一株基因重组菌及在手性纯乙偶姻和2,3丁二醇生产中的应用.pdf

本发明公开了一株含有2R，3R-丁二醇脱氢酶基因ydjL和NADH氧化酶基因nox的大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)；菌株已于2008年12月23日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M 208259。本发明还公开了所述的基因重组菌在催化meso-BD生产手性纯S-AC、催化2R，3R-BD生产手性纯R-AC及拆分2，3-BD混合物生产手性纯2S，3S-BD中的应用。应用本发明的重组大肠杆菌制备的手性AC浓度可达36克/升(ee值≥96％)以上；手性纯2S，3S-BD的ee值≥98％，并且实现辅因子的再生，极具工业应用前景。

权利要求书
1.  一株基因重组菌，含有2R，3R-丁二醇脱氢酶基因ydjL和NADH氧化酶基因nox；其特征在于：该菌株名为大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)；菌株已于2008年12月23日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M 208259。

2.  如权利要求1所述的基因重组菌，其特征在于：所述菌株含有的2R，3R-丁二醇脱氢酶的ydjL基因序列长度为1041个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；含有的NADH氧化酶基因的nox基因序列长度为1353个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.  权利要求1或2所述的基因重组菌在催化meso-BD生产手性纯S-AC、催化2R，3R-BD生产手性纯R-AC及拆分2，3-BD混合物生产手性纯2S，3S-BD中的应用。

4.  如权利要求3所述的应用，其涉及的实施步骤如下：
(1)平板培养：将菌株大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的并含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37±1℃培养12±1小时；
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±1小时；
(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比为1～3％的接种量，接种到30mL～500mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养10±1小时；
(4)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为6～10％的接种量接种到2L～10L的改良的M9液体培养基中，37±1℃培养5～20小时，加入终浓度为1mM的IPTG，10～37℃诱导5～24小时，培养过程中，检测细胞的转化能力，当细胞的转化能力达到4～26U/ml，停止发酵；
其中：上述步骤(1)～(3)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L，pH 7.0；
上述步骤(4)中所述改良的M9液体培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；Na2HPO4·7H2012.8g/L；KH2PO43g/L；NaCl 0.5g/L；NH4Cl 1g/L；CaCl20.011g/L；葡萄糖4g/L；
上述细胞的转化能力的测定方法是：将培养的细胞悬浮于含有10g/L的meso-BD的200mM的pH7.8磷酸盐缓冲液中，37℃摇床反应20分钟，以12000rpm的转速对反应液离心1min，以如下测定体系测定上清液中AC的含量；
上述测定体系是：140μl 0.5％w/v的肌酸，200μl 5％w/v溶于95％乙醇的α-萘酚，200μl 40％w/v的氢氧化钾，200μl上述离心所得上清；将该测定体系25℃放置15分钟，然后利用分光光度计测定595nm下的吸光度值；转化能力定义为：每分钟催化底物meso-BD生成1μmol的AC的细胞量为1U；
(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物8,000±500转/分钟离心15分钟；并用pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬起到0.85％的生理盐水中，使细胞的终浓度为2～10g/L；将菌体置于4℃的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂，待用；
(6)转化实验制备产物：
以浓度为2～10g干细胞/L的生物催化剂，在10℃～45℃，pH 5.0～10.0条件下，转化浓度为10～60g/L的meso-BD；180转/分钟振荡5～30小时，得到含S-AC的转化液；将所得的转化液，以8,000±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在80℃进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中S-AC的浓度及光学纯度；
或者，以浓度为2～10g干细胞/L的生物催化剂，在10℃～45℃，pH 5.0～10.0条件下，转化浓度为10～60g/L的2R，3R-BD；180转/分钟振荡5～30小时，得到含R-AC的转化液；将所得的转化液，以8,000±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在80℃进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中R-AC的浓度及光学纯度；
或者，以浓度为2～10g干细胞/L的生物催化剂，在10℃～45℃，pH 5.0～10.0，180转/分钟振荡5～30小时条件下，拆分浓度为5～30g/L的混合重量比例为meso-BD∶2R，3R-BD∶2S，3S-BD＝75.0∶12.6∶12.4的2，3-BD混合物；将所得的转化液，以8,000±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在80℃进行减压蒸馏，釜液进行气相色谱分析测定转化产物中2S，3S-BD的浓度及光学纯度。

5.  如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述诱导培养温度为10℃～30℃；诱导培养时间为10～20h。

6.  如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述细胞的转化能力当达到10～20U/ml，停止发酵。

7.  如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(6)所述转化实验是以浓度为3.0～8.0g干细胞/L的生物催化剂，在20℃～40℃，pH 6.0～9.0，180转/分钟振荡6～20小时条件下对底物进行转化。

8.  如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(6)所述meso-BD的浓度为10～45g/L。

9.  如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(6)所述2R，3R-BD的浓度为10～45g/L。

