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1、(10)申请公布号 CN 103360467 A (43)申请公布日 2013.10.23 CN 103360467 A *CN103360467A* (21)申请号 201310296766.4 (22)申请日 2013.07.16 C07K 7/08(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 青岛科技大学 地址 266101 山东省青岛市崂山区松岭路 99 号 (72)发明人 卢永忠 庄玉 刘杰 (54) 发明名称 一种广谱抗菌多肽的制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种广谱抗菌多肽的制备方 法， 其步骤包括 ： 一、 预测筛选 ； 二、 制备抗菌肽 ；。
2、 三、 抗菌性检测 ； 四、 溶血性检测 ； 五、 制备广谱 抗菌多肽 ： 最终筛选到的具有广谱抗菌功能的多 肽。 本方法制备的多肽具有广谱的抗菌作用， 尤其 是对变异链球菌、 幽门螺杆菌具有杀伤作用， 而对 正常细胞没有副作用 ； 分子量小， 结构简单， 人工 合成方便 ； 作用持久， 无溶血作用， 显示其在治疗 细菌性感染， 特别是对变异链球菌、 幽门螺杆菌感 染的治疗方面具有重要应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 (10)申请公布号 CN。
3、 103360467 A CN 103360467 A *CN103360467A* 1/1 页 2 1. 一种广谱抗菌多肽的制备方法， 其特征在于， 步骤包括 ： 一、 预测筛选 ： 下载海鞘的基因组序列， 寻找其中具有潜在编码功能的小开放阅读框， 将这些小开放阅读框分别翻译出对应的氨基酸序列， 从中筛选抗菌肽 ； 二、 制备抗菌肽 ： 根据步骤一中预测筛选的抗菌肽序列， 利用固相合成法合成其中的部 分多肽， 并且使 C 端酰胺化， N 端不含有蛋氨酸， 制备抗菌肽， 并进行质谱鉴定 ； 三、 抗菌性检测 ： 将抗菌肽用蒸馏水溶解成浓度为 1mg/ml， 采用琼脂糖扩散法进行抗 菌活性检测 。
4、； 四、 溶血性检测 ： 利用羊血红细胞检测抗菌肽的溶血作用 ； 五、 制备广谱抗菌多肽 ： 最终筛选到的具有广谱抗菌功能的多肽。 2. 根据权利要求 1 所述的广谱抗菌多肽的制备方法， 其特征在于 : 所述步骤五中制 备的多肽， 其序列为 ： Phe Ser Leu Phe Phe Pro Tyr Ala Ala Leu Lys Trp Leu Arg Lys Leu Leu Lys Lys。 3.根据权利要求1所述的广谱抗菌多肽的制备方法， 其特征在于: 所述步骤三中琼脂 糖扩散法中使用的菌株为大肠杆菌、 金黄葡萄球菌、 四联球菌、 白色假丝酵母、 变形杆菌、 绿 脓杆菌、 变异链球菌、 。
5、幽门螺杆菌的一种或几种组合。 4.根据权利要求1所述的广谱抗菌多肽的制备方法， 其特征在于: 所述步骤五中制备 的多肽对变异链球菌、 幽门螺杆菌具杀伤作用。 权 利 要 求 书 CN 103360467 A 2 1/3 页 3 一种广谱抗菌多肽的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种广谱抗菌多肽的制备方法， 属于生物化学和生物技术领域。 背景技术 0002 抗生素的耐药性已成为影响抗感染治疗和畜牧业发展的严重问题， 新的抗菌物质 的研究和开发是解决这一问题的关键。抗菌肽作为一种重要的抗菌物质， 近年来成为研究 的热点。抗菌肽是一种具有抗菌活性的短肽， 由细胞特定基因编码、 经外界条件诱导。
