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1、10申请公布号CN104169297A43申请公布日20141126CN104169297A21申请号201280071324322申请日20120112CBA2011001120111116CBA2011001220111116CBA2011001320111116C07K16/10200601A61P31/16200601G01N33/577200601A61K39/4220060171申请人淡马锡生命科学研究院有限公司地址新加坡新加坡72发明人F和HSJ光74专利代理机构永新专利商标代理有限公司72002代理人左路54发明名称靶向进化枝23的H5流感病毒上的中和表位的单克隆抗体57摘要本。
2、发明涉及靶向进化枝23的H5流感血凝素的主要中和表位的鼠单克隆抗体C、F以及H和其活性片段。本发明还涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其活性片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。本发明另外涉及利用鼠单克隆抗体C、F或H或其片段和互补性鼠单克隆抗体或其活性片段提供通用的针对H5流感病毒的保护的方法和组合物。本发明进一步涉及使用这些鼠单克隆抗体或其片段表征和定量H5表达的方法和组合物。85PCT国际申请进入国家阶段日2014091186PCT国际申请的申请数据PCT/SG2012/0000122012011287PCT国际申请的公布数据WO2013/105896EN2013071883生物保藏信。
3、息51INTCL权利要求书3页说明书21页序列表11页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书21页序列表11页附图1页10申请公布号CN104169297ACN104169297A1/3页21单克隆抗体或抗体片段，其与H5血凝素构象表位特异性结合，其中所述构象表位选自A包含成熟HA蛋白的氨基酸152LYS、184ALA和190PRO的构象表位；B包含成熟HA蛋白的氨基酸152LYS和221GLY的构象表位；以及C包含成熟HA蛋白的氨基酸141PRO和152LYS的构象表位。2如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述H5血凝素的构象表位选自I鼠单克隆。
4、抗体C所特异性结合的A中所述的构象表位；II鼠单克隆抗体F所特异性结合的B中所述的构象表位；以及III鼠单克隆抗体H所特异性结合的C中所述的构象表位。3如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体选自1鼠单克隆抗体C；2鼠单克隆抗体F；以及3鼠单克隆抗体H。4单克隆抗体，其选自A杂交瘤C产生的单克隆抗体C，所述杂交瘤C保藏于CELLBANKAUSTRALIA，保藏号为CBA20110011；B杂交瘤F产生的单克隆抗体F，所述杂交瘤F保藏于CELLBANKAUSTRALIA，保藏号为CBA20110012；C杂交瘤H产生的单克隆抗体H，所述杂交瘤H保藏于CELLBANKAUSTRA。
5、LIA，保藏号为CBA20110013。5检测生物学标本中甲型流感病毒的方法，其包括使所述标本与第一抗体接触，其中所述第一抗体是权利要求14中任一项的单克隆抗体或抗体片段。6如权利要求5所述的方法，其进一步包括使所述标本与第二抗体接触，所述第二抗体与甲型流感病毒H5血凝素表位特异性结合，其中所述第二抗体含有可检测元件或与其缀合。7如权利要求6所述的方法，其中所述第一抗体固定化于固相表面。8如权利要求6所述的方法，其中所述第二抗体含有放射性原子，与荧光分子缀合，或与酶缀合。9如权利要求58中任一项所述的方法，其中所述甲型流感病毒是H5N1流感病毒。10如权利要求9所述的方法，其中所述H5N1流感。
6、病毒是进化枝2家族的H5N1流感病毒。11如权利要求10所述的方法，其中所述H5N1流感病毒是进化枝23的H5N1流感病毒。12如权利要求511中任一项所述的方法，其中将互补性单克隆抗体与所述第一抗体组合使用。13如权利要求12所述的方法，其中所述互补性单克隆抗体是单克隆抗体2D9。14检测生物学标本中甲型流感病毒的试剂盒，其包含第一抗体以及进行检测所述甲型流感病毒的测定的说明书，其中所述第一抗体是权利要求14任一项的单克隆抗体或抗体片段。权利要求书CN104169297A2/3页315如权利要求14所述的试剂盒，其还包含与甲型流感病毒H5血凝素表位特异性结合的第二抗体，其中所述第二抗体含有可。
