人肿瘤坏死因子α衍生物Db及其制备方法 本发明涉及人肿瘤坏死因子α(TNFα)衍生物的构建及其生物工程制备方法。
TNFα主要由激活的巨噬细胞产生的一种细胞因子，它能直接杀伤某些体外培养的肿瘤细胞和病毒感染细胞，使体内一些肿瘤发生出血性坏死。自1984年用生物工程技术获得重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα)以后。在肿瘤病人系统给予rhTNFα临床试验中发现，在有疗效的剂量范围内会出现毒副反应。为克服rhTNFα的毒副作用，人们在局部给药、复合用药和对hTNFα结构改造提高活性降低毒副作用两方面作了不懈的努力。1996年3月在TNF和相关细胞因子临床应用和生物学功能国际会议上，瑞典、荷兰和美国的几个研究组报道rhTNFα+IFNγ+melphalan通过局部灌注治疗300多例四肢恶性黑色素瘤、软组织肉瘤患者治愈率达80％以上，rhTNFα用量高达3-4毫克/肢体也未出现毒性死亡，为rhTNFα临床使用另辟蹊径。自八十年代以来，构建高效低毒rhTNFα衍生物的努力一直没有停止过。最近有报道TNFα和淋巴毒素(LTα或TNFβ)能诱导正常细胞和动物产生锰过氧化物歧化酶，保护它们免受辐射或肿瘤化疗药物的损伤；诱导蛋白酶产生杀伤肿瘤细胞。因此，抑瘤谱范围广，细胞毒活性高的人肿瘤坏死因子衍生物是一种前景看好的肿瘤治疗药物。hTNFαDa是近年来构建的新型肿瘤坏死因子衍生物，它的中国专利申请号为94112172.0。hTNFαDa的细胞毒活性比rhTNFα提高一个数量级，而毒副作用降低一个数量级以上，是一个很有应用前景的衍生物。但对hTNFαDa的理化性质分析及稳定性试验过程中，发现它地热稳定性比原型差。hTNFαDa的不足和衍生物a的C端由原来的Leu改为Phe有关，因为有报道认为第157位的Leu与第14位的Ala之间有氢键存在。
本发明的目的是构建一个提高细胞毒活性、扩大抑瘤谱范围、稳定性好的人肿瘤坏死因子α。
本发明在构建hTNFα Db时我们维持C端部分不变。TNFα和LTα是在结构和功能上非常相似的两个细胞因子，它们结合同样的受体行使其细胞毒活性，但比较LTα和TNFα单体的立体结构图，可发现TNFα顶端突出的环(#101-#113)比LTα近似位置的环(#84-#89)整整多出7个氨基酸。当LTα缺失这六个氨基酸时可大大提高细胞毒活性。TNFα#102-#107平均亲水性是TNFα分子中亲水性最高的三个部位之一。在TNFα#102-#107中引入缺失对TNFα的细胞毒活性有提高。1994年比利时的R.Lucas等实验证明TNFα#101-#113结构类似lectin，对某些多糖分子有亲和性，与裂解寄生虫(Salivarian锥虫)有关。这段多肽与肿瘤细胞杀伤与毒副作用有何关系有待进一步研究。本发明据此构建了hTNFαDb。人肿瘤坏死因子α衍生物有多种，本发明的衍生物命名为b，即hTNFαDb。它的N端来自hTNFα61，即hTNFα原型中缺失#1-#7共7个氨基酸，C端来自CG-hTNFα，即hTNFα原型中缺失#102-#107共6个氨基酸，hTNFαDb由145个氨基酸组成，包括第一个甲硫氨酸，比hTNFα原型少13个氨基酸。
hTNFαDb的克隆过程如下：
1)CG-hTNFα的构建
从人基因组文库中分离出hTNFα基因，切出第4外显子，接上人工合成寡聚核苷酸片断，组装成hTNFαcDNA，作为PCR扩增CG-hTNFαcDNA的模板。PCR引物设计为：第一对引物：
N端 5’GGCCATATGGTTGGTTCTTCTTCTCGTA 3’(primer1) (28mer) NdeI
C端 5’GCAGGGGCTCTTGATGGC 3’(primer2) (18mer)第二对引物：
N端 5’GGGGCTGAGGCCAAGCCC 3’(primer3) (18mer)
C端 5’CGGAATTCTCACAGGGCAATGATCCCAAAG 3’ (30mer) EcoRI (primer4)由此得到的两个PCR产物分别为A、B。片段A用NdeI完全酶切，片段B用EcoRI完全酶切，然后将A与B等摩尔浓度平末端连接。再以连接液中的DNA为模板，用primer1及primer4进行PCR扩增，得到目的片段CG-hTNFα，将此片段用NdeI和EcoRI完全酶切后，与载体pRSETc连接。CG-hTNFα与hTNFα原型比较，缺失了#102-#107的氨基酸。
