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1、10申请公布号CN104220459A43申请公布日20141217CN104220459A21申请号201280069243X22申请日20121206CNCMI452420110921CNCMI45232011092111192456920111207EPC07K16/40200601G01N33/5320060171申请人国家科学研究中心地址法国巴黎申请人尼斯大学72发明人G朗博E瓦伦廷M雷恩诺74专利代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司11262代理人陈建芳阎娬斌54发明名称抗SPLA2X抗体和其用途57摘要本发明涉及针对人类SPLA2X的分离抗体和其用途。30优先权数据85PCT。
2、国际申请进入国家阶段日2014080786PCT国际申请的申请数据PCT/EP2012/0746922012120687PCT国际申请的公布数据WO2013/083720EN2013061383生物保藏信息51INTCL权利要求书2页说明书25页序列表11页PCT/RO/134表2页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书25页序列表11页PCT/RO/134表2页附图3页10申请公布号CN104220459ACN104220459A1/2页21一种针对人类SPLA2X的分离抗体，其中所述抗体具有小于109M的结合人类SPLA2X的KD。2根据权利要求1所述。
3、的针对人类SPLA2X的分离抗体，其中重链可变区包含至少一个以下CDRVHCDR1GFTFSNSEQIDNO1或GYTFTNSEQIDNO2；VHCDR2TISSGGDDTYSEQIDNO3或WIKTNTGEPTSEQIDNO4；和VHCDR3PQLGPSEQIDNO5或GNYYRPRRYFDYSEQIDNO6，或具有与SEQIDNO16具有至少60同一性的氨基酸序列的任何CDR，或其中轻链可变区包含至少一个以下CDRVLCDR1RSSKSLLHSNGITYLYSEQIDNO7或RASENLYSNLASEQIDNO8；VLCDR2YMSNLASSEQIDNO9或AATNLADSEQIDNO10。
4、；和VLCDR3MQSLEYPLTSEQIDNO11或QHFYVTPYTSEQIDNO12，或具有与SEQIDNO712具有至少60同一性的氨基酸序列的任何CDR。3根据权利要求1到2中任一权利要求所述的针对人类SPLA2X的分离抗体，其中重链可变区包含至少一个如权利要求2中所定义的CDR，并且轻链可变区包含至少一个如权利要求2中所定义的CDR。4根据权利要求1到3中任一权利要求所述的针对人类SPLA2X的分离抗体，其中重链可变区包含如权利要求2中所定义的CDR，并且轻链可变区包含如权利要求2中所定义的CDR。5根据权利要求1到4中任一权利要求所述的针对人类SPLA2X的分离抗体，其中重链可变。
5、区包含以下CDRGFTFSNSEQIDNO1、TISSGGDDTYSEQIDNO3和PQLGPSEQIDNO5，并且轻链可变区包含以下CDRRSSKSLLHSNGITYLYSEQIDNO7、YMSNLASSEQIDNO9和MQSLEYPLTSEQIDNO11，或具有与所述SEQIDNO1、3、5、7、9、11具有至少60同一性的氨基酸序列的任何CDR。6根据权利要求1到4中任一权利要求所述的针对人类SPLA2X的分离抗体，其中重链可变区包含以下CDRGYTFTNSEQIDNO2、WIKTNTGEPTSEQIDNO4和GNYYRPRRYFDYSEQIDNO6，并且轻链可变区包含以下CDRRASE。
6、NLYSNLASEQIDNO8、AATNLADSEQIDNO10和QHFYVTPYTSEQIDNO12，或具有与所述SEQIDNO2、4、6、8、10、12具有至少60同一性的氨基酸序列的任何CDR。7根据权利要求1到6中任一权利要求所述的针对人类SPLA2X的分离抗体，其中编码重链可变区的氨基酸序列是SEQIDNO13或SEQIDNO15，并且编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQIDNO14或SEQIDNO16，或具有与所述SEQIDNO1316具有至少60同一性的氨基酸序列的任何序列。8一种表达载体，其包含SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19和SEQIDNO20中的至少。