7、检测元件或与之缀合。16如权利要求14或15所述的试剂盒，其中所述甲型流感病毒是H5N1流感病毒。17如权利要求16所述的试剂盒，其中所述H5N1流感病毒是进化枝2家族的H5N1流感病毒。18如权利要求17所述的试剂盒，其中所述H5N1流感病毒是进化枝23的H5N1流感病毒。19如权利要求1418中任一项所述的试剂盒，其中将互补性单克隆抗体与所述第一抗体组合使用。20如权利要求19所述的试剂盒，其中所述互补性单克隆抗体是单克隆抗体2D9。21包含药剂和药学上可接受的稀释剂或运载体的组合物，其中所述药剂是权利要求14中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段。22包含药剂和药学上可接受的稀释剂或运载体的。
8、组合物，其中所述药剂是权利要求14中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段与至少一种互补性单克隆抗体或其片段的组合。23如权利要求22所述的组合物，其中所述互补性单克隆抗体是鼠单克隆抗体2D9。24减少个体的H5N1流感病毒感染，或降低个体的H5N1流感病毒感染风险，或抑制个体被一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株感染，或预防一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株的流感感染或疾病的方法，其包括给有需要的个体施用治疗有效量的药剂，其中所述药剂是权利要求14中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段。25如权利要求24所述的方法，其中所述个体是免疫功能不全的，是婴儿，是幼儿或是老年人。26如权利要求24所述的。
9、方法，其中所述施用提供治疗效果。27如权利要求26所述的方法，其中所述治疗效果包括A抑制流感病毒效价的增加，B降低流感病毒效价，C抑制流感病毒复制的增加，D降低流感病毒复制，E抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，F降低个体中与流感病毒感染相关的一种或多种症状或并发症的进展、严重性、频率、持续时间或概率，或G加速个体由流感病毒感染康复。28如权利要求27所述的方法，其中症状或并发症选自发冷、发烧、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻窦阻塞、鼻感染、鼻窦感染、身体疼痛、头疼、疲劳、肺炎、支气管炎、耳部感染、耳疼和死亡。29如权利要求2427中任一项所述的方法，其中所述甲型流感病毒是进化枝23的H5N1亚型。
10、。30减少个体的H5N1流感病毒感染，或降低个体的H5N1流感病毒感染风险，或抑制个体被一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株感染，或预防一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株的流感感染或疾病的方法，其包括给有需要的个体施用治疗有效量的药剂，其中所述药剂是权利要求14中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段与至少一种互补性单克隆抗体或抗体片段的组合。31如权利要求30所述的方法，其中所述互补性单克隆抗体是鼠单克隆抗体2D9。权利要求书CN104169297A3/3页432如权利要求30或31所述的方法，其中所述个体是免疫功能不全的，是婴儿，是幼儿或是老年人。33如权利要求30或31所述的方法，其中所。
11、述施用提供治疗效果。34如权利要求33所述的方法，其中所述治疗效果包括A抑制流感病毒效价的增加，B降低流感病毒效价,C抑制流感病毒复制的增加，D降低流感病毒复制，E抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，F降低个体中与流感病毒感染相关的一种或多种症状或并发症的进展、严重性、频率、持续时间或概率，或G加速个体由流感病毒感染康复。35如权利要求34所述的方法，其中症状或并发症选自发冷、发烧、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻窦阻塞、鼻感染、鼻窦感染、身体疼痛、头疼、疲劳、肺炎、支气管炎、耳部感染、耳疼和死亡。36表征和/或定量样品中H5表达的方法，所述方法包括使所述样品与第一抗体接触，所述第一抗体是权利要求。
12、14中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段。37如权利要求36所述的方法，其进一步包括使所述样品与第二抗体接触，所述第二抗体与甲型流感病毒H5血凝素表位特异性结合，其中所述第二抗体含有可检测元件或与其缀合。38如权利要求37所述的方法，其中所述第一抗体固定化于固相表面。39如权利要求37所述的方法，其中所述第二抗体含有放射性原子，与荧光分子缀合，或与酶缀合。40表征和/或定量样品中H5表达的试剂盒，其包含第一抗体以及进行表征和/或定量所述样品中H5表达的测定的说明书，其中所述第一抗体是权利要求14中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段。41如权利要求40所述的试剂盒，其进一步包含与甲型流感病毒H5血凝。
