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1、10申请公布号CN104211779A43申请公布日20141217CN104211779A21申请号201310211868122申请日20130530CCTCCNOM201243820121030C07K7/64200601C12P21/04200601A61K38/12200601A61P35/00200601C12R1/88520060171申请人福州大学地址350002福建省福州市鼓楼区工业路523号72发明人陈立钟萍夏其文张其清74专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊54发明名称一种杂环棘孢肽类化合物及其制备方法和用途57摘要本发明涉及一种杂环棘孢肽类化合。
2、物及其制备方法和用途。其结构特征是含有六个甲基丙氨酸残基、一个缬氨酸残基、一个异亮氨酸残基、一个丙氨酸残基、且其中一个甲基丙氨酸残基和N端的脯氨醇残基成环。通过发酵培养棘孢木霉TRICHODERMAASPERELLUM，获取菌丝体内代谢产物的粗提物，从中分离纯化出该化合物。目前尚未见该化合物的化学结构及癌细胞增殖抑制活性的报道，经试验证实，该化合物可作为癌细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页10申请公布号CN104211779ACN104211779A1/1页21化合物。2一种如。
3、权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于发酵培养棘孢木霉TRICHODERMAASPERELLUM，获取菌丝体内代谢产物的粗提物，从中分离纯化出该化合物；所述棘孢木霉TRICHODERMAASPERELLUM为棘孢木霉TRICHODERMAASPERELLUMIBPT2，已于2012年10月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCNOM2012438。3权利要求1所述的化合物在制备癌细胞增殖抑制剂中的用途。4根据权利要求3所述化合物的用途，其特征在于所述癌细胞为人肺癌细胞SPCA1。5权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。权利要求书CN104211779A1/5页3。
4、一种杂环棘孢肽类化合物及其制备方法和用途技术领域0001本发明一种杂环棘孢肽类化合物及其制备方法和用途。背景技术0002杂环棘孢肽类化合物HETEROCYCLICPEPTIDES属于线性肽类化合物，常被报道具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒等。本发明人研究得知，棘孢木霉TRICHODERMAASPERELLUMIBPT22012年10月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCNOM2012438菌丝体内代谢产物的粗提物有较好的癌细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现所示杂环棘孢肽类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的。
5、报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。发明内容0003本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的杂环棘孢肽类化合物及其制备方法和用途，该化合物具有抑制癌细胞增殖活性。其结构式为。0004其结构特征是含有六个甲基丙氨酸残基、一个缬氨酸残基、一个异亮氨酸残基、一个丙氨酸残基、且其中一个甲基丙氨酸残基和N端的脯氨醇残基成环。0005本发明还提供了所述化合物的制备方法发酵培养棘孢木霉TRICHODERMAASPERELLUM，获取菌丝体，进行破碎萃取处理后，得到菌丝体内代谢产物粗提物，然后从粗提物中分离纯化出该化合物。0006所述棘孢木霉TRICHODERMAASPERELLUM为棘孢木霉TRICH。
6、ODERMAASPERELLUMIBPT2，已于2012年10月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏编号是CCTCCNOM2012438。0007本发明还保护了所述的化合物在制备癌细胞增殖抑制剂中的用途。所述癌细胞优选为人肺癌细胞SPCA1。及该化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。0008本发明的显著优点研究所示杂环棘孢肽类化合物属于活性线性小肽类化合物。所述杂环棘孢肽类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。具体实施方式0009在如下的实施例中所指的化合物的化学结构说明书CN104211779A2/。