7、一个、或具有与所述SEQIDNO1720具有至少60同一性的核酸序列的任何序列。9产生针对人类SPLA2X的抗体的杂交瘤细胞系，其登记为CNCMI4523和CNCMI4524。10一种组合物，其包含根据权利要求1到7中任一权利要求所述的针对人类SPLA2X权利要求书CN104220459A2/2页3的抗体。11根据权利要求1到7中任一权利要求所述的针对人类SPLA2X的抗体，其用于治疗SPLA2X相关病状，其中所述抗体抑制内源SPLA2X的活性。12根据权利要求1到7中任一权利要求所述的针对人类SPLA2X的抗体，其用于检测生物样品中的SPLA2X。13一种体外诊断或预后分析，其用于使用根据权。
8、利要求1到7中任一权利要求所述的针对人类SPLA2X的抗体测定生物样品中的SPLA2X的存在。14根据权利要求13所述的体外诊断或预后分析，其中所述分析是夹心ELISA，所述夹心ELISA使用权利要求5的抗体作为包被抗体并且使用权利要求6的抗体作为暴露抗体。15一种试剂盒，其包含至少一种根据权利要求1到7中任一权利要求所述的针对人类SPLA2X的抗体。16根据权利要求15所述的试剂盒，其包含权利要求5的抗体和权利要求6的抗体。权利要求书CN104220459A1/25页4抗SPLA2X抗体和其用途技术领域0001本发明涉及新颖的针对人X型分泌型磷脂酶A2SPLA2X的抗体和其在诊断和治疗方法中。
9、的用途。背景技术0002分泌型磷脂酶A2SPLA2形成了结构相关的酶的一个家族，这些酶催化磷脂的SN2脂肪酰基键发生水解，从而释放游离脂肪酸和溶血磷脂。通过催化这个反应，SPLA2酶在多种生物过程中发挥关键作用，所述生物过程包括细胞膜的稳态平衡、脂质消化、宿主防御、信号转导和脂质介体例如类二十烷酸和溶血磷脂衍生物产生VALENTIN等人2000,BIOCHBIOPHYSACT5970；LAMBEAU,G和GELB,MH2008,ANNUREVBIOCHEM77,495520。这个家族包括11个成员/同种型，命名为SPLA2IB、SPLA2IIA、SPLA2IIC、SPLA2IID、SPLA2I。
10、IE、SPLA2IIF、SPLA2III、SPLA2V、SPLA2X、SPLA2XIIA和SPLA2XIIB。0003在蛋白质层面对具体同种型的定量已被证明是困难的，因为酶活性是类似的并且不存在同种型特异性SPLA2抗体。0004NEVALAINEN等人开发了一种针对SPLA2X的抗体，其应用在时间分辨荧光免疫分析TRFIA中。这种多克隆抗体是通过用重组人类SPLA2X蛋白对兔进行免疫来获得的。TRFIA的分析灵敏度被描述为2NG/ML。在来自脓毒性休克患者和健康血液供体的血清样品中分析SPLA2X水平作者发现，在两种类型的样品中，SPLA2X的血清浓度都低于所述测试的分析灵敏度。0005SA。
11、NTACRUZBIOTECHNOLOGY以编号SC365730提供了一种单克隆抗体H9。根据发明人所获得的实验结果，H9抗体具有约9109M的结合人类SPLA2X的KD参看实施例。0006当前需要针对SPLA2X的抗体，其允许对生物样品、例如血清样品中的SPLA2X进行更精确且更灵敏的检测。发明内容0007本发明的一个目的是一种针对人类SPLA2X的分离抗体，其中所述抗体具有小于109M的结合人类SPLA2X的KD。0008在一个实施方案中，所述针对人类SPLA2X的分离抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含至少一个以下CDR0009VHCDR1GFTFSNSEQIDNO1或GYTFTNSEQ。
12、IDNO2；VHCDR2TISSGGDDTYSEQIDNO3或WIKTNTGEPTSEQIDNO4；和0010VHCDR3PQLGPSEQIDNO5或GNYYRPRRYFDYSEQIDNO6，0011或具有与SEQIDNO16具有至少60同一性的氨基酸序列的任何CDR，0012或其中轻链可变区包含至少一个以下CDR说明书CN104220459A2/25页50013VLCDR1RSSKSLLHSNGITYLYSEQIDNO7或RASENLYSNLASEQIDNO8；0014VLCDR2YMSNLASSEQIDNO9或AATNLADSEQIDNO10；和0015VLCDR3MQSLEYPLTSEQ。
13、IDNO11或QHFYVTPYTSEQIDNO12，0016或具有与SEQIDNO712具有至少60同一性的氨基酸序列的任何CDR。0017在另一个实施方案中，所述针对人类SPLA2X的分离抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含上文所定义的CDR中的至少一个并且所述轻链可变区包含上文所定义的CDR中的至少一个。0018在另一个实施方案中，所述针对人类SPLA2X的分离抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含上文所定义的CDR并且所述轻链可变区包含上文所定义的CDR。0019在另一个实施方案中，所述针对人类SPLA2X的分离抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含。
