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改良低温乙醇人血丙种球蛋白生产工艺
    本发明涉及蛋白质的分离、提纯工艺方法，具体涉及人血丙种球蛋白的生产工艺，特别涉及传统低温乙醇人血丙种球蛋白生产工艺方法改良。

    自Cohn等人创立低温乙醇人血浆蛋白分段分离的第5法和第6法后，Oncley等人于1944年又建立了将Cohn组分II+III进一步分段分离的第9法(又称为Oncley法)，1945年Deutsch等改进了第9法中从组分II+III回收丙球的工艺并用于工业化生产，该改良工艺称为Deutsch法，1954年Nitschmann用Deutsch法从改良第10法的沉淀A(相当于组分II+III)中制备丙球，后来Kistler又对Nitschmann法进行了改良并于1962年发表。在以后的三十多年中，Cohn氏9法、Deutsch法和Kistler法则成为生产丙球的常规工艺。但这些工艺仍存在一些不足，如生产的丙球制品经常出现稳定性较差，自然裂解和聚合等质量问题，因此有必要对传统常规丙球生产工艺进行改进。

    本发明的目的在于建立一条制备可靠质丙球制品的改良低温乙醇人血丙种球蛋白生产工艺。

    本发明的目的采用如下工艺实施：

    通过反复实验和长期生产实践，认识到PH，乙醇浓度，温度，离子强度，蛋白质浓度五因素是影响丙球蛋白回收率及质量的主要因素。寻找到一条达到本发明目的的工艺路线及工艺参数，该工艺过程用去冷沉淀血浆分离出的组分I+II+III沉淀为原料，该沉淀经过48小时以上冷冻后，经分离组分I，再分离组分III，组分II上清经深滤得到组分沉淀再经溶解深滤，浓缩制得精制丙球蛋白。其具体工艺过程为：

    A、分离组分I的其条件为：0.01MNaAc-0.0056MNa₂HPO₄溶液10倍溶解，PH7.6±0.1，温度0～-2℃，离子强度0.033，蛋白质2.5％，经离心分离得组分I上清及组分I沉淀。

    B、分离组分III的条件为：组分I上清等倍冰水稀释，PH5±0.05，乙醇17％，温度-4℃，离子强度0.014，蛋白质0.8％，经离心分离得组分III上清及组分III沉淀。

    C、组分III上清深滤的条件为：1MNaHCO₃调至PH5.5±0.1，降温至-7--8℃，0.5％硅藻土深滤得组分III深滤液。

    D、分离组分II的条件为：PH7.2，乙醇25％，温度-7℃，离子强度0.05，蛋白质0.4％，经离心分离得组分II沉淀及组分II上清(弃)。

    E、组分II沉淀溶解、过滤的条件为：4倍冰水溶解，温度0-2℃，0.5％硅藻土，深滤得滤液。

    F、E步骤深滤液超滤：脱醇、浓缩。

    G、超滤浓缩液调PH6.5±0.1，加甘氨酸0.3M后除菌。

    H、分装：10％丙球溶液。

    图面说明：

    图1为本发明的工艺流程图。

    图2为本发明的丙球蛋白层析图谱。

    本发明的制品经电泳纯度分析及气相、液相色谱等各项分析，与传统工艺对比结果列于表1、表2及图2。

           表1：几种工艺丙球回收率及提取率比较

       分离方法  回收率(％)提取率(克/升)Kistler-Nittschmann法Hao简化法本发明为蛋白的9.8％         48.5           80    5.2    2.8    4.7

                    表2：丙球的主要质量与Cohn5法比较

     比较项目    10％丙球溶液(n＝23)  本  工  艺    Cohn9法PH值57℃水浴热稳定性(hr)多聚体含量(％)电泳纯度(％)裂解程度(TCA法OD值)纤溶酶活性(IU/ml)    6.5±0.1    4小时后混浊    1.24±0.38    ＞98    ＜0.04    ＜0.003    6.4-7.4    4小时后凝胶化    4.22±0.89    ＞95    ＞0.5    ＞0.05

    从图表的结果可见，本发明的工艺具有以下特点：1丙球蛋白回收率为80％，提取率4.7克/升血浆。2、产品质量好，电泳纯度在98％以上，特别是热稳定性非常好，多聚体含量低，纤溶酶活性仅为Cohn9法的6％以下，而裂解程度仅为Cohn9法的8％以下，也就是说，本发明工艺制得的丙球几乎无裂解。3、生产周期短，从投料到超滤分离工序只要三天时间。4、易掌握，本工艺操作难度小，工参参数易掌握，批次重复性好。5、成本低，本工艺的综合生产成本较传统方法低。6、有利于血浆的综合利用。

    下面结合实施例进一步说明本发明：

    实施例1：

    (1)组分I+II+III沉淀25Kg加0.01M NaAc-0.0056M Na₂HPO₄溶液溶解至250升，调整PH为7.6±0.1，温度0--2℃，离心去除组分I沉淀。(2)组分I上清液240升加入等倍冰水稀释，调PH至5.0±0.1，加入95％乙醇94.8升至浓度17％，同时搅拌降温至-4℃，静置过夜。(3)管式离心机离心，去除组分III沉淀，得组分III上清320升，用1M NaHCO₃调至PH5.5±0.1，降温至-7--8℃，按0.5％加入硅藻土，搅拌30分钟后进行深滤。(4)深滤液调整PH至7.2，加入95％乙醇至25％浓度，同时搅拌，保持-7℃温度，静放过夜。(5)离心，获得组分沉淀9.7公斤，因4倍冰水溶解，温度控制在0-2℃，按5％加入硅藻土深滤，滤液调整PH值为6.4-6.5进行超滤脱醇、浓缩，按0.3M加入甘氨酸稳定剂，得10.2％蛋白浓度液23.3升，之后过滤除菌，分装。

    下面用表3说明实施例1工艺生产23批丙球蛋白的回收率及纯度。

                  表3：用改良工艺生产的23批丙球回收率

     批次(批)血浆体积  (升)血浆总蛋白  (克/升)     纯度    (％)  提取率  (克/升)分装收率(克/升)   回收率    (％)    4    4    3    4    4    1    3    8400    7680    6300    9700    7300    1180    2000 54.2±2.3 52.8±1.6 48.4±2.0 50.6±1.6 54.8±2.4 54.5 54.6±2.0 98.6±1.40 98.5±1.14 99.0±0.60 98.4±0.71 98.5±0.18 98.7 99.0±0.22 4.9±0.17 4.6±0.21 4.3±0.42 4.4±0.51 5.1±0.44 4.86 4.91±0.32 4.6±0.3 4.5±0.3 4.2±0.4 4.2±0.2 4.9±0.3 -- -- 81.1±2.3 78.6±1.3 79.1±1.7 77.6±1.1 83.3±1.6 80.0 80.9±1.2    23    43060 52.7±3.1 98.7±0.87 4.71±0.47 4.48＝0.4 80.1±2.5

    从表3可知，本工艺经受生产的考验，说明本工艺是稳定地，其回收率及纯度优于传统工艺。