2)hTNFα61的构建
以hTNFαcDNA为模板，设计相应的PCR引物，得到的PCR扩增产物即为hTNFα61cDNA。PCR引物设计为：N端引物：5’GCCATATGCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCA 3’(31mer) NdeIC端引物：5’CCGGAATTCTCAGAAGGCAATGATCCCAAAGTA 3’(33mer) EcoRI将PCR扩增产物用NdeI和EcoRI完全酶切后，与载体pRSETc连接。
3)hTNFαDb的克隆
用HincII和EcoRI从pCG-hTNFα表达质粒中分离出带缺失#102-#107的CG-hTNFα的C端部分，取代pRSETc-hTNFα61的相应部位，建成pRSET-hTNFαDb的表达质粒。与hTNFα相比，其特点是N端缺失#1-#7位氨基酸，中间缺失#102-#107位氨基酸。经测序证实hTNFαDb的核苷酸序列符合设计要求后，转化大肠杆菌受体菌。
接种单菌落于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡培养过夜，过夜培养物以1∶100扩大培养2.0-4.0小时，加IPTG至终浓度0.001-1.0mM，继续培养3-6小时，离心收集菌体。
沉淀悬浮于十倍体积的超声破碎液(0.2M NaCl，0.1M Tris，0.05MEDTA pH8.0)。超声破碎后离心，上清液加固体硫酸铵至40-60％饱和度，离心收集沉淀。沉淀溶于buffer A(10mM Tris，pH8.0)中，样品上至预处理好的Sephadex G-25层析柱，buffer A洗脱，收集蛋白峰。经过Sephadex脱盐的样品，再上样至DEAE-Cellulose DE-52离子交换层析柱，用盐浓度梯度0.05-1.0M(如KCl、NaCl等)的10mMTris.Cl，pH8.0的溶液洗脱，收集含盐的洗脱液，得到纯度达95％以上的目的蛋白。hTNFαDbN端15个氨基酸经序列测定为：Met Pro Ser Asp Lys ProVal Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln，完全符合原设计的结构。
hTNFαDb的细胞毒活性用L929细胞检测。在工程菌里的表达量通过SDS-PAGE，Hoefer公司的GS-300扫描密度仪分析，占细菌总蛋白的60-80％，其中可溶性hTNFαDb约为40％。
hTNFαb工程菌发酵后菌体经SDS-PAGE硝酸银染色及Western印迹分析表明，hTNFαDb单体的分子量约为16kD，比16.9kD的衍生物a小，等电点为pH6.5，柱层析纯化后的hTNFαDb经HPLC-C4柱分析为一个峰，纯度大于95％，比活为2×108IU/mg蛋白。较hTNFα原型的比活提高一个数量级。稳定性试验结果表明，在37℃及56℃时，hTNFαDb的热稳定性明显高于hTNFαDa。体外抑瘤试验显示hTNFαDb和hTNFαDa对人胃癌细胞株MKN-28、MKN-45等细胞的生长有明显的抑制作用，此外，hTNFαDb对人小细胞型肺癌细胞株(SPC-A)、肺癌细胞株(A549)、人结肠癌细胞株(BGC)、人黑色素瘤(A375)等细胞的生长有抑制作用，与hTNFαDa相比，扩大了抑瘤谱。而且其稳定性，尤其是热稳定性也得到了明显的提高。与原型比较，hTNFα的细胞毒活性提高了一个数量级。
图1是hTNFαDb重组载体的构建示意图。
实施例：
根据本发明前述构建获得hTNFαDb，并对其分离纯化。hTNFαDb工程菌37℃过夜培养物以1∶100扩大培养2.5-3小时，加IPTG至终浓度0.4mM，继续培养4小时，离心收集菌体。沉淀悬浮于十倍体积的超声破碎液(0.2MNaCl，0.1MTris.Cl，0.05MEDTA，pH8.0)。超声破碎后离心，上清液加固体硫酸铵至40-60％饱和度，离心收集沉淀。沉淀溶于buffer A(10mM Tris，pH8.0)中，柱层析分离。
洗脱得到的样品经15％SDS-PAGE电泳，呈现一条带，分子量约16kD，HPLC C4柱分析为一个峰，纯度96％。用小鼠L929细胞株细胞检测hTNFα的细胞毒活性，纯化样品比活为1.8×108U/毫克蛋白。