14、以下CDRGFTFSNSEQIDNO1、TISSGGDDTYSEQIDNO3和PQLGPSEQIDNO5，并且所述轻链可变区包含以下CDRRSSKSLLHSNGITYLYSEQIDNO7、YMSNLASSEQIDNO9和MQSLEYPLTSEQIDNO11，或具有与所述SEQIDNO1、3、5、7、9、11具有至少60同一性的氨基酸序列的任何CDR。0020在另一个实施方案中，所述针对人类SPLA2X的分离抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下CDRGYTFTNSEQIDNO2、WIKTNTGEPTSEQIDNO4和GNYYRPRRYFDYSEQIDNO6，并且所述轻链可变区包。
15、含以下CDRRASENLYSNLASEQIDNO8、AATNLADSEQIDNO10和QHFYVTPYTSEQIDNO12，或具有与所述SEQIDNO2、4、6、8、10、12具有至少60同一性的氨基酸序列的任何CDR。0021在另一个实施方案中，所述针对人类SPLA2X的分离抗体包含编码重链可变区的氨基酸序列SEQIDNO13或SEQIDNO15，和编码轻链可变区的氨基酸序列SEQIDNO14或SEQIDNO16，或具有与所述SEQIDNO1316具有至少60同一性的氨基酸序列的任何序列。0022本发明的另一个目的是一种表达载体，其包含SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO1。
16、9和SEQIDNO20中的至少一个、或具有与所述SEQIDNO1720具有至少60同一性的核酸序列的任何序列。0023本发明的另一个目的是产生针对人类SPLA2X的抗体的杂交瘤细胞系，登记为CNCMI4523和CNCMI4524。0024本发明的另一个目的是一种组合物，其包含上文所定义的针对人类SPLA2X的抗体。0025本发明的另一个目的是上文所定义的针对人类SPLA2X的抗体，其用于治疗SPLA2X相关病状，其中所述抗体抑制内源SPLA2X的活性。0026本发明的另一个目的是上文所定义的针对人类SPLA2X的抗体，其用于检测生物样品中的SPLA2X。0027本发明的另一个目的是一种体外诊断。
17、或预后分析，其用于使用上文所定义的针对人类SPLA2X的抗体测定生物样品中的SPLA2X的存在。0028在一个实施方案中，所述体外诊断或预后分析是夹心ELISA，其使用抗体8D9作为包被抗体并且使用抗体9C12作为暴露抗体。说明书CN104220459A3/25页60029本发明的另一个目的是一种试剂盒，其包含至少一种上文所定义的针对人类SPLA2X的抗体。0030在一个实施方案中，所述试剂盒包含抗体8D9和抗体9C12。具体实施方式0031发明人开发了新颖的针对SPLA2X的抗体，其对SPLA2X显示了比现有抗体更佳的亲和力并且允许对生物样品中的SPLA2X进行更精确且更灵敏的检测，如实施例。
18、中所示。0032此外，发明人提供了针对SPLA2X的单克隆抗体，其提供以下优势I比多克隆抗体更具特异性，和II由于和单克隆本质相关联的结果的可重现性，允许所述抗体的工业应用。0033定义0034SPLA2X是SPLA2家族的一个同种型。人类SPLA2X蛋白的完整氨基酸序列SEQIDNO21GENBANK登录号NP003552是0035MGPLPVCLPIMLLLLLPSLLLLLLLPGPGSG信号肽0036EASRILRVHRR前肽0037GILELAGTVGCVGPRTPIAYMKYGCFCGLGGHGQPRDAIDWCCHGHDCCYTRAEEAGCSPKTERYSWQCVNQSVLCG。
19、PAENKCQELLCKCDQEIANCLAQTEYNLKYLFYPQFLCEPDSPKCD成熟蛋白0038如本文所使用的术语“抗体”AB包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体例如双特异性抗体和抗体片段，条件是这些抗体片段展现所期望的生物活性。术语“免疫球蛋白”IG和“抗体”在本文中是互换使用的。0039“分离抗体”是已经从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是将会干扰所述抗体的诊断或治疗应用的材料，并且可包括酶、激素和其它蛋白质类或非蛋白质类组分。在优选实施方案中，抗体1被纯化成大于95重量的抗体，并且最优选地超过99重量，如通过LOWRY法所测定；2被纯化到足以通。