6、产生， 广泛存在于生物界， 是天然免疫系统的重要组成部分。 许多抗菌肽除了有抗菌作用外， 还表 现出抗病毒、 抗肿瘤的活性。 抗菌肽一般是阳离子两亲结构， 能够特异地与带负电的细胞结 合， 在细胞膜上形成小孔， 或破坏细胞膜结构， 导致细胞死亡。 其作用机理独特， 不易产生耐 药性 ； 在抗肿瘤方面， 许多抗菌肽具有选择性杀伤肿瘤细胞的功能， 尤其是对哺乳动物正常 细胞毒性较低， 有望成为人类战胜癌症的新式武器， 已经成为抗肿瘤药物研发的热点之一。 许多具有抗肿瘤活性的抗菌肽已进行临床实验， 因此抗菌肽极具开发利用价值。 0003 自 1980 年第一种抗菌肽天蚕素分离以来， 从细菌、 真菌、。
7、 昆虫、 两栖类、 高等植物 及哺乳动物中相继发现并获得了许多具有类似性质的活性多肽。随着新技术、 新方法的应 用， 新发现的抗菌肽数量还在持续增长。传统的抗菌肽筛选技术多依据蛋白质分离纯化方 法进行逐级分离， 并在分离的过程中检测各组分的抗菌活性。另外一种思路是从分离抗菌 肽基因入手， 再通过化学合成或基因工程的方法获得抗菌肽。从基因分离的角度进行抗菌 肽的筛选和分离， 是利用了已知抗菌肽的结构和功能的信息， 在效率上更高一些。 以上方法 各有优缺点。 虽然抗菌肽的种类和制备方法很多， 但仍然需要研发更新、 更具应用价值的广 谱抗菌多肽。 发明内容 0004 本发明的目的在于解决上述技术中的。
8、不足， 提供一种具有抗多种革兰氏阳性菌、 阴性菌的长效、 耐热、 无溶血性的新的广谱抗菌多肽的制备方法。 0005 为实现上述目的， 本发明所采用的技术手段是 ： 一种广谱抗菌多肽的制备方法， 其 步骤包括 ： 一、 预测筛选 ： 下载海鞘的基因组序列， 寻找其中具有潜在编码功能的小开放阅读框， 将这些小开放阅读框分别翻译出对应的氨基酸序列， 从中筛选抗菌肽 ； 二、 制备抗菌肽 ： 根据步骤一中预测筛选的抗菌肽序列， 利用固相合成法合成其中的部 分多肽， 并且使 C 端酰胺化， N 端不含有蛋氨酸， 制备抗菌肽， 并进行质谱鉴定 ； 三、 抗菌性检测 ： 将抗菌肽用蒸馏水溶解成浓度为 1mg。
9、/ml， 采用琼脂糖扩散法进行抗 菌活性检测 ； 四、 溶血性检测 ： 利用羊血红细胞检测抗菌肽的溶血作用 ； 五、 制备广谱抗菌多肽 ： 最终筛选到的具有广谱抗菌功能的多肽。 0006 进一步的， 所述步骤三中琼脂糖扩散法中使用的菌株为大肠杆菌、 金黄葡萄球菌、 说 明 书 CN 103360467 A 3 2/3 页 4 四联球菌、 白色假丝酵母、 变形杆菌、 绿脓杆菌、 变异链球菌、 幽门螺杆菌的一种或几种组 合。 0007 进一步的， 所述步骤五中制备的多肽， 其序列为 ： Phe Ser Leu Phe Phe Pro Tyr Ala Ala Leu Lys Trp Leu Arg 。
10、Lys Leu Leu Lys Lys。 0008 进一步的， 所述步骤五中制备的多肽尤其对变异链球菌、 幽门螺杆菌具有杀伤作 用。 0009 本发明的有益效果在于 ： 本方法制备的多肽具有广谱的抗菌作用， 尤其是对变异 链球菌、 幽门螺杆菌具有杀伤作用， 而对正常细胞没有副作用 ； 分子量小， 结构简单， 人工合 成方便 ； 作用持久， 无溶血作用， 显示其在治疗细菌性感染， 特别是对变异链球菌、 幽门螺杆 菌感染的治疗方面具有重要应用价值。 具体实施方式 0010 实施例 1 一种广谱抗菌多肽的制备方法， 其步骤包括 ： 一、 抗菌肽的生物信息学筛选 以海鞘 2 号染色体基因组序列为模板，。
11、 根据抗菌肽分子量小的特点， 首先利用小开 放阅读框分析软件 sORFfinder 从基因组序列中筛选具有潜在编码功能的小开放阅读框 (sORFs)。 将这些sORFs分别翻译出对应的氨基酸序列， 利用抗菌肽预测软件CAMP从sORFs 中筛选抗菌肽。共预测到可能性超过 70% 的序列 100 余条。 0011 二、 多肽的抗菌活性鉴定 选择 8 个可能性超过 90%、 2 个可能性在 60-70% 之间的序列， 委托上海楚肽生物技术公 司利用固相合成法合成， 并将 C 末端酰胺化， 合成后经 HPLC 纯化， 纯度达到 96.68%， 并经质 谱分析鉴定 （表 1） 。 0012 表 1 合。