13、素表位特异性结合的第二抗体，其中所述第二抗体含有可检测标记或与之缀合。权利要求书CN104169297A1/21页5靶向进化枝23的H5流感病毒上的中和表位的单克隆抗体0001序列提交0002本申请与电子形式序列表一起提交。序列表的标题为2577210PCTSEQUENCELISTINGTXT，其创建于2012年1月10，大小为26KB。通过引用，将序列表的电子形式的信息全部并入本文。背景技术0003本发明涉及对进化枝23的H5流感血凝素的主要中和表位具有特异性的鼠单克隆抗体C、F和H以及其活性片段。本发明还涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其活性片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。此外，。
14、本发明还涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其片段以及互补性鼠单克隆抗体或其活性片段，提供通用的针对H5流感病毒的保护的方法和组合物。本发明进一步涉及使用这些鼠单克隆抗体或其片段表征和定量H5表达的方法和组合物。0004用于说明本发明的背景或提供关于实践的其他详情的出版物和其他材料通过引用并入本文，并且出于便利，将其分别列于参考文献目录中。0005最近，甲型流感病毒H5N1毒株的出现和其对人造成的高死亡率已引起人们对未来流感大流行的可能性的关注。为了预防另一流行病的爆发，在全球范围内对针对散布性CIRCULATINGH5N1毒株的预防性措施和治疗性措施投入了极大的兴趣和努力。现在的疫苗策略已经受到。
15、流感毒株抗原变异的阻碍。现在的疫苗策略需要抗体的内源性合成，如果发生流行性疾病，无法提供针对H5N1感染的直接保护。目前，获得许可的抗病毒药物包括M2离子通道抑制剂金刚乙胺和金刚胺和神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和扎那米韦。已知H5N1病毒对M2离子通道抑制剂有抗性BIEGELETAL,2005。正分离较新的H5N1病毒毒株，其对神经氨酸酶抑制剂即奥司他韦和扎那米韦也有抗性LEETAL,2008；DEJONGETAL,2005。神经氨酸酶抑制剂要求高剂量和长期治疗DEJONGANDHIEN,2006，增加有害副作用的可能性。因此，用于治疗流感的替代策略是必要的。0006作为治疗许多感染性疾病的可行选。
16、项，考虑过使用单克隆抗体的被动免疫治疗。目前，已经大量关注使用针对流感病毒HA1蛋白的中和抗体的治疗方法。因为该蛋白质位于病毒的表面，因此易于靶向，并且针对这种蛋白质的抗体能够有效中和病毒。因此，针对H5血凝素HA的中和表位的单克隆抗体MAB可能是人主动接种疫苗的有吸引力的备选方案，特别是对于流感感染风险高的个体，即不能很好地响应主动免疫的免疫功能不全的患者或老年人。重要的是，任何MAB产物都应当提供针对传播性H5N1流感毒株的广泛保护，并且应当防止体内的中和逃逸突变体选择。一种提高针对传播性H5N1流感毒株保护和防止逃逸突变体的技术是使用互补性MAB的联合疗法PRABAKARANETAL,2。
17、009。0007需要鉴定靶向进化枝23的H5流感血凝素的主要中和表位的单克隆抗体。还需要鉴定能够用于预防和治疗H5N1流感的单克隆抗体。进一步，需要鉴定能够用于提供通用的针对H5流感病毒的保护的单克隆抗体。还需要鉴定能够用于鉴定、表征和/或定量H5表达的单克隆抗体。说明书CN104169297A2/21页60008发明概述0009本发明涉及靶向进化枝23的H5流感血凝素的主要中和表位的鼠单克隆抗体C、F以及H和其活性片段。本发明还涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其活性片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。本发明另外涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其片段以及互补性鼠单克隆抗体或其活性片段提供。
18、通用的针对H5流感病毒的保护的方法和组合物。本发明进一步涉及使用这些鼠单克隆抗体或其片段表征和定量H5表达的方法和组合物。0010因此，在第一方面，本发明提供对H5流感血凝素的主要中和表位具有特异性的单克隆抗体和其活性片段即抗原结合片段在本文中也称为抗体片段。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素HA的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152LYS、184ALA以及190PRO。在另一实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素的构象表位特异性结合，该构象表位与鼠单克隆抗体C特异性结合。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在另外的实施方案。
