识别活化形式整合素ΑSUB4/SUBΒSUB7/SUB的人源化单克隆抗体.pdf

本发明涉及一种新的识别活化形式整合素α4β7的人源化单克隆抗体。本发明人筛选得到一种特异性识别活化型整合素α4β7的单克隆抗体。基于这种识别特异性，所述的单克隆抗体可以作为靶向运输的载体把药物带到病理组织部位，达到治疗疾病的目的；也可以作为研究整合素α4β7活化状态的工具。

权利要求书
1.  一种单克隆抗体，其特异性地识别活化型整合素α4β7。

2.  如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其特异性地识别活化型整合素α4β7的α4亚基第184-190位氨基酸，β7亚基第331-348位氨基酸。

3.  如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4中第1-116位所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第1-106位所示。

4.  如权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，其重链恒定区和轻链恒定区分别是人免疫球蛋白G1的重链恒定区和轻链恒定区。

5.  如权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4中第119-448位所示，所述的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第109-213位所示。

6.  一种单克隆抗体的重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4中第1-116位所示。

7.  一种单克隆抗体的轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第1-106位所示。

8.  权利要求6所述的重链可变区或权利要求7所述的轻链可变区的用途，用于制备单克隆抗体，所述的单克隆抗体特异性地识别活化型整合素α4β7。

9.  一种多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1-5任一所述的单克隆抗体。

10.  如权利要求9所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸含有SEQ ID NO：1中第1-318位所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：2中第1-348位所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列。

11.  一种多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求6所述的重链可变区或权利要求7所述的轻链可变区。

12.  如权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，编码权利要求6所述的重链可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：2中第1-348位所示；或
编码权利要求7所述的轻链可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1中第1-318位所示。

13.  一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求9-12任一所述的多核苷酸以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

14.  一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求13所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求9-12任一所述的多核苷酸。

15.  一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：
a)提供表达载体，所述表达载体含有权利要求9所述的多核苷酸以及与该序列操作性相连的表达调控序列；
b)用步骤a)所述的表达载体转染宿主细胞；
c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和
d)分离纯化获得所述单克隆抗体。

16.  权利要求1-5任一所述的单克隆抗体的用途，用于区分整合素α4β7的活化型状态和非活化型状态；或用于制备靶向活化型整合素α4β7的药物或系统；或用于作为研究整合素α4β7相关疾病的工具或制备相关的治疗药物。