10.  如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(6)所述2，3-BD混合物的浓度为10～20g/L。

说明书一株基因重组菌及在手性纯乙偶姻和2，3-丁二醇生产中的应用
技术领域
本发明涉及一株基因重组菌及其应用，具体的说，涉及一株重组的能将2R，3R-丁二醇脱氢酶(2R，3R-BDH)基因(ydjL)和NADH氧化酶基因(nox)共表达的大肠杆菌，并以应用此工程菌高效转化内消旋2，3-丁二醇(meso-BD)生产S-乙偶姻(S-AC)，2R，3R-丁二醇(2R，3R-BD)生产R-乙偶姻(R-AC)的方法及拆分2，3-丁二醇(2，3-BD)混合物生产2S，3S-丁二醇(2S，3S-BD)的方法。
背景技术
乙偶姻(Acetoin，AC)通常为淡黄色液体或晶体，有两种同分异构体(R-AC和S-AC)，天然地存在于葡萄酒、蜂蜜、可可、黄油、咖啡、草莓和虹醋栗等物质中。国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食品香料，FEMA安全号为2008。AC在食品、香料以及化妆品等行业也有着非常重要的用途【Opdyke 1979】。AC还是化学合成中的重要原材料。例如，手性纯的AC可用于合成一种新的有光学活性的α-羟基酮类衍生物，还能合成液晶材料，如手性的近晶材料和向列材料【Saito et al.1992】。
2，3-丁二醇(2，3-BD)在常温下是一种无色无味透明的液体，有三种同分异构体：meso-BD、2R，3R-BD和2S，3S-BD。2，3-BD广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等各个领域【Syu 2001】。具有光学活性的2，3-BD(2R，3R-BD和2S，3S-BD)除了以上用途外，由于具有低冰点(-60℃)，可用作防冻剂；另外，由于具有手性碳原子，其在不对称合成中也有重要用途。
1998年，英国Witwatersrand大学的Martin Studer等应用经过10，11-二氢金鸡纳(HCD)改性的铂作为催化剂选择性的加氢还原双乙酰(diacetyl，DA)【Studer et al.1998】。产品对映体过量值为85％～90％，但反应产率只有30％。英国Hull大学的Slipszenko等也开展了采用铂催化剂选择性的催化加氢还原DA的研究【Slipszenko et al.1998】，其产率为85％，R-AC的对映体过量值ee达70％。催化加氢为非均相反应，其反应是在高压下进行，设备要求高，而且反应所用催化剂是价格昂贵的重金属，对于催化剂的制备、改性以及中毒、再生等系列问题尚未解决，目前尚处于实验室研究阶段，还不能工业化。
1992年，美国的Hummel等应用微生物菌体中的酶作为生物催化剂进行还原反应【Hummel et al.1992】。该方法是先培养乳酸杆菌或酵母菌以获得双乙酰还原酶(diacetyl reductase，DAR；此酶也称BDH)，并在pH值为5、温度为70℃的条件下，应用该还原酶及辅酶NADPH催化DA还原为AC，其产率最高达100％。这种利用还原酶进行还原反应的优势十分明显，可以获得高选择性、高产率的产品。这一方法虽可获得高选择性、高产率的产品，但关键步骤是要能够培养出反应所需的DAR，并且DA对于菌体的毒性非常高，采用细胞转化法不可行；纯酶过程又非常烦琐复杂，且辅酶NADPH的再生问题较难解决；DAR能够继续将产生的AC还原为2，3-BD，使得手性AC的得率非常低【Xiao and Xu 2007】。
2001年，Syu综述了近年来生物法生产2，3-BD方面的进展，指出不同的菌株发酵一般会得到2，3-BD三种构型中的两种，同时得到两种构型的AC【Syu 2001】。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)发酵，是以meso-BD为主要代谢物，另外还有少部分的2S，3S-BD；而多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)发酵，则主要得到2R，3R-BD【Nakashimada et al.2000】。因此，单纯的采用一种野生菌株进行发酵生产难以得到手性纯的AC和2S，3S-BD。近年来对AC和2，3-BD的研究逐步转向分子生物学和酶学方面。研究发现，AC和2，3-BD的代谢中有三个关键酶：α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactate synthase，ALS)、α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactatedecarboxylase，ALDC)和2，3-丁二醇脱氢酶(2，3-butanediol dehydrogenase，BDH)。其中，不同微生物体内的BDH有着立体特异性【Ui et al.1984，1986】。因此，人们尝试在大肠杆菌(Escherichia coli)中外源表达来自生产菌株的这些关键酶，从而合成各种纯度高的手性化合物。Ui等将K.pneumoniae编码ALS、ALDC和meso-BDH的基因簇整合到E.coli JM109中进行表达，可以将葡萄糖转化为纯的meso-BD(17.7g/L)，随后又将BDH的编码基因敲除，可以得到手性纯的R-AC(17.5g/L)【Ui et al.1997，1998】。1999年，Ui等将K.pneumoniae的meso-BDH编码基因在E.coli JM109中表达，可以将丁二酮转化为S-AC，此后又将短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)的2S，3S-BDH编码基因整合到该菌中，可以得到2S，3S-BD，结果每3g/L的丁二酮可至多分别得到2.2g/L的S-AC和2S，3S-BD【Ui et al.1999，2004】。Yamada-Onodera【2002】等研究者报道从Hansenula polymorpha Dl-1中克隆的丙三醇脱氢酶基因，构建大肠杆菌工程菌，利用3g干细胞/L，24h转化110mM(9.9g/L)的2，3-BD，生成9.9g/L的手性AC；拆分9.9g/L的2，3-BD混合物(meso-BD∶2R，3R-BD∶2S，3S-BD＝78∶17∶15)生成1.35g/L的2S，3S-BD。从Ui等的研究历程可以发现：一方面，采用构建基因工程菌的方式获得纯的手性化合物是可行的；另一方面，手性纯化合物的生产效率不高。以葡萄糖为底物生产纯的meso-BD，R-AC产量相对较高，但效率较低(转化率＜27％)；而利用丁二酮为底物生产S-AC时，由于其对菌体的毒害作用，不可能得到高的产物浓度；利用丙三醇脱氢酶的大肠杆菌，没有解决辅因子再生问题，也不可能达到高的产物浓度。因此，有必要继续寻找更好的方法，以实现手性纯AC的高效生产。
Bacillus subtilis 168的ydjL基因已被证明编码2R，3R-BDH酶【Nicholson，2008】，2R，3R-BDH催化2R，3R-BD和R-AC之间的转化，同时可催化meso-2，3-BD和S-AC之间的转化，但不能以2S，3S-BD为底物【González et al.，2000】。2，3-BD转化为AC的同时使得NAD变为其还原态NADH，Lactobacillus brevis中的NOX，具有催化NADH生成NAD的能力，实现NAD的再生【Geueke et al.，2003】。但2R，3R-BDH基因(ydjL)和NADH氧化酶基因(nox)在E.coli中的共表达，并以此工程菌高效转化meso-BD生产S-AC，2R，3R-BD生产R-AC及拆分2，3-BD混合物生产2S，3S-BD的方法还未见报道。