19、中，所述单克隆抗体是鼠杂交瘤C产生的鼠单克隆抗体C。0011在其他实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素HA的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152LYS和221GLY。在另一实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素的构象表位特异性结合，该构象表位与鼠单克隆抗体F特异性结合。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠杂交瘤F产生的鼠单克隆抗体F。0012在另外的实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素HA的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸141PRO和152LYS。在另一实。
20、施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素的构象表位特异性结合，该构象表位与鼠单克隆抗体H特异性结合。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠杂交瘤H产生的鼠单克隆抗体H。0013在另一实施方案中，本发明提供编码本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。在一实施方案中，所述核酸编码鼠单克隆抗体C或其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述核酸编码鼠单克隆抗体F或其抗原结合片段。在另外的实施方案中，所述核酸编码鼠单克隆抗体H或其抗原结合片段。在一实施方案中，本发明提供包含所述核酸的载体。在另一实施方案中，本发明提供包含并表达所述载体的细胞。0014。
21、在第二方面，本发明提供使用本文所述的鼠单克隆抗体或其片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。在一实施方案中，本发明提供包含本文所述的单克隆抗体和药学上可接受的稀释剂或运载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另外的实施方案中，所述药物组合物包含本文所述的单克隆抗体的抗原结合片段和药学上可接受的稀释剂或运载体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段是鼠单克隆抗体C的抗原结合片段。在其他实施方案中，所述抗原结合片段是鼠单克隆抗体F的抗原结合片段。在另外的实施方案中，所述。
22、抗原结合片段是单克隆抗体H的抗原结合片段。在另外的实施方案中，所述药物组合物包含编码所述抗体或抗体片段的核酸分子和药学上可接受的稀释剂或运载体。在另外的实施方案中，所述药物组合物包含载体和药学上可接受的稀释剂或运载体，所述载体包含所述核酸。在另一实施方案中，说明书CN104169297A3/21页7所述药物组合物包含表达所述载体的细胞和药学上可接受的稀释剂或运载体。在另外的实施方案中，所述药物组合物包含编码所述抗体或抗体片段的核酸分子和药学上可接受的稀释剂或运载体。在另一实施方案中，所述药物组合物包含载体和药学上可接受的稀释剂或运载体，所述载体包含所述核酸。在另一实施方案中，所述药物组合物包含。
23、表达所述载体的细胞和药学上可接受的稀释剂或运载体。0015在一实施方案中，本发明提供减少个体的H5N1流感病毒感染或降低个体中H5N1流感病毒感染风险，抑制个体被进化枝23的一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株感染，或预防进化枝23的一种或多种H5N1流感病毒毒株或分离株的流感感染或疾病的方法。在该实施方案中，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的本文所述的单克隆抗体其抗原结合片段、包含编码所述抗体或抗体片段的多核苷酸的核酸分子、包含所述多核苷酸的载体或表达所述载体的细胞。在一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中。