20、过使用转杯式序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或3被纯化成均质，如通过SDSPAGE在还原或非还原条件下并且使用考马斯蓝COOMASSIEBLUE或优选使用银染色法所显示。分离抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，分离抗体通常将通过至少一个纯化步骤制备。0040基本的四链抗体单位是由两个相同轻L链和两个相同重H链构成的异四聚体糖蛋白。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定域CL的氨基酸序列被归类为两个明显不同的类型称为和中的一个。取决于其重链的恒定域CH的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被归类为不同的类别或同型。免疫球蛋白有5个类别。
21、IGA、IGD、IGE、IGG和IGM，其分别具有命名为、和的重链。和类基于CH序列和功能的相对较小差异进一步分成子类，例如，人表达以下子类IGG1、IGG2、IGG3、IGG4、IGA1和IGA2。每个L链都通过一个共价二硫键连接到H链上，而两个H链则通过两个或多个二硫键取决于H链同型彼此连接。每个H和L链也都具有规则间隔的链内二硫桥。每个H链都在N端具有可变域VH，随后是3个恒定域CH对于和链中的每一者来说和4个CH域对于和同型来说。说明书CN104220459A4/25页7每个L链都在N端具有可变域VL，随后是在其另一端的恒定域CL。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一个恒定域CH1对齐。
22、。认为特定氨基酸残基形成轻链可变域与重链可变域之间的界面。VH与VL的配对一起形成单个抗原结合位点。IGM抗体由与额外的被称为J链的多肽在一起的5个基本的异四聚体单位组成，并且因此含有10个抗原结合位点，而分泌型IGA抗体可以聚合形成多价聚集体，所述聚集体包含与J链在一起的25个基本的4链单位。就IGG来说，4链单位通常是约150,000道尔顿。关于不同类别的抗体的结构和性质，例如可以参看BASICANDCLINICALIMMUNOLOGY,第8版,DANIELPSTITES,ABBAITERR和TRISTRAMGPARSLOW编,APPLETONLANGE,NORWALK,CONN,1994。
23、,第71页和第6章。0041术语“可变”是指在抗体之间，V结构域的某些区段在序列上大规模不同。V结构域调节抗原结合并且规定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变域的110个氨基酸的链段之间并不是均匀分布的。实际上，V区是由1530个氨基酸的被称为框架区FR的相对不变的链段组成，所述FR被各自有912氨基酸长的被称为“高变区”的变异性极高的较短区域隔开。天然重链和轻链的可变域各自包含4个FR，所述FR主要采取折叠构形并且由3个高变区连接，所述高变区形成环，所述环连接折叠结构并且在一些情况下形成折叠结构的一部分。每个链中的高变区通过FR紧靠在一起，并且与来自另一条链的高变区一起形成抗体的。
24、抗原结合位点参看KABAT等人,SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST,第5版,PUBLICHEALTHSERVICE,NATIONALINSTITUTESOFHEALTH,BETHESDA,MD1991。恒定域并不直接参与到抗体和抗原的结合中，但是展现各种效应子功能，例如使抗体参与到抗体依赖性细胞毒性ADCC中。0042术语“高变区”在本文中使用时是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基例如，当根据KABAT编号系统编号时，在VL的大约残基2434L1、5056L2和8997L3周围，和在VH的。
25、大约3135H1、5065H2和95102H3周围；KABAT等人,SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST,第5版,PUBLICHEALTHSERVICE,NATIONALINSTITUTESOFHEALTH,BETHESDA,MD1991；和/或来自“高变环”的那些残基例如，当根据CHOTHIA编号系统编号时，VL中的残基2434L1、5056L2和8997L3，和VH中的2632H1、5256H2和95101H3；CHOTHIA和LESK,JMOLBIOL1969019171987；和/或来自“高变环”/CDR的那些残基例如，当根据IMGT编号。
26、系统编号时，VL中的残基2738L1、5665L2和105120L3，和VH中的2738H1、5665H2和105120H3；LEFRANC,MP等人NUCLACIDSRES272092121999,RUIZ,M等人NUCLACIDSRES282192212000。当根据AHOHONNEGER,A和PLUNKTHUN,AJMOLBIOL3096576702001编号时，抗体任选地在一个或多个以下点处具有对称插入物VL中的28、36L1、63、7475L2和123L3，和VH中的28、36H1、63、7475H2和123H3。0043本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体获得的。