17.  一种靶向活化型整合素α4β7的药物，所述的药物包括：
权利要求1-5任一所述的单克隆抗体及其衍生物，以及与之相连的治疗药物。

说明书识别活化形式整合素α4β7的人源化单克隆抗体
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种新的识别活化形式整合素α4β7的人源化单克隆抗体。
背景技术
白细胞的迁移运动是炎症反应病理过程中的重要步骤和关键环节，是当前生命科学领域研究的热点和前沿性课题。整合素作为一类重要的细胞表面粘附分子，是直接介导白细胞迁移运动的重要蛋白。整合素由α和β两个亚基通过非共价键组成的异源二聚体，在脊椎动物中已发现18种α亚基和8种β亚基，组成24种整合素，它们与生物体的免疫反应、细胞的运动和迁移、免疫细胞的组织定位、凝血等密切相关。整合素α4β7主要表达在淋巴细胞表面，是重要的归巢受体。淋巴细胞由循环系统进入炎症组织部位处发挥免疫作用需要一系列精细调控的步骤，包括：淋巴细胞在血管内皮细胞的滚动、黏附和穿过血管壁到达炎症组织。在这个过程中，有许多蛋白分子和免疫因子参与了调节，其中整合素α4β7是一种重要的黏附分子在其中发挥了重要的作用。整合素与很多人类疾病关系密切，如：炎症，心血管疾病，血栓症，癌症等等，世界著名的医药公司都把整合素作为新药研发的药靶。
目前的研究表明，炎症性肠病的发生与整合素α4β7有着密切关系。整合素α4β7可以通过与其配体MAdCAM-1的相互作用使淋巴细胞穿过肠脉管壁到达炎症部位。所以，以整合素α4β7和其配体作为制药靶点来治疗炎症性肠病成为了热点，而现在出现的药物都是一些抑制性抗体或者是小的拮抗剂分子来抑制它们的相互作用。但是这些药物都会非特异性地抑制正常免疫系统的功能，导致一些严重的危急患者生命的并发症。
以单克隆抗体为基础的抗体药物对特定的分子靶点具有高度特异性，作为靶向药物在相关疾病治疗中有巨大的潜力。当前，抗体药物的研究与开发已成为生物技术药物领域的热点。目前研究发现在炎症性肠病病理组织处整合素α4β7异常活化，并且抑制α4整合素与其配体的相互作用可以对于炎症性肠病起到缓解作用，如已经上市的α4整合素抗体Tysabri-natalizumab。但是此抗体识别没有特异性，既可以识别活化形式的α4整合素也可以识别非活化形式的α4整合素，所以在临床应用过程中会导致部分患者发生进行性多灶性白质脑病。截止到目前，本领域还没有一个识别特异性非常好的整合素α4β7的抗体药物用于临床。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的识别活化形式整合素α4β7的人源化单克隆抗体。
在本发明的第一方面，提供一种单克隆抗体，其特异性地识别活化型整合素α4β7。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体识别活化型整合素α4β7的两段特征序列：人源α4亚基第184-190位氨基酸，人源β7亚基第331-348位氨基酸；以及这两段序列在其它物种来源α4β7中的对应序列。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体不识别非活化型整合素α4β7以及其它整合素。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4中第1-116位所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第1-106位所示。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体的重链恒定区和轻链恒定区分别是人免疫球蛋白G1(IgG1)的重链恒定区和轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4中第119-448位所示，所述的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第109-213位所示。
在本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体的重链可变区，其氨基酸序列如SEQID NO：4中第1-116位所示。
在本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体的轻链可变区，其氨基酸序列如SEQID NO：3中第1-106位所示。
在本发明的另一方面，提供所述的重链可变区或所述的轻链可变区的用途，用于制备单克隆抗体，所述的单克隆抗体特异性地识别活化型整合素α4β7。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，它编码所述的单克隆抗体。
在另一优选例中，该多核苷酸含有SEQ ID NO：1中第1-318位所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列，和/或SEQ ID NO：2中第1-348位所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列。
在另一优选例中，该多核苷酸含有SEQ ID NO：1中第325-642位所示的编码所述单克隆抗体轻链恒定区的核苷酸序列，和/或SEQ ID NO：2中第355-1347位所示的编码所述单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，它编码所述的重链可变区或所述的轻链可变区。
在另一优选例中，编码所述的重链可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：2中第1-348位所示；或编码所述的轻链可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1中第1-318位所示。
在本发明的另一方面，提供一种表达载体，它含有所述的多核苷酸以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，它含有所述的表达载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞是真核细胞。
在本发明的另一方面，提供一种制备所述的单克隆抗体的方法，该方法包括：
a)提供表达载体，所述表达载体含有所述的多核苷酸以及与该序列操作性相连的表达调控序列；
b)用步骤a)所述的表达载体转染宿主细胞；
c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和
d)分离纯化获得所述单克隆抗体。
在本发明的另一方面，提供所述的单克隆抗体的用途，用于区分整合素α4β7的活化型状态和非活化型状态；或用于制备靶向活化型整合素α4β7的药物和系统；或用于作为研究整合素α4β7相关疾病的工具或制备相关的治疗药物。
在本发明的另一方面，提供一种靶向活化型整合素α4β7的药物，所述的药物包括：所述的单克隆抗体及其衍生物，以及与之相连(共价连接，偶联，耦合或复合)的治疗药物。
在本发明的另一方面，提供所述靶向活化型整合素α4β7的药物的用途，用于治疗整合素α4β7异常活化相关的炎症疾病。
在另一优选例中，所述的炎症是炎症性肠病(如溃疡性结肠炎或克隆病)。
在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有有效量的所述的靶向活化型整合素α4β7的药物，以及药学上可接受的载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1.整合素α4β7可溶性蛋白的表达载体的构建。
(A)α4β7的全长胞外结构域，C-端带有TEV切点，酸碱肽，His-tag和Strep-tag。并在α4的thigh结构域引入了R558A突变，目的是将内源的蛋白酶切位点去除。
(B)全长野生型和突变型α4β7的表达和纯化。Non-reducing表示未还原的状态，即α4β7；reducing表示还原的状态，即分离的α4和β7。
图2.流式细胞术检测J19对整合素α4β7的识别特性。
(A)J19识别活化的整合素α4β7。1mM Ca2++1mM Mg2+条件整合素处于非活化状态，2mM Mn2+条件整合素处于活化状态。Act-1：整合素α4β7的单克隆抗体，无识别特异性。hIgG：人源IgG对照。
(B)J19识别各种条件刺激所诱导的整合素α4β7的活化。图中数字为平均荧光强度，平均值±标准差。
图3.J19的交叉免疫原性。