参考文献：
Geueke B.，Riebel B and Hummel W.【2003】NADH oxidase from Lactobacillus brevis：anew catalyst for the regeneration of NAD.Enzyme Microb Tech.32：205-211。
González E，Fernández MR，Larroy C，et al.【2000】Characterization of a(2R，3R)-2，3-butanediol dehydrogenase as the Saccharomyces cerevisiae YAL060Wgene product.Disruption and induction ofthe gene.J Biol Chem.275：35876-35885。Hummel W，Kula MR，Boermann F【1992】Microbiologically-prepared diacetyl reductase.USPatent 5,164,314。
Nakashimada Y，Marwoto B，Kashiwamura T，et al.【2000】Enhanced 2，3-butanediolproduction by addition of acetic acid in Paenibacillus polymyxa.J Biosci Bioeng 90：661-664。
Nicholson WL【2008】The Bacillus subtilis ydjL(bdhA)gene encodes acetoinreductase/2，3-butanediol dehydrogenase.Appl Environ Microbiol.74：6832-6838。
Opdyke DLJ【1979】Monographs on fragrance raw materials.Food Cosmet Toxicol 7：509-511。
Saito S，Inoue H，Ohno K【1992】Alpha-hydroxyketone derivatives，liquid crystalcompositions containing said derivatives，and liquid crystal devices using saidcompositions.US Patent 5,164,112。
Slipszenko JA，Griffiths SP，Simons KE【1998】Enantioselective hydrogenation.J Cat 179：267-276。
Studer M，Okafor V，Blaser HU【1998】Hydrogenation of butane-2，3-dione withheterogeneous cinchona modified platinum catalysts：a combination of anenantioselective reaction and kinetic resolution.Chem Commun 9：1053-1054。
Syu MJ【2001】Biological production of 2，3-butanediol.Appl Microbiol Biotechnol 55：10-18。
Ui S，Masuda T，Masuda H，et al.【1986】Mechanism for the formation of 2，3-butanediolstereoisomers in Bacillus polymyxa.J Ferm Technol 64：481-486。
Ui S，Matsuyama N，Masuda H，Muraki H【1984】Mechanism for the formation of2，3-butanediol stereoisomers in Klebsiella pneumoniae.J Ferm Technol 62：551-559。
Ui S，Mimura A，Ohkuma M，Kudo T【1999】Formation of a chiral acetoinic compound fromdiacetyl by Escherichia coli expressing meso-2，3-butanediol dehydrogenase.Lett ApplMicrobiol 28：457-460。
Ui S，Mimura A，Okuma M，et al.【1998】The production of D-acetoin by transgenicEscherichia coli.Lett Appl Mcobiol 26：275-278。
Ui S，Okajima Y，Mimura A，et al.【1997】Sequence analysis of the gene for andcharacterization of D-acetoin forming meso-2，3-butanediol dehydrogenase of Klebsiellapneumoniae expressed in Escherichia coli.J Ferment Bioeng 83：32-37。
Ui S，Takusagawa Y，Sato T，et al.【2004】Production of L-2，3-butanediol by a new pathwayconstructed in Escherichia coli.Lett Appl Microbiol 39：533-537。
Xiao ZJ，Xu P【2007】Acetoin metabolism in bacteria.Crit Rev Microbiol 33：127-140。
Yamada-Onodera K.，Yamamoto H.，Kawahara N.，Tani Y【2002】Expression of the gene ofglycerol dehydrogenase from Hansenula polymorpha D 1-1 in Escherichia coli for theproduction of chiral compounds.Acta Biotechnol 22：355-362。
发明内容
针对上述现有方法中，产品的生产率低，成本高，难以大规模生产的不足。本发明要解决的问题是构建一株能将2R，3R-丁二醇脱氢酶(2R，3R-BDH)基因(ydjL)和NADH氧化酶基因(nox)共表达的大肠杆菌，并以应用此工程菌高效转化meso-BD生产S-AC，2R，3R-BD生产R-AC及拆分2，3-BD混合物生产2S，3S-BD。本发明所述应用的方法具有底物价格低廉，转化效率高，操作简单，可以不同构性的2，3-BD及其混合物为底物，分别得到R-AC，S-AC及2S，3S-BD的特点。
本发明所述基因重组菌，含有2R，3R-丁二醇脱氢酶(2R，3R-BDH)基因(ydjL)和NADH氧化酶基因(nox)；该菌株名为大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)；菌株已于2008年12月23日保藏于“中国典型培养物保藏中心”(武汉大学，中国.武汉)，保藏号为：CCTCC NO：M 208259。
其中，上述菌株含有的2R，3R-丁二醇脱氢酶的ydjL基因序列长度为1041个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；含有的NADH氧化酶的nox基因序列长度为1353个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259，为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，可以用于催化meso-BD生产S-AC；催化2R，3R-BD生产R-AC；拆分2，3-BD混合物生产2S，3S-BD。