27、抗体，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变以外，所述群体中包含的各抗体是相同的。单克隆抗体是高特异性的，其针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性以说明书CN104220459A5/25页8外，单克隆抗体的有利之处还在于其可以在不被其它抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”不应解释为必需通过任何特定方法产生所述抗体。举例来说，可用于本发明的单克隆抗体可以通过由KOHLER等人,NATURE,2564951975首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制得参看例如。
28、美国专利第4,816,567号。“单克隆抗体”也可以使用例如CLACKSON等人,NATURE,3526246281991和MARKS等人,JMOLBIOL,2225815971991中描述的技术从噬菌体抗体文库分离得到。0044本文中的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的对应序列是相同的或同源的，而所述链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的对应序列是相同的或同源的；以及所述抗体的片段，条件是所述片段展现期望的生物活性参看美国专利第4,816,567号；和MORRISON等人,PROCNATLACADS。
29、CIUSA,81685168551984。本发明提供来源于人类抗体的可变域抗原结合序列。因此，本文首要关注的嵌合抗体包括具有一个或多个人类抗原结合序列例如CDR并且含有一个或多个来源于非人抗体的序列例如FR或C区域序列的抗体。此外，本文首要关注的嵌合抗体还包括那些包含一种抗体类别或子类的人类可变域抗原结合序列和来源于另一种抗体类别或子类的另一序列例如FR或C区域序列的抗体。本文关注的嵌合抗体还包括那些含有与本文所描述的那些相关的或来源于不同物种例如非人灵长类动物例如旧世界猴OLDWORLDMONKEY、猿等的可变域抗原结合序列的抗体。嵌合抗体还包括灵长类动物化和人源化抗体。此外，嵌合抗体可以包。
30、含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。这些修饰是用于进一步改善抗体性能。关于进一步的细节，请参看JONES等人,NATURE3215225251986；RIECHMANN等人,NATURE3323233291988；和PRESTA,CURROPSTRUCTBIOL25935961992。0045“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括FAB、FAB、FAB2和FV片段；双价抗体DIABODY；线性抗体参看美国专利第5,641,870号；ZAPATA等人,PROTEINENG810105710621995；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特。
31、异性抗体。短语抗体的“功能片段或类似物”是和全长抗体具有相同定性生物活性的化合物。举例来说，抗IGE抗体的功能片段或类似物是可以以下述方式结合到IGE免疫球蛋白上的化合物，所述方式防止所述分子具有结合到高亲和力受体FCRI上的能力或显著降低所述能力。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段称为“FAB”片段和一个残余“FC”片段所述名称反映了容易结晶的能力。FAB片段由与H链的可变区结构域VH在一起的整条L链和一个重链的第一恒定域CH1组成。每个FAB片段就抗原结合来说都是单价的，即其具有单个抗原结合位点。对抗体的木瓜蛋白酶处理产生单个大的FAB2片段，其大体上对应于具有二价抗原结合活性。
32、的由两个二硫键连接的FAB片段并且能够交联抗原。FAB片段和FAB片段的不同之处在于，在CH1结构域的羧基端具有额外的一些残基，所述残基包括来自于抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。FABSH在本文中是对其中恒定域的半胱氨酸残基具有游离巯基的FAB的命名。FAB2抗体片段最初是作为在其之间具有铰链半胱氨酸的成对FAB片段产生。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。0046“人源化”或“人类”抗体是指其中一个或多个人类免疫球蛋白的恒定区和可变框架区与动物免疫球蛋白的结合区例如CDR融合的抗体。所述抗体被设计成维持结合区所说明书CN104220459A6/25页9来源的非人抗体的结合特异性，但避免针对非人。