7、5页4实施例1该化合物的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，取棘孢木霉TRICHODERMAASPERELLUM2012年10月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCNOM2012438适量，接种到PDA固体斜面培养基上在28培养箱中培养4天。0010取斜面培养4天的菌株适量，接种到装有400ML培养液培养基组成克/升甘露醇200，酵母膏30，麦芽糖200，味精100，葡萄糖100，KH2PO405，MGSO403的1000ML锥形瓶中，28静止培养30天后，分别获得菌丝体和发酵液。00112浸膏的获得发酵完成后，用纱布将菌丝体和发酵液。
8、分离。用含丙酮与水41的溶液浸泡溶解菌丝体细胞壁，辅与超声破碎，用多层纱布过滤得到菌丝体的丙酮粗提物。菌丝体破碎后得到的丙酮粗提物旋转蒸发除去丙酮，直至剩下粗提物的水溶液。按体积比为12加入乙酸乙酯，连续萃取两遍，合并后减压浓缩至干，得到菌丝体内代谢产物的乙酸乙酯浸膏。00123化合物的分离精制该浸膏通过100200目硅胶拌样后，以石油醚二氯甲烷甲醇为洗脱液进行减压硅胶色谱柱梯度洗脱。洗脱液经过活性跟踪（对人黑色素瘤细胞株A375抑制），得到活性组分B二氯甲烷甲醇V/V1001洗脱物，然后以石油醚二氯甲烷甲醇梯度组分为洗脱液，进一步通过加压硅胶柱层析，得到的活性亚组分B2二氯甲烷甲醇为501的。
9、洗脱物进一步通过加压硅胶柱层析后，得到的组分B22通过氯仿甲醇V/V21为溶剂进行SEPHADEXLH20凝胶柱层析，再经过RP18反相硅胶柱层析以甲醇水V/V11为溶剂洗脱，最后通过半制备液相色谱1010型ODSA,10250MM,5M分离流速为5MLMIN1，流动相为50乙腈，得到所示化合物（482MG，TR1674MIN）。0013化合物无色晶体，正离子HRESIMSM/Z9575743MNA，分子式C45H78N10O11；413C01,MEOH；ESIMS/MSM/Z934，892，807，722，623，537，424，339；ESIMS/MSM/Z958MNA，830，745，6。
10、74，589，504，391，306；1H和13CNMR等NMR数据见表1。0014表1化合物的1H和13CNMR数据500和125MHZ，INDMSOD61说明书CN104211779A3/5页5说明书CN104211779A4/5页61本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMQC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定。00152此栏中的数字和代号分别代表在1H1HCOSY谱中与相应行中的1H给出耦合相说明书CN104211779A5/5页7关信号的1H核。00163此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出耦合相关信号的13C核。00174此栏中的AAIB，VV。
11、AL，IILE，ALALA。0018实施例2体外抗肿瘤活性的测试1实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，加入50LDMSO，紫外照射一小时后，加入950L含有10FBS的细胞培养液，得到了含有5DMSO的1MGML1样品原液。用细胞培养液进行稀释，分别得到浓度为01、005、002、001MGML1的样品。0019细胞系及细胞的继代培养采用细胞为人肺癌细胞SPCA1细胞系。细胞用含10FBS的RPMI1640培养基，在37于通入5二氧化碳的培养箱中继代培养。0020细胞增殖抑制活性测试方法取处于对数生长期的肿瘤细胞，用含10FBS的培。
12、养液稀释，将细胞密度调至每毫升2105的细胞悬液。在96孔板四周铺满PBS缓冲液，再把细胞悬液按每孔100L接种于96孔板中，留两个不加细胞悬浊液，只加细胞培养液作为给药组与对照组的空白孔。将接种完的96孔板放入37C，5CO2的培养箱中培养24H。待细胞贴壁后，吸去上清，每孔加入稀释好的样品100L，设置5DMSO溶液的培养基作为对照组继续培养24H。小心吸去上清液，每孔加1MGML1的MTT溶液100L，37培养4小时后，每分钟2000转离心8分钟，用移液枪小心吸去上清液。每孔加入DMSO100L，37摇床振荡，至结晶完全溶解后，酶标仪测定570NM处测每孔OD值。取四孔平均OD值，按细胞增殖抑制率IROD对照OD样品/OD对照100计算，根据BLISS法计算样品半数抑制率IC50。00212实验结果细胞增殖抑制活性测试结果在MTT法测试中，该化合物对人肺癌细胞SPCA1细胞株的增殖抑制活性较强，其IC50值为202M3结论化合物具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，可作为制备癌细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。0022说明书CN104211779A。