上述重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的较佳培养温度为37±1℃，可以在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上生长。
本发明所述的基因重组菌——大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259在催化meso-BD生产手性纯S-AC、催化2R，3R-BD生产手性纯R-AC及拆分2，3-BD混合物生产手性纯2S，3S-BD中的应用。
如上述的应用，其涉及的实施步骤如下：
(1)平板培养：将菌株大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的并含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37±1℃培养12±1小时；
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±1小时；
(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比为1～3％的接种量，接种到30mL～500mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养10±1小时；
(4)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为6～10％的接种量接种到2L～10L的改良的M9液体培养基中，37±1℃培养5～20小时，加入终浓度为1mM的IPTG，10～37℃诱导5～24小时，培养过程中，检测细胞的转化能力，当细胞的转化能力达到4～26U/ml，停止发酵；
其中：上述步骤(1)～(3)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L，pH7.0；115℃灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述改良的M9液体培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；Na2HPO4·7H2O 12.8g/L；KH2PO4 3g/L；NaCl 0.5g/L；NH4Cl 1g/L；CaCl2 0.011g/L；葡萄糖4g/L；115℃灭菌15分钟。
上述细胞的转化能力的测定方法是：将培养的细胞悬浮于含有10g/L的meso-BD的200mM的pH7.8磷酸盐缓冲液中，37℃摇床反应20分钟，以12000rpm的转速对反应液离心1min，以如下测定体系测定上清液中AC的含量；
上述测定体系是：140μl 0.5％w/v的肌酸，200μl 5％w/v溶于95％乙醇的α-萘酚，200μl 40％w/v的氢氧化钾，200μl上述离心所得上清；将该测定体系25℃放置15分钟，然后利用分光光度计测定595nm下的吸光度值；转化能力定义为：每分钟催化底物meso-BD生成1μmol的AC的细胞量为1U；
(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物8,000±500转/分钟离心15分钟；并用pH7.4、1/15M的PBS缓冲液洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬起到0.85％的生理盐水中，使细胞的终浓度为2～10g/L；将菌体置于4℃的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂，待用；
(6)转化实验制备产物：
以浓度为2～10g干细胞/L的生物催化剂，在10℃～45℃，pH5.0～10.0条件下，转化浓度为10～60g/L的meso-BD；180转/分钟振荡5～30小时，得到含S-AC的转化液；将所得的转化液，以8,000±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在80℃进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中S-AC的浓度及光学纯度；
或者，以浓度为2～10g干细胞/L的生物催化剂，在10℃～45℃，pH5.0～10.0条件下，转化浓度为10～60g/L的2R，3R-BD；180转/分钟振荡5～30小时，得到含R-AC的转化液；将所得的转化液，以8,000±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在80℃进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中R-AC的浓度及光学纯度；
或者，以浓度为2～10g干细胞/L的生物催化剂，在10℃～45℃，pH5.0～10.0，180转/分钟振荡5～30小时条件下，拆分浓度为5～30g/L的混合重量比例为meso-BD∶2R，3R-BD∶2S，3S-BD＝75.0∶12.6∶12.4的2，3-BD混合物(购于国药集团化学试剂有限公司)；将所得的转化液，以8,000±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在80℃进行减压蒸馏，釜液进行气相色谱分析测定转化产物中2S，3S-BD的浓度及光学纯度。
上述转化产物的检测方法：
每500ml乙酸乙酯中加入1ml的异戊醇，作为萃取剂；利用该萃取剂，对步骤(6)中转化产物的样品进行等体积萃取，利用涡旋振荡器对萃取的样品震荡1分钟，然后静置，取上层样品进行气相检测。具体气相检测条件如下：
对于样品中底物丁二醇和产物乙偶姻浓度的检测条件如下：
所用气相色谱仪的型号是Varian CP3380，氮气作为载气，进样器和检测器的温度均设为280℃；检测过程的柱温设定为：40℃保持3分钟，然后以每分钟30℃的速率升温到260℃；利用进样器准确吸取上述处理样品的上清1μL，进行气相检测；
对于上述样品中丁二醇和乙偶姻光学纯度的检测条件如下：
所用气相色谱仪的型号是Agilent 6820，氮气作为载气，进样器和检测器的温度均设为280℃；检测过程的柱温设定为：40℃保持3分钟，然后以每分钟1.5℃的速率升温到80℃，接着以每分钟0.5℃的速率升温到86℃，以每分钟30℃的速率升温到200℃；利用进样器准确吸取3μL上述处理样品的上清，进行气相检测。
S-AC的ee值的计算方法：ee=[S]-[R][S]+[R]×100%]]>
R-AC的ee值的计算方法：ee=[R]-[S][R]+[S]×100%]]>
上述的应用方法中，
步骤(4)所述诱导培养温度优选10℃～30℃；诱导培养时间优选10～20h。
步骤(4)所述细胞的转化能力优选当达到10～20U/ml，停止发酵。
步骤(6)所述转化实验优选以浓度为3.0～8.0g干细胞/L的生物催化剂，在20℃～40℃，pH6.0～9.0，180转/分钟振荡6～20小时条件下对底物进行转化。
步骤(6)所述meso-BD的浓度优选10～45g/L。
步骤(6)所述2R，3R-BD的浓度优选10～45g/L。
步骤(6)所述2，3-BD混合物的浓度优选10～20g/L。