24、，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在一实施方案中，所述个体是免疫功能不全的，是婴儿，是幼儿或是老年人。在另一实施方案中，施用提供了治疗效果。在另外的实施方案中，治疗效果包括抑制流感病毒效价的增加，降低流感病毒效价，抑制流感病毒复制的增加，降低流感病毒复制，抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，或降低个体中与流感病毒感染相关的一种或多种症状或并发症的进展、严重性、频率、持续时间或概率。在一实施方案中，症状或并发症选自发冷、发烧、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻窦阻塞、鼻感染、鼻窦感染、身体疼痛、头疼、疲劳、肺炎、支气管炎、耳部感染、耳疼和死亡。在另一实施方案中，所述治疗效果包括加速个体由H5N1流感病。
25、毒感染康复。在另外的实施方案中，给所述个体施用的药剂在个体感染H5N1流感病毒之前、基本上同时或之后施用。0016在一实施方案中，在预防和治疗H5N1流感的方法和组合物中，本文所述的鼠单克隆抗体或其片段与至少一种互补性单克隆抗体或其抗体片段结合使用。根据该实施方案，互补性MAB的使用提高了针对H5N1流感病毒传播毒株的保护并防止逃逸突变。在一些实施方案中，在所述方法和组合物中，本文所述的第一鼠单克隆抗体或其活性片段与第二互补性鼠单克隆抗体或其活性片段使用结合。在一实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体C。在另一实施方案中，所述第一鼠单克隆抗体是单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述第一鼠。
26、单克隆抗体是单克隆抗体H。在一实施方案中，所述第二互补性鼠单克隆抗体是鼠单克隆抗体2D9。除了所述方法和组合物使用互补性单克隆抗体或其片段之外，如本文所述的组合物和方法是关于单个单克隆抗体或其片段的。0017在第三方面，本发明提供使用本文所述的单克隆抗体或其片段，表征和/或定量样品中H5表达的方法和组合物。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在一实施方案中，H5表达涉及H5N1流感病毒HA的表达。在一实施方案中，所述组合物包含本文所述的单克隆抗体或其片段。在一些实施方案中，所述单。
27、克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另一实施方案中，所述方法包括检测H5与本文所述的单克隆抗体或其片段的结合。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所说明书CN104169297A4/21页8述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在一实施方案中，本发明涉及涉及免疫荧光测定IFA、免疫组织化学测定和利用这类结合蛋白的其他方法，包括ELISA、血细胞凝集抑制HI测定和病毒中和VN测定。0018在第四方面，本发明提供用于检测生物学标本。
28、中甲型流感病毒的试剂盒和方法。在一实施方案中，所述检测涉及H5N1流感病毒的检测。在另一实施方案中，所述检测涉及进化枝2家族H5N1流感病毒的检测。在另外的实施方案中，所述检测涉及进化枝23的H5N1流感病毒的检测。在一实施方案中，所述方法包括使标本与第一抗体接触，所述第一抗体是本文所述的单克隆抗体或其抗体片段。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体H。在另一实施方案中，所述方法还包括使所述标本与第二抗体接触，所述第二抗体与甲型流感病毒H5血凝素的表位特异性结合，其中所述第二抗体含有可。
29、检测元件或与之缀合。在一些实施方案中，所述第二抗体含有放射性原子，与荧光分子缀合，或与酶缀合。在其他实施方案中，将第一抗体固定化于固相表面。0019在一实施方案中，所述试剂盒包含第一抗体和用于进行检测甲型流感病毒的测定的说明书，所述第一抗体是本文所述单克隆抗体或其抗体片段。在一实施方案中，所述试剂盒涉及H5N1流感病毒的检测。在另一实施方案中，所述试剂盒涉及进化枝2家族的H5N1流感病毒的检测。在另外的实施方案中，所述试剂盒涉及进化枝23的H5N1流感病毒的检测。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在其他实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体F。在另外的实施方案中，所述单克隆抗。
30、体是鼠单克隆抗体H。在另一实施方案中，所述试剂盒还包括与甲型流感病毒H5血凝素的表位特异性结合的第二抗体，其中所述第二抗体含有可检测元件或与之缀合。在一些实施方案中，所述第二抗体含有放射性原子，与荧光分子缀合，或与酶缀合。在其他实施方案中，将所述第一抗体固定化于固相表面。附图说明0020图1显示在安徽H5感染的MDCK细胞中，MABC、F或H针对H5毒株的反应性，所述反应性用IFA测定。用MAB或PBS，和二抗对感染并固定的细胞进行，所述二抗是抗小鼠FITC。0021发明详述0022本发明涉及靶向进化枝23的H5流感血凝素的主要中和表位的鼠单克隆抗体C、F以及H和其活性片段。本发明还涉及使用鼠。