33、抗体的免疫反应。所述抗体可以从转基因小鼠或已经被“工程改造”从而可以响应于抗原激发ANTIGENICCHALLENGE而产生特异性人类抗体的其它动物获得参看例如GREEN等人1994NATUREGENET713；LONBERG等人1994NATURE368856；TAYLOR等人1994INTIMMUN6579，其全部教授内容以引用的方式并入本文中。也可以通过在所属领域中都已知的基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术参看例如MCCAFFERTY等人1990NATURE348552553构建完全人类抗体。也可以通过体外激活的B细胞产生人类抗体参看例如美国专利第5,567,610和5,229,27。
34、5号，其以引用的方式全部并入本文中。因此，“灵长类动物化”抗体是指其中一个或多个灵长类动物免疫球蛋白的恒定区和可变框架区与非灵长类动物免疫球蛋白的结合区例如CDR融合的抗体。0047“嵌合抗体”是下述的抗体分子，其中A恒定区或其部分被改变、替换或交换以使得抗原结合位点可变区连接到不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区上，或连接到赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子上，所述分子例如有酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或B可变区或其部分被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。0048“FC”片段包含通过二硫键保持在一起的两个H链的羧基端部分。抗体的效应子功能是由FC区中的序。
35、列决定，所述区域也是被在某些类型的细胞上所发现的FC受体FCR识别的部分。0049“FV”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个片段由非共价紧密结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠获得6个高变环分别从H和L链得到3个环，所述高变环构成用于抗原结合的氨基酸残基并且对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单一可变域或只包含对抗原具有特异性的3个CDR的一半FV也具有识别和结合抗原的能力，虽然其亲和力低于整个结合位点。0050“单链FV”，也缩写成“SFV”或“SCFV”，是包含连接到单一多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，SFV多肽。
36、另外包含在VH和VL结构域之间的多肽连接子，其导致SFV能够形成用于抗原结合的期望结构。关于SFV，请参看PLUCKTHUN,THEPHARMACOLOGYOFMONOCLONALANTIBODIES,第113卷,ROSENBURG和MOORE编,SPRINGERVERLAG,NEWYORK,第269315页1994；BORREBAECK1995,下文。0051术语“双价抗体”是指通过构建SFV片段参看前述段落而制备的小抗体片段，所述SFV片段在VH和VL结构域之间具有短连接子约510个残基，使得V结构域发生链间配对而不是链内配对，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双价抗。
37、体是两个“交叉”SFV片段的异二聚体，其中这两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双价抗体更充分地描述在例如EP404,097；WO93/11161；和HOLLINGER等人,PROCNATLACADSCIUSA,90644464481993中。0052如本文所使用，如果抗体以可检测的水平与抗原反应，优选地以亲和力常数KA大于或等于约104M1、或大于或等于约105M1、大于或等于约106M1、大于或等于约107M1、或大于或等于108M1、或大于或等于109M1、或小于或等于1010M1与抗原反应，那么所述抗体被认为“具有免疫特异性”、对抗原“具有特异性”或“特异性地结合”抗原。抗。
38、体对其同源抗原的亲和力通常也表示成解离常数KD，并且在某些实施方案中，如果抗体以小于或等说明书CN104220459A7/25页10于104M、小于或等于约105M、小于或等于约106M、小于或等于107M、或小于或等于108M、或小于或等于5109M、或小于或等于109M、或小于或等于51010M的KD结合，那么所述抗体特异性地结合抗原。抗体的亲和力可以使用常规技术例如SCATCHARD等人ANNNYACADSCIUSA516601949所描述的技术容易地测定。抗体对其抗原、细胞或组织的结合性质通常可以使用免疫检测方法测定和评定，所述免疫检测方法包括例如基于免疫荧光的分析，例如免疫组织化学I。
