熊猫自然苏醒。 0065 本发明并不局限于以上实施例， 本发明的 LH 峰值及其出现时间不一定通过直观 的变化曲线图找出， 可以只通过比较所有检测出的 LH 值大小得到。 说 明 书 CN 103126783 A 9 1/2 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 103126783 A 10 2/2 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 103126783 A 11 。