本发明是一种利用含2R，3R-丁二醇脱氢酶基因(ydjL)和NADH氧化酶基因(nox)的重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259全细胞作为生物催化剂催化meso-BD生产S-AC；催化2R，3R-BD生产R-AC及拆分2，3-BD混合物生产2S，3S-BD。
本发明涉及的2R，3R-BDH基因ydjL来自Bacillus subtilis 168(购自美国标准生物品保藏中心，菌株编号为：ATCC 23857)，NOX基因nox来自Lactobacillus brevis(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为：CICC 6004)，NOX的作用是提供2R，3R-BDH所需的辅因子NAD。
本发明涉及的利用含2R，3R-BDH和NOX酶的E.coli全细胞作为生物催化剂转化2，3-BD生产手性AC及拆分2，3-BD混合物生产2S，3S-BD的方法转化原理可用下式表示：

本发明具有以下特点：
(1)首次构建并应用了可表达2R，3R-BDH和NOX酶的重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259全细胞作为生物催化剂转化2，3-BD生产手性AC及拆分2，3-BD混合物生产2S，3S-BD。
(2)2R，3R-BDH催化2，3-BD生成手性AC；NOX提供2R，3R-BDH所需的辅因子NAD，实现辅因子的再生。
(3)菌株要求的培养基简单、成本低。
(4)直接用完整的重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCCNO：M 208259细胞作为生物催化剂进行转化，操作方便。
(5)本发明的生物催化剂能转化meso-BD生产S-AC；转化2，3-BD生产R-AC，实现手性AC的生产，ee值≥96％。
(6)本发明的生物催化剂能拆分2，3-BD混合物生产2S，3S-BD，实现手性2S，3S-BD的生产，ee值≥98％。
(7)本发明的生物催化剂可以用过滤法或离心法去除，后续精馏分离提取费用低廉，手性AC浓度可达36g/L以上。
附图说明
本发明所述菌株已于2008年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国.武汉)，保藏中心编号为：CCTCC NO：M 208259。
图1重组大肠埃希氏菌的蛋白电泳图，M：Marker；1：E.coli BL21(DE3)；2：E.coliBL21(pETDuet)；3：E.coli BL21(pETDuet-ydjL)；4：E.coli BL21(pETDuet-nox)；5：E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)。
图2标准品的气相色谱(GC)图谱，其中异戊醇为内标，其它各物质的保留时间分别为：R-AC，15.340min；S-AC，16.836min；2S，3S-BD，33.609min；2R，3R-BD，34.475min；meso-BD，36.343min。
图3催化meso-BD生产S-AC转化液的GC图谱，(A)底物meso-BD；(B)转化液。
图4催化2R，3R-BD生产R-AC转化液的GC图谱，(A)底物2R，3R-BD；(B)转化液。
图5拆分2，3-BD混合物生产2S，3S-BD转化液的GC图谱，(A)底物2，3-BD混合物；(B)转化液。
具体实施方式
实施例1：重组基因工程菌株E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的构建
1、2R，3R-BDH基因(ydjL)的克隆
采用常规的方法制备菌株Bacillus subtilis 168的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取Bacillussubtilis 168的基因组DNA；使用合成的引物从Bacillus subtilis 168的基因组DNA中PCR扩增得到丁二醇脱氢酶基因ydjL；
Bacillus subtilis 168作为ydjL基因的来源菌，根据已测序的该菌的基因组序列，设计引物：上游引物5′-TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3′，携带一个NcoI位点；下游引物5′-GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3′，携带一个SalI位点。
2、NADH氧化酶基因(nox)的的克隆
采用常规的方法制备菌株Lactobacillus brevis的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取Lactobacillus brevis菌株的基因组DNA；使用合成的引物从Lactobacillus brevis菌株的基因组DNA中PCR扩增得到NADH氧化酶基因nox；
Lactobacillus brevis作为nox基因的来源菌，根据已测序的该菌的基因组序列及报道的该基因的序列，设计引物：
上游引物5′-GCGAGATCTCATGAAAGTCACAGTTG-3′，携带一个Bgl II位点；
下游引物5′-GATCTCGAGTTAAGCGTTAACTGAT-3′，携带一个XhoI位点。
3、将步骤(1)PCR扩增得到的片段连接到pEasy-T上，得到重组质粒pEasy-TydjL，将步骤(2)扩增得到的片段链接到pMD19-T上，得到重组质粒pMD19-Tnox；使用NcoI、salI双酶切质粒pETDuet和pEasy-TydjL，回收片段ydjL及pETDuet，连接，得到重组质粒pETDuetydjL；使用Bgl II、XhoI双酶切pMD 19-Tnox和pETDuetydjL，回收片断nox及pETDuetydjL，连接，得到重组质粒pETDuet(ydjLnox)；再将上述重组质粒经过转化导入宿主E.coli BL21(DE3)，得到工程菌株E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)。该菌株在含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养4小时，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃诱导8小时，得到同时表达有2R，3R-BDH和NOX的细胞，经12.5％的SDS-PAGE验证，结果如图1所示。
上述菌株已于2008年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国.武汉)，保藏中心编号为：CCTCC NO：M 208259。
上述重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259，为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，可以用于催化meso-BD生产S-AC；催化2R，3R-BD生产R-AC；拆分2，3-BD混合物生产2S，3S-BD。
上述重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的较佳培养温度为37±1℃，可以在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上生长。
实施例2：全细胞催化剂的制备
(1)平板培养：将重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259菌株划线到含有质量体积比为1.5％琼脂并含100μg/mL的氨苄青霉素LB平板上，37℃培养12小时。