31、单克隆抗体C、F或H或其活性片段预防和治疗H5N1流感的方法和组合物。本发明另外涉及使用鼠单克隆抗体C、F或H或其片段以及鼠单克隆抗体2D9或其活性片段，提供通用的针对H5流感病毒的保护的方法和组合物。本发明进一步涉及使用这些鼠单克隆抗体或其片段表征和定量H5表达的方法和组合物。0023“分离的”表示生物分子不含至少一些天然状态下与其一起存在的组分。0024本文所用的术语“抗体ANTIBODY”或“抗体ANTIBODIES”是本领域公认的术语，并且理解为指与已知抗原结合的分子或分子的活性片段，特别是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合的结合位点的分子。免疫球蛋。
32、白是包含一条或多条多肽的蛋白质，所述多肽基本上由免疫球蛋白和、说明书CN104169297A5/21页9以及恒定区基因以及各种各样的免疫球蛋白可变区基因编码。轻链分为或。重链分为、或，其依次分别限定免疫球蛋白的类别IGG、IGM、IGA、IGD和IGE。重链的亚类也是已知的。例如，人IGG重链可以是IGG1、IGG2、IGG3和IGG4亚类中的任意一个。本发明的免疫球蛋白可以是任何类别IGG、IGM、IGD、IGE、IGA以及IGY或亚类IGG1、IGG2、IGG3、IGG4、IGA1以及IGA2的免疫球蛋白分子。0025提到抗体时，本文所用的“特异性结合”表示抗体与靶抗原结合的亲和性比其与不。
33、同结构的抗原结合的亲和性更大。0026已知典型的免疫球蛋白结构单元包含四聚体。每一四聚体由两对相同的多肽链构成，每一对具有一条“轻”链约25KD和一条“重”链约5070KD。每一条链的N末端约100110或更多个主要负责抗原识别的氨基酸定义为可变区。术语可变轻链VL和可变重链VH分别指这些轻链和重链。0027抗体作为全长完整抗体或作为用各种肽酶或化学制品消化而产生的若干充分表征的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在铰链区二硫键下方消化抗体，从而产生FAB2，其是FAB二聚体，所述FAB自身是通过二硫键与VHCH1连接的轻链。FAB2可以在温和条件被还原，破坏铰链区的二硫键，从而将FAB2二聚体转化为。
34、FAB单体。FAB单体实质上是具有部分铰链区的FAB片段有关其他抗体片段的更详细描述，参见FUNDAMENTALIMMUNOLOGY,WEPAUL,ED,RAVENPRESS,NY1993。尽管根据完整抗体的消化，定义了各种抗体片段，但是本领域技术人员会理解可以通过化学方法或利用重组DNA方法重新合成各种抗体片段中的任何片段。因此，本文所用的术语抗体还包括通过全抗体的修饰所产生的或重新合成的抗体片段或使用重组DNA方法获得的抗体和片段。0028在本发明的范围内“抗体”是要包括嵌合或人源化单克隆抗体以及其活性片段。与已知抗原结合的分子的活性片段的实例包括分开的轻链和重链，FAB、FAB/C、FV。
35、、FAB以及FAB2片段，包括FAB免疫球蛋白表达文库的产物和上述任何抗体和片段的表位结合片段。0029可以通过许多技术由本发明的抗体衍生这些活性片段。例如，可以利用酶如胃蛋白酶裂解单克隆抗体，并进行HPLC凝胶过滤。接着可以收集含有FAB片段的合适流分并通过膜过滤等进行浓缩。用于分离抗体活性片段的通用技术的进一步描述，参见例如KHAWETAL1982；ROUSSEAUXETAL1986。0030重组制备的抗体可以是常规的全长抗体、已知的来自蛋白水解消化的活性抗体片段、独特的候选抗体片段如FV或单链FVSCFV、结构域删除的抗体等。FV抗体的大小约为50KD，包含轻链和重链的可变区。单链FV“。
36、SCFV”多肽是共价连接的VHVL异二聚体，其可以由核酸表达，所述核酸包括直接连接的或通过编码肽的接头连接的VH和VL编码序列。参见HUSTONETAL1988。用于将抗体V区的天然聚集的但是在化学上分离的轻多肽链和重多肽链转化为SCFV分子的许多结构，会折叠成基本上与抗原结合位点结构相似的三维结构。参见例如美国专利第5,091,513号、第5,132,405号和第4,956,778号0031结合部位COMBININGSITE指抗体分子的参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重“H”链和轻“L”链N末端可变“V”区的氨基酸残基形成。抗体可变区包括三个称为“高变区”或“互补决定区CDR”高度不同的段。