39、HC和/或荧光激活细胞分选FACS。0053“分离核酸”是与天然伴随天然序列的其它基因组DNA序列以及蛋白质或复合物例如核糖体和聚合酶基本上分离的核酸。所述术语涵盖已经从其天然存在的环境中取出的核酸序列，并且包括重组或克隆DNA分离物，以及化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的核酸包括核酸的分离形式。当然，这是指原始分离的核酸并且不排除随后人工添加到分离核酸中的基因或序列。0054术语“多肽”以其常规意义使用，即作为氨基酸的序列。多肽不限于特定长度的产物。多肽的定义中包括肽、寡肽和蛋白质，并且除非另外明确说明，否则所述术语在本文中可以互换使用。这个术语也不涉及或排除天然存在。
40、的和非天然存在的对多肽的表达后修饰例如糖基化、乙酰化、磷酸化等以及所属领域中已知的其它修饰。多肽可以是整个蛋白质或其子序列。本发明的上下文中所关注的特定多肽是包含CDR并且能够结合抗原的氨基酸子序列。“分离多肽”是已经从其天然环境的组分中鉴别和分离和/或回收的多肽。在优选实施方案中，分离多肽1被纯化成大于95重量的多肽，并且最优选地超过99重量，如通过LOWRY法所测定；2被纯化到足以通过使用转杯式序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或3被纯化成均质，如通过SDSPAGE在还原或非还原条件下并且使用考马斯蓝或优选使用银染色法所显示。分离多肽包括在重组细胞内的原位多肽，因为。
41、多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，分离多肽通常将通过至少一个纯化步骤制备。0055“天然序列”多核苷酸是和来源于自然界的多核苷酸具有相同的核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是和来源于自然界例如来源于任何物种的多肽例如抗体具有相同的氨基酸序列的多肽。所述天然序列多核苷酸和多肽可以从自然界分离或者可以通过重组或合成方法产生。0056在本文中使用的术语多核苷酸“变异体”是与本文中具体公开的多核苷酸典型地不同的多核苷酸，不同之处在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入。所述变异体可以是天然存在的，或者可以例如通过下述方式合成地产生修饰本发明的多核苷酸序列中的一个或多个并且如本文所描述和/。
42、或使用所属领域中众所周知的多种技术中的任一种评估被编码多肽的一种或多种生物活性。在本文中使用的术语多肽“变异体”是与本文中具体公开的多肽典型地不同的多肽，不同之处在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入。所述变异体可以是天然存在的，或者可以例如通过下述方式合成地产生修饰本发明的以上多肽序列中的一个或多个并且如本文所描述和/或使用所属领域中众所周知的多种技术中的任一种评估多肽的一种或多种生物活性。修饰可以在本发明的多核苷酸和多肽的结构中进行，并且仍然获得编码具有期望特征的变异体或衍生物多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生本发明多肽的等效的或甚至改良的变异体或部分时，所属领域技术人员将。
43、典型地改变编码DNA序列的一个或多个密码子。举例来说，蛋白质结构中的某说明书CN104220459A108/25页11些氨基酸可以被取代成其它氨基酸，而不会导致其结合其它多肽例如抗原或细胞的能力显著丧失。因为是蛋白质的结合能力和性质定义该蛋白质的生物功能活性，所以可以在蛋白质序列进行某些氨基酸序列取代，当然，也可以在其基础DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代，并且仍然获得具有类似性质的蛋白质。因此考虑到可以在所公开的组合物的肽序列中或编码所述肽的对应DNA序列中进行各种改变，而不会导致其生物效用或活性显著丧失。在许多情况下，多肽变异体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”是其中一个氨基酸被取。