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含100μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，37℃摇床振荡培养12小时。
(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为2％的接种量，接种到30mL～500mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养10小时。
(4)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的培养液以体积比为8％的接种量接种2L～10L的改良的M9液体培养基，37℃培养10小时，加入终浓度为1mM的IPTG，20℃诱导12小时，使细胞的转化能力达到15U/ml。
其中：上述步骤(1)～(3)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L，pH7.0；115℃灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述改良的M9液体培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；Na2HPO4·7H2O 12.8g/L；KH2PO4 3g/L；NaCl 0.5g/L；NH4Cl 1g/L；CaCl2 0.011g/L；葡萄糖4g/L；115℃灭菌15分钟。
上述细胞的转化能力的测定方法是：将培养的细胞悬浮于含有10g/L的meso-BD的200mM的pH7.8磷酸盐缓冲液中，37℃摇床反应20分钟，以12000rpm的转速对反应液离心1min，以如下测定体系测定上清液中AC的含量。
上述测定体系是：140μl 0.5％w/v的肌酸，200μl 5％w/v溶于95％乙醇的α-萘酚，200μl 40％w/v的氢氧化钾，200μl上述离心所得上清；将该测定体系25℃放置15分钟，然后利用分光光度计测定595nm下的吸光度值；转化能力定义为：每分钟催化底物meso-BD生成1μmol的AC的细胞量为1U。
(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物8,000转/分钟离心15分钟；并用pH7.4、1/15M的PBS缓冲液洗涤菌体两遍，最后将细胞悬起到0.85％的生理盐水中，使细胞的终浓度10g/L；将菌体置于-20℃的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂，待用。
实施例3：全细胞催化剂的制备
(1)平板培养：将重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259菌株划线到含有质量体积比为1.5％琼脂并含100μg/mL的氨苄青霉素LB平板上，37℃培养12小时。
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含100μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，37℃摇床振荡培养12小时。
(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为2％的接种量，接种到30mL～500mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养10小时。
(4)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的培养液以体积比为8％的接种量接种2L～10L的改良的M9液体培养基，37℃培养14小时，加入终浓度为1mM的IPTG，10℃诱导20小时，使细胞的转化能力达到20U/ml。
其中：上述步骤(1)～(3)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl  10g/L，pH7.0；115℃灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述改良的M9液体培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；Na2HPO4·7H2O 12.8g/L；KH2PO4 3g/L；NaCl 0.5g/L；NH4Cl 1g/L；CaCl2 0.011g/L；葡萄糖4g/L；115℃灭菌15分钟。
上述细胞的转化能力的测定方法是：将培养的细胞悬浮于含有10g/L的meso-BD的200mM的pH7.8磷酸盐缓冲液中，37℃摇床反应20分钟，以12000rpm的转速对反应液离心1min，以如下测定体系测定上清液中AC的含量。
上述测定体系是：140μl 0.5％w/v的肌酸，200μl 5％w/v溶于95％乙醇的α-萘酚，200μl 40％w/v的氢氧化钾，200μl上述离心所得上清；将该测定体系25℃放置15分钟，然后利用分光光度计测定595nm下的吸光度值；转化能力定义为：每分钟催化底物meso-BD生成1μmol的AC的细胞量为1U。
(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物8,000转/分钟离心15分钟；并用pH7.4、1/15的PBS缓冲液洗涤菌体两遍，最后将细胞悬起到0.85％的生理盐水中，使细胞的终浓度10g/L；将菌体置于-20℃的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂，待用。
实施例4：全细胞催化剂的制备
(1)平板培养：将重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259菌株划线到含有质量体积比为1.5％琼脂并含100μg/mL的氨苄青霉素LB平板上，37℃培养12小时。
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含100μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，37℃摇床振荡培养12小时。
(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为2％的接种量，接种到30mL～500mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养10小时。
(4)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的培养液以体积比为8％的接种量接种2L～10L的改良的M9液体培养基，37℃培养18小时，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃诱导6小时，使细胞的转化能力达到10U/ml。
其中：上述步骤(1)～(3)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl  10g/L，pH7.0；115℃灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述改良的M9液体培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；Na2HPO4·7H2O 12.8g/L；KH2PO4 3g/L；NaCl 0.5g/L；NH4Cl 1g/L；CaCl2 0.011g/L；葡萄糖4g/L；115℃灭菌15分钟。