37、，它们插入更保守的称为“框架区”FR的侧翼段之间。在抗体分子中，轻链的三个高变区LCDR1、LCDR2以及LCDR3和说明书CN104169297A6/21页10重链的三个高变区HCDR1、HCDR2以及HCDR3在三维空间中彼此相关排列，形成抗原结合表面或口袋POCKET。因此抗体的结合部位代表构成抗体的CDR的氨基酸和构成结合位点口袋的任何框架残基。0032具体抗体中构成结合部位的氨基酸残基的相同性，可以使用本领域熟知的方法测定。参见例如美国专利申请公开第2010/0080800号。具体抗体中的氨基酸残基的相同性，可以使用本领域熟知的方法如分子建模和X射线晶体学测定，所述氨基酸残基位于CD。
38、R外，但是具有作为结合部位内层LINING的一部分的侧链，从而构成所述结合部位的一部分即其对于通过结合部位连接是可行的。参见例如RIECHMANNETAL1988。0033嵌合抗体是这样的抗体，其中抗体的一个或多个区域来自一个动物物种且抗体的一个或多个区域来自不同的动物物种。优选的嵌合抗体是包括灵长类免疫球蛋白的区域的抗体。用于人临床用途的嵌合抗体，通常理解为具有来自非人动物如啮齿类的可变区和来自人的恒定区。相比之下，人源化抗体使用来自非人抗体的CDR，而其大部分或所有可变框架区和所有恒定区来自人免疫球蛋白。人嵌合抗体通常理解为具有来自啮齿类的可变区。典型的人嵌合抗体具有人肿瘤恒定区和人轻链恒。
39、定区，重链和轻链的可变区来自啮齿类抗体。嵌合抗体可以包括人恒定区天然氨基酸序列和天然啮齿类可变区序列的某些变化。嵌合抗体和人源化抗体可以通过本领域熟知的方法制备，包括CDR移植方法参见例如美国专利第5,843,708号、第6,180,370号、第5,693,762号、第5,585,089号、第5,530,101号、链替换策略参见例如美国专利第5,565,332号；RADERETAL1998、分子建模策略美国专利第5,639,641号等。0034在双链抗体的情况下，本文所用的“人源化抗体”是至少一条链人源化的抗体。人源化抗体链具有其中一个或多个框架区是人框架区的可变区。单链人源化抗体是链中具有可。
40、变区的抗体，所述可变区的一个或多个框架区是人框架区。人源化抗体链或其片段的可变区的非人部分源自非人来源，特别是非人抗体，通常是啮齿类来源。人源化抗体的非人部分通常是至少一个散布于源自一个或多个人免疫球蛋白的框架区之间的CDR区。另外，可以改变框架支持残基，以维持结合亲和性。0035人源化抗体还可以包含恒定区例如，在轻链的情况下，至少一个恒定区或其一部分，且在重链的情况下优选三个恒定区。如果存在，人源化抗体的恒定区通常是人恒定区。获得“人源化抗体”的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如，美国专利申请公开第2010/0080800号。0036本文所用的术语恒定区CR指免疫球蛋白恒定区基因。所述恒。
41、定区基因编码抗体分子的赋予效应子功能的一部分。对于嵌合人抗体和人源化抗体而言，通常以人恒定区取代非人例如鼠恒定区。所述嵌合抗体或人源化抗体的恒定区通常源自人免疫球蛋白。所述重链恒定区可以选自五种同种型中的任意一种、或。此外，各种亚类的重链例如重链的IGG亚类负责不同的效应子功能，因此，通过选择想要的重链恒定区，可以产生具有想要的效应子功能的抗体。可以用于本发明范围内的恒定区是1IGG1，特别是1IGG1同种型的FC区，3IGG3以及特别是4IGG4。所述轻链恒定区是或类型，优选地，是类。在一实施方案中，所述轻链恒定区是人恒定链HIETERETAL1980，所述恒定重链是人IGG4恒定链。003。
42、7本文所用的术语可变区VR指抗体的每对轻链和重链中直接参与抗体与抗原的说明书CN104169297A107/21页11结合的结构域。每一重链在一端具有可变结构域VH随后是一些恒定结构域。每一轻链在一端具有可变结构域VL，并在其另一端具有恒定结构域；所述轻链的恒定结构域与所述重链的第一恒定结构域对齐，且所述轻链可变结构域与所述重链的可变结构域对齐。0038本文所用的术语框架区FR指抗体轻链和重链可变区内的一个或多个框架区参见KABATETAL1992；JOHNSONANDWU2001；HTTPCOLONBACKSLASHBACKSLASHIMMUNODOTBMEDOTNWADOTEDU。这些表述。
43、包括插入抗体轻链和重链可变区内CDR之间的氨基酸序列区。0039根据标准序列定义KABATETAL1992和结构定义如在CHOTHIAANDLESK1987中，确定CDR和FR残基。如果这两种方法导致CDR的鉴定稍微不同，则优选结构定义，但是通过序列定义方法鉴定的残基被视为用于确定将哪个框架区残基输进共有序列的重要FR残基。0040术语“单克隆抗体”是本领域公认的，指一种抗体，其是产生单一克隆的抗体的细胞的产物。单克隆抗体通常通过将正常的短期存活的产抗体B细胞与快速生长的细胞如癌细胞有时称为“永生”细胞融合而制备。所得的杂合细胞或杂交瘤快速繁殖，从而生成产生抗体的克隆。0041术语“片段”指抗。