44、代成具有类似性质的另一个氨基酸、使得肽化学领域的技术人员将预期该多肽的二级结构和亲疏水性HYDROPATHIC基本上没有变化的取代。如上文概述，氨基酸取代因此通常是基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种上述特征的示例性取代对于所属领域技术人员来说是众所周知的并且包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。氨基酸取代还可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质方面的类似性进行。举例来说，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且携带具有类。
45、似亲水性值的不带电荷的极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以表现保守性变化的其它群组的氨基酸包括1ALA、PRO、GLY、GLU、ASP、GLN、ASN、SER、THR；2CYS、SER、TYR、THR；3VAL、ILE、LEU、MET、ALA、PHE；4LYS、ARG、HIS；和5PHE、TYR、TRP、HIS。变异体也可以或替代性地含有非保守性的变化。在一个优选实施方案中，变异多肽与天然序列的不同之处在于5个或更少氨基酸的取代、缺失或添加。变异体也可以或替代性地通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构。
46、和亲疏水性具有最小影响的氨基酸来进行修饰。0057当用在两种或更多种多肽的序列之间的关系中时，术语“同一性”或“相同”是指多肽之间的序列相关程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的链段之间的匹配数所确定。“同一性”衡量两个或更多个序列中较小序列之间的相同匹配的百分比，其中空位比对如果有的话由特定数学模型或计算机程序即“算法”解决。相关多肽的同一性可以容易地通过已知方法计算。所述方法包括但不限于在COMPUTATIONALMOLECULARBIOLOGY,LESK,AM编,OXFORDUNIVERSITYPRESS,NEWYORK,1988；BIOCOMPUTINGINFORMATICSANDGEN。
47、OMEPROJECTS,SMITH,DW编,ACADEMICPRESS,NEWYORK,1993；COMPUTERANALYSISOFSEQUENCEDATA,第1部分,GRIFFIN,AM和GRIFN,HG编,HUMANAPRESS,NEWJERSEY,1994；SEQUENCEANALYSISINMOLECULARBIOLOGY,VONHEINJE,G,ACADEMICPRESS,1987；SEQUENCEANALYSISPRIMER,GRIBSKOV,M和DEVEREUX,J编,MSTOCKTONPRESS,NEWYORK,1991；和CARILLO等人,SIAMJAPPLIEDMATH。
48、48,10731988中所描述的方法。用于测定同一性的优选方法被设计成提供所测试的序列之间的最大匹配。公众可以得到的计算机程序中描述了测定同一性的方法。用于测定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包包括GAPDEVEREUX等人,NUCLACIDRES2,3871984；GENETICSCOMPUTERGROUP,UNIVERSITYOFWISCONSIN,MADISON,WIS、BLASTP、BLASTN和FASTAALTSCHUL等人,JMOIBIOL215,4034101990。BLASTX程序是公众可以从NATIONALCENTERFORBIOTECHNOLOGYIN。
49、FORMATIONNCBI和其它来源BLASTMANUAL,ALTSCHUL等人,NCB/NLM/说明书CN104220459A119/25页12NIHBETHESDA,MD20894；ALTSCHUL等人,上文获得的。众所周知的SMITHWATERMAN算法也可以用于测定同一性。0058如本文中所使用的“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括人、家养和农场动物、以及动物园动物、竞技动物或宠物动物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选地，哺乳动物是人。0059“治疗TREATING”或“治疗TREATMENT”或“缓解”是指治疗性处理和预防性或防范性措施；其中目的是预防或减缓减轻目标病理病状或病症。需要治疗的那些包括已经患病的那些以及有患病倾向的那些或需要预防病症的那些。如果在根据本发明的方法接受治疗量的抗体之后，受试对象或者哺乳动物显示一种或多种以下情况的可观测的和/或可测量的减少或不存在，那么该患者的感染被成功地“治疗”病原性细胞数目的减少；具有病原性的总细胞的百分比的下降；和/或与具体疾病或病状相关的一种或多种症状在一定程度上缓解；发病率和死亡率的下降；和生活质量的提高。用于评定疾病的成功治疗和改善的以上参数可以通过医师熟悉的常规程序容易地测量。0060术语“治疗有效量。