上述细胞的转化能力的测定方法是：将培养的细胞悬浮于含有10g/L的meso-BD的200mM的pH7.8磷酸盐缓冲液中，37℃摇床反应20分钟，以12000rpm的转速对反应液离心1min，以如下测定体系测定上清液中AC的含量。
上述测定体系是：140μl 0.5％w/v的肌酸，200μl 5％w/v溶于95％乙醇的α-萘酚，200μl 40％w/v的氢氧化钾，200μl上述离心所得上清；将该测定体系25℃放置15分钟，然后利用分光光度计测定595nm下的吸光度值；转化能力定义为：每分钟催化底物meso-BD生成1μmol的AC的细胞量为1U。
(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物8,000转/分钟离心15分钟；并用pH7.41/15M的PBS缓冲液洗涤菌体两遍，最后将细胞悬起到0.85％的生理盐水中，使细胞的终浓度8g/L；将菌体置于-20℃的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂，待用。
实施例5：利用实施例2～4得到的生物催化剂制备S-AC
转化实验：使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的细胞浓度为5g干细胞/L，在20℃，pH9.0条件下，meso-BD浓度为25g/L；180转/分钟振荡反应10小时，得到含S-AC的转化液；将所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清液中meso-BD和S-AC的含量；
反应结束时收集转化液在80℃进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中S-AC的浓度为23.5g/L，其ee值为96.2％。该样品的GC图谱见图3，保留时间为16.836的峰即是S-AC的峰。
实施例6：利用实施例2～4得到的生物催化剂制备S-AC
转化实验：将所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的细胞浓度为3g干细胞/L，在30℃，pH8.0条件下，meso-BD浓度为10g/L；180转/分钟振荡反应6小时，得到含S-AC的转化液；将所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在80℃进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中S-AC的浓度为9.5g/L，其ee值为96.8％。
实施例7：利用实施例2～4得到的生物催化剂制备S-AC
转化实验：使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的细胞浓度为8g干细胞/L，在40℃，pH6.0条件下，meso-BD浓度为45g/L；180转/分钟振荡反应20小时，得到含S-AC的转化液；将所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清液中meso-BD和S-AC的含量；
反应结束时收集转化液在80℃进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中S-AC的浓度为36.7g/L，其ee值为96.0％。
实施例8：利用实施例2～4得到的生物催化剂制备R-AC
转化实验：使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的细胞浓度为3g干细胞/L，在30℃，pH8.0条件下，2R，3R-BD浓度为10g/L；180转/分钟振荡反应6小时，得到含R-AC的转化液；将所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在80℃进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中R-AC的浓度为9.5g/L，其ee值为96.8％。该样品的GC图谱见图4，保留时间为15.340的峰即是R-AC的峰。
实施例9：利用实施例2～4得到的生物催化剂制备R-AC
转化实验：使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的细胞浓度为8g干细胞/L，在40℃，pH6.0条件下，2R，3R-BD浓度为45g/L；180转/分钟振荡反应20小时，得到含R-AC的转化液；将所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清液中2R，3R-BD和R-AC的含量；
反应结束时收集转化液在80℃进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中R-AC的浓度为42.0g/L，其ee值为96.0％。
实施例10：利用实施例2～4得到的生物催化剂制备R-AC
转化实验：使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的细胞浓度为5g干细胞/L，在20℃，pH9.0条件下，2R，3R-BD浓度为25g/L；180转/分钟振荡反应10小时，得到含R-AC的转化液；将所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清液中2R，3R-BD和R-AC的含量；
反应结束时收集转化液在80℃进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中R-AC的浓度为24.0g/L，其ee值为96.2％。
实施例11：利用实施例2～4得到的生物催化剂制备2S，3S-BD
拆分实验：使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的细胞浓度为5g干细胞/L，在20℃，pH9.0，180转/分钟振荡10小时条件下，拆分浓度为15g/L的混合重量比例为meso-BD∶2R，3R-BD∶2S，3S-BD＝75.0∶12.6∶12.4的2，3-BD混合物(购于国药集团化学试剂有限公司)；将所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，收集转化液在80℃进行减压蒸馏，釜液进行气相色谱分析测定转化产物中2S，3S-BD的浓度为1.86g/L，其ee值为99.2％。该样品的GC图谱见图5，保留时间为33.609min的峰即是2S，3S-BD的峰。
实施例12：利用实施例2～4得到的生物催化剂制备2S，3S-BD
拆分实验：使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的细胞浓度为3g干细胞/L，在30℃，pH8.0，180转/分钟振荡6小时条件下，拆分浓度为10g/L的混合重量比例为meso-BD∶2R，3R-BD∶2S，3S-BD＝75.0∶12.6∶12.4的2，3-BD混合物(购于国药集团化学试剂有限公司)；将所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，收集转化液在80℃进行减压蒸馏，釜液进行气相色谱分析测定转化产物中2S，3S-BD的浓度为1.24g/L，其ee值为99.9％。
实施例13：利用实施例2～4得到的生物催化剂制备2S，3S-BD