44、体或抗体链的、所包含的氨基酸残基比完整或全长抗体或抗体链少的部分PART或部分PORTION。可以通过对完整或完全抗体或抗体链进行化学处理或酶促处理获得片段。还可以通过重组方式获得片段。片段的实例包括FAB、FAB、FAB2、FABC和/或FV片段。术语“抗原结合片段”指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其与抗原结合，或在抗原结合即特异性结合方面与完整抗体即与衍生所述抗原结合片段的完整抗体竞争。结合片段通过重组DNA技术或通过酶促或化学裂解完整免疫球蛋白而产生。结合片段包括FAB、FAB、FABSUB2、FABC、FV、单链以及单链抗体。0042免疫原性降低的人源化抗体指相对于亲本抗体，例如，鼠抗体。
45、，表现出免疫原性降低的人源化抗体。0043基本上保留了亲本抗体的结合特性的人源化抗体指，保留了与抗原特异性结合的能力的人源化抗体，用于产生这类人源化抗体的亲本抗体识别所述抗原。优选地，所述人源化抗体会表现出与亲本抗体相同或基本上相同的抗原结合亲和性和亲和力。理想地，所述抗体的亲和性不少于亲本抗体亲和性的10，更优选地，不少于约30，以及最优选地，亲和性不少于亲本抗体的50。测定抗体亲和性的方法是本领域熟知的，包括半最大结合测定、竞争测定以及斯卡查德分析。0044术语“互补性单克隆抗体”指这样一些单克隆抗体，其中一个MAB与特定抗原的一部分相互作用而其他MAB能够与所述特定抗原的剩余部分或不止剩。
46、余部分相互作用。互补对在诊断或治疗中充当特定抗原如H5N1的通用试剂。两个MAB的活性范围ACTIVEELD可以具有重叠区，但是不相同。互补性抗H5单克隆抗体的实例由PRABAKARANETAL2009描述。互补性抗H5单克隆抗体的另一实例由HEETAL2010描述。0045此外，术语“治疗有效量”指当给人或动物施用抗体时足以在所述人或动物中导致治疗效果的抗体的量。按照常规程序，本领域技术人员会容易地确定所述有效量。0046本文所用的术语“治疗TREAT”、“预防PREVENT”、“预防PREVENTING”以及“预防PREVENTION”指由于施用预防剂或治疗剂而防止个体的病症的一个或多个症。
47、状的说明书CN104169297A118/21页12复发或发作。0047通过表位作图，本申请描述对一组抗进化枝23的H5的中和MAB的各自表位的表征。本申请还描述对这些MAB在抑制血细胞凝集和中和病毒方面治疗功效的评估。本申请进一步描述确定这些MAB与MAB2D9一起针对不同进化枝的H5N1病毒的通用的治疗功效。在本发明之前，当前可用的MAB针对进化枝23的H5流感病毒的中和效价低。现有MAB的针对进化枝23的H5流感病毒的中和效价低的问题通过本发明的MAB，即针对进化枝23的H5流感病毒的中和效价高的MABC、F以及H，得到解决。这些MAB在IFA、ELISA、HI以及病毒中和中与进化枝23。
48、的H5流感病毒有效反应。鉴于它们有效中和进化枝23和几个其他进化枝的H5流感病毒，本发明的MAB能够构成通用的治疗性单克隆抗体对的一部分，所述通用治疗性单克隆抗体对提供的保护比目前通用的治疗性MAB对更好。另外，本发明的MAB靶向进化枝23的H5病毒上的新的中和表位。如本文所示，MABC、F以及H都显示出比MAB2D9更高的对进化枝23的H5N1流感病毒反应性，且MABC、F以及H各自对进化枝23的H5N1流感病毒的反应性都显示比对其他进化枝的病毒的反应性更高。鉴于MABC、F以及H的这些特征，这三种MAB的主要用途都是与2D9形成互补性MAB对，用于通用性检测或治疗。0048在第一方面，本发。
49、明提供对H5流感血凝素的主要中和表位具有特异性的单克隆抗体和其活性片段即抗原结合片段在本文中也称为抗体片段。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素HA的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152LYS、184ALA以及190PRO。在另一实施方案中，所述单克隆抗体或其片段与H5血凝素的构象表位特异性结合，所述构象表位与鼠单克隆抗体C特异性结合。在另外的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠单克隆抗体C。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是属杂交瘤C产生的鼠单克隆抗体C。鼠杂交瘤C于2011年11月16日根据布达佩斯条约保藏于CELLBANKAUSTRALIA,214HAWKESBURYROAD,WESTMEADNSW2145,AUSTRALIA，保藏号为CBA20110011。本发明还涉及产生鼠单克隆抗体C的鼠杂交瘤。在另一实施方案中，所述单克隆抗体是嵌合或人源化单克隆抗体。特别是，所述嵌合或人源化单克隆抗体与H5血凝素的构象表位特异性结合，所述构象表位与鼠单克隆抗体C特异性结合。在一实施方案中，单克隆抗体鼠单克隆抗体或嵌合或人源化单克隆抗体或其片段与H5血凝素HA的构象表位特异性结合，其中所述构象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152LYS、184ALA以及1。