12、成多肽序列表 多肽编号 序列 P-01PheGlyThrGlyValLysArgLysAlaGlnCysAspLeuLysSerLys P-02GlyLysGlyLeuGluValIleLysTrpLysLeuLysHisValIleGlnLeu P-03LeuPheAlaLysIleAsnGlyLeuLysValGlyProLeuLysIleGlnIleVal P-04Phe Ser LeuPhe Phe Pro TyrAlaAlaLeu LysTrpLeu Arg Lys Leu Leu LysLys P-05ValLysLeuGluIleLeuGlySerLysGlyGlyAlaLysI。
13、leGluLysValSerLeuIleCysLeuGlnPheThrAlaGlyTyrLys P-06GlyIleGlyArgIleGlyLysValHisAlaAlaAsnLeuIleProLysGly P-07LysLysValIleIleGluTyrValLysIleGluAla P-08ValLysGluGluValLysPheSerLysLysTrp P-09LysPheLysLeuLysSerLeuLysIleIleGluTyrLysGln P-10ValSerLysIleLysLysTyrLeuLysTyrLysAspArgIle 三、 抗菌性检测 ： 将多肽用蒸馏水溶解成浓度。
14、为 1mg/ml， 采用琼脂糖扩散法进行抗菌活性检测。琼脂 糖扩散法中使用的菌株为大肠杆菌、 金黄葡萄球菌、 四联球菌、 白色假丝酵母、 变形杆菌、 绿 脓杆菌、 变异链球菌、 幽门螺杆菌的一种或几种组合， 这些菌种的菌株均购自广东省微生物 所。菌株复苏后， 接种于普通 LB 培养基 37过夜培养后， 分别取 50l 菌液涂布于 LB 固体 培养基。静置带菌液吸收后， 分别加入浓度为 1mg/ml 的多肽溶液 10l。37培养 10 小时 后， 观察抑菌圈的有无和大小。同时观察抑菌圈一周内是否有变化， 判断抑菌时间长短。结 果见表 2。其中 P-04 具有广谱抗菌活性。 0013 表 2 多肽。
15、抗菌活性分析结果 说 明 书 CN 103360467 A 4 3/3 页 5 +: 有抗菌活性 ; -: 无抗菌活性 四、 P-04 抗变异链球菌的最低抑菌浓度分析 采用血琼脂平板检测 P-04 对变异链球菌的最低抑菌浓度。将 50l 活化的菌液涂布 于血琼脂平板后静置半小时， 分别将 10l 浓度为 10,20,30,50,100,200,500,1000 g/ ml 的 P-04 溶液加入培养皿， 做好标记。37培养 24-48 小时后， 观察抑菌圈的有无。结果 表明最低抑菌浓度为 30g /ml。 0014 五、 抗菌肽的溶血性检测 利用羊血红细胞检测抗菌肽的溶血作用 ； 将浓度为1m。
16、g/ml的抗菌肽溶液10l滴加在 血平皿表面， 以蒸馏水做对照。置于 37 24 小时以上， 然后观察溶血圈的有无。结果所有 受测抗菌肽均没有出现溶血圈。初步结果表明， 所述抗菌肽不存在溶血毒性。 0015 制备广谱抗菌多肽 ： 最终筛选到的具有广谱抗菌功能的多肽 P-04, 其序列为 ： Phe Ser Leu Phe Phe Pro Tyr Ala Ala Leu Lys Trp Leu Arg Lys Leu Leu Lys Lys。 0016 本方法制备的多肽具有广谱的抗菌作用， 尤其是对变异链球菌、 幽门螺杆菌具有 杀伤作用， 而对正常细胞没有副作用 ； 分子量小， 结构简单， 人工合成方便 ； 作用持久， 无溶 血作用， 显示其在治疗细菌性感染， 特别是对变异链球菌、 幽门螺杆菌感染的治疗方面具有 重要应用价值。 0017 以上为本发明的具体实施例， 其作用在于对本发明的内容做进一步详细的说明， 使阅读者更易理解， 但不构成对本发明所要求的保护。 说 明 书 CN 103360467 A 5 1/1 页 6 0001 序 列 表 CN 103360467 A 6 。