拆分实验：使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)CCTCC NO：M 208259的细胞浓度为8g干细胞/L，在40℃，pH6.0，180转/分钟振荡20小时条件下，拆分浓度为20g/L的混合重量比例为meso-BD∶2R，3R-BD∶2S，3S-BD＝75.0∶12.6∶12.4的2，3-BD混合物(购于国药集团化学试剂有限公司)；将所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，收集转化液在80℃进行减压蒸馏，釜液进行气相色谱分析测定转化产物中2S，3S-BD的浓度为2.46g/L，其ee值为98.2％。
序列表
<110>山东大学
<120>一株基因重组菌及在手性纯乙偶姻和2，3-丁二醇生产中的应用
<141>2009-1-4
<160>2
<210>1
<211>1041
<212>DNA
<213>枯草杆菌(Bacillus subtilis)
<221>ydjL基因
<222>(1)…(1041)
<400>1
atgaaggcag caagatggca taaccaaaag gatatccgta ttgaacatat cgaagagcca   60
aaaacggagc cgggaaaagt aaagatcaaa gtcaaatggt gcggcatctg cggaagtgat  120
ttacacgaat atctgggcgg cccgatcttt attccggttg acaaaccgca cccattaaca  180
aatgaaacgg cacctgtcac aatggggcat gaattctccg gtgaagttgt cgaagtcgga  240
gaaggcgttg aaaattataa agttggagac cgcgttgtag tcgagccgat ttttgctaca  300
cacggccacc aaggcgccta caaccttgat gaacaaatgg gattcctcgg cttagccggc  360
ggaggcggcg gtttctctga atacgtctct gtggatgaag agcttttgtt caaacttcct  420
gatgaattat catatgaaca aggcgcgctc gttgaacctt ctgcagttgc tctatacgct  480
gtccgctcaa gcaaactcaa agcaggcgac aaagcggctg tattcggctg cggcccgatc  540
ggacttcttg tcattgaagc gctgaaggct gccggtgcaa ctgatattta cgctgttgag  600
ctttctcctg aacgccagca aaaagctgag gagcttggcg cgatcatcgt tgatccgtct  660
aaaacagacg atgtagtcgc tgagattgca gaacgtacag gaggcggtgt tgacgtagca  720
ttcgaagtca ctggtgtccc agtggtgtta cgacaagcca tccagtccac tacaattgcc  780
ggtgaaaccg tcatcgtcag catttgggaa aaaggtgctg aaatccatcc gaacgatatc  840
gtaatcaaag aacgtacagt aaaaggaatt atcggatacc gcgacatctt cccggctgta  900
ttgtcattaa tgaaagaagg ctatttctca gccgacaaac tcgtaacgaa aaaaatcgta  960
ctagatgatt tgatcgagga aggcttcggg gctcttatta aagagaaaag ccaagtcaaa 1020
atccttgtta gacctaacta a                                           1041
<210>2
<211>1353
<212>DNA
<213>短乳杆菌(Lactobacillus brevis)
<221>nox基因
<222>(1)…(1353)
<400>2
atgaaagtca cagttgttgg ttgtacacat gccggaacct ttgcgattaa acaaatcttg   60
gccgaacacc cggatgccga agtgaccgtc tacgaacgta acgatgtcat ttcatttctc  120
tcttgtggaa tcgcccttta cctggggggg aaagtcgctg acccgcaagg cctcttttat  180
tcaagtcctg aagaactcca aaaattaggt gccaatgtcc aaatgaatca caatgtttta  240
gcaatcgatc ctgatcaaaa gacagtgacc gttgaggact taaccaatca tgcacaaacg  300
actgagtcat acgataaact agtcatgacg tctggttctt ggccaattgt tcccaagatt  360
ccgggcatcg atagcgatcg cgttaagctc tgcaaaaact gggcacatgc gcaagctcta  420
atcgaagatg ctaaagaagc caagcggatt accgttattg gtgccggcta tattggtgct  480
gaactagcag aagcctactc cactactggt catgacgtaa ctttaattga tgcgatggcc  540
cgggtgatgc ccaagtactt tgatgctgat tttacggatg tcattgaaca agattatcgg  600
gatcacggtg tccaacttgc cttaggtgaa acggttgaaa gctttactga tagtgcaact  660
gggctgacta ttaagactga taagaacagc tatgaaacgg atctcgctat tttatgcatt  720
ggctttagac caaataccga cctgctgaaa ggcaaagtcg atatggcacc aaacggcgcg  780
attattacgg atgactacat gcgttcttct aaccctgata ttttcgccgc tggtgacagt  840
gctgctgtgc actacaaccc aacccatcag aatgcttaca ttcccttagc aactaacgcg  900
gtgcgtcaag gtatcctagt cggtaaaaac ctagttaagc cgaccgtcaa gtatatggga  960
acacaatcat cttctggttt ggcactctat gatcggacga tcgtctcaac tggtttaacg 1020
ctagcagctg caaaacaaca agggttgaac gctgaacaag tgattgttga agataattat 1080
cgcccagagt ttatgccgtc aactgaaccc gttttgatgt cattagtctt tgaccccgac 1140
acacaccgga tcttaggtgg tgcgttaatg agtaaatacg acgtttcaca atcggccaac 1200
accctttctg tttgcatcca aaacgaaaat acaattgatg acttagcgat ggttgatatg 1260
ctcttccaac ctaactttga tcgaccattc aactacctaa acatcttagc gcaagctgct 1320
caggcaaagg ttgcccaatc agttaacgct taa                              1353