(A)J19交叉识别小鼠和大鼠的整合素α4β7。(B)J19不识别人源整合素α4β1和αEβ7。图中数字为平均荧光强度，平均值±标准差。
图4.J19抗原表位的鉴定。
(A)J19在β7亚基上抗原表位的鉴定。β1535β7表示1-535位氨基酸为β1的序列，536-772位为β7的序列；β1131β7348β1表示β1的第131-336位被β7的第141-348位取代，也即β1的第1-130位连接β7的第141-348位连接β1第337-778位；其他依次类推。(B)J19在α4亚基上抗原表位的鉴定。α4184αE190α4表示α4的第184-190位氨基酸被αE上相应的氨基酸序列替代；其他依次类推。
具体实施方式
本发明人利用活化的整合素α4β7作为底物来筛选抗体库，得到一种特异性识别活化型整合素α4β7的单克隆抗体(J19)。基于这种识别特异性，所述的单克隆抗体可以作为靶向运输的载体把药物(如干扰分子)带到病理组织部位，达到治疗疾病的目的。
本发明涉及一种重组的单克隆抗体，其特异性地识别活化型整合素α4β7，不识别非活化型整合素α4β7以及其它整合素。进一步研究显示，所述的单克隆抗体识别活化型整合素α4β7中β7的第331-348位氨基酸抗原表位，以及α4亚基第184-190位氨基酸抗原表位。
本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。单克隆抗体具有良好的特异性。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本文所用的术语“抗体”是具有约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对应，轻链的可变区与重链的可变区相对应。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中 各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
本发明人以活化的(Wedge mutant)和未活化的(WT)整合素α4β7为底物，利用噬菌体展示技术筛选人源scFv(single-chain variable fragments)抗体库(Tomlinson I+J)，最后ELISA鉴定获得一种单克隆抗体(J19)，其能很好的识别活化形式的整合素。然后本发明人把克隆得到的J19的可变区序列与人的抗体的恒定区(Fc)片段融合，从而表达得到人源全长抗体。关于J19识别特异性的进一步鉴定，本发明人利用流式细胞术(flow cytometry)检测其对于细胞表面表达的整合素α4β7的识别。实验结果显示，J19既可以特异性的识别离子条件诱导的整合素α4β7的活化也可以识别生理状态下的整合素的激活剂ADP和PMA诱导的整合素α4β7的活化。进一步的实验结果表明，J19还可以识别趋化因子SDF-1α刺激下脾淋巴细胞表面的整合素α4β7的活化。这些接近生理条件的实验提示J19可以特异性的识别生理状态下活化的整合素α4β7，这就为将来该抗体在疾病治疗上的应用提供了可能。由于J19只识别活化的整合素α4β7而不识别整合素α4β1，所以对于J19抗原表位的研究，本发明人是利用β1和β7的嵌合体来进行抗原表位的Mapping，结果表明J19的识别位点位于β7的I结构域。
如本文所用，所述的“识别”抗原表位也包括了“结合”抗原表位的情形。
本发明获得的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4中第1-116位所示，轻链可变的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第1-106位所示。优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区和轻链恒定区是人免疫球蛋白G1(IgG1)的重链恒定区和轻链恒定区。更优选地，所述的单克隆抗体的重链恒定区和轻链恒定区是人免疫球蛋白G1Fc的重链恒定区和轻链恒定区。更优选地，所述的单克隆抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4中第119-448位所示，所述的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第109-213位所示。
本发明还提供了编码本发明的单克隆抗体的多核苷酸分子。在一个较佳的实例中，该多核苷酸分子含有SEQ ID NO：1中第1-318位所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：2中第1-348位所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列。与这些核苷酸序列简并的序列也包含在本发明中。更优选地， 该多核苷酸含有SEQ ID NO：1中第325-642位所示的编码所述单克隆抗体轻链恒定区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：2中第355-1347位所示的编码所述单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列。
单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。
在获得编码本发明的单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列后，通常可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。
首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。本领域普通技术人员能理解，将编码本发明单抗重链和轻链的核苷酸序列同时插入相同的表达载入或分别插入不同的表达载体中进行共表达都能获得本发明的单克隆抗体。
本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。
编码本发明单克隆抗体的多核苷酸序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一读框内。本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如购自Invitrogen公司或Clontech公司的的表达载体，具体例如pIRES2-EGFP。
随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明中，优选真核细胞。通常用哺乳动物细胞系来作为表达真核细胞衍生多肽的宿主细胞。哺乳动物细胞在培养物中的繁殖是本领域熟知的。见《组织培养》，Academic Press，Kruse and Patterson编辑(1973)，该文纳入本文作为参考。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的无限增殖细胞系。这些无限增殖细胞系包括但不局限于，293T细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。它们为蛋白质分子提供了翻译后修饰，包括正 确的折叠、正确的二硫键形成以及正确位点的糖基化。尽管在下文实施例中，本发明仅列举了以293T细胞作为宿主细胞的例子，但是本领域技术人员在阅读了本发明的详细描述和具体实施例可以知道，本发明也能采用上述这些细胞系。
用表达载体转染宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染诸如CHO细胞等宿主细胞。
然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明还提供了所述的单克隆抗体的用途，用于区分整合素α4β7的活化型状态和非活化型状态。区分整合素α4β7的状态有助于临床疾病的诊断，并且对于科学研究也是有用的，可以用于研究整合素α4β7的活化机制。所述的单克隆抗体可识别活化型整合素α4β7中β7的第331-348位氨基酸抗原表位，以及α4亚基第184-190位氨基酸抗原表位，可见整合素α4β7在活化型状态或非活化型状态时空间结构发生了改变。在活化型状态下，该抗原表位整合素α4β7中β7的第331-348位，以及α4亚基第184-190位氨基酸暴露于空间结构的外侧；而在非活化型状态下，该抗原表位整合素α4β7中β7的第331-348位，α4亚基第184-190位氨基酸埋藏于空间结构的内侧。
本发明还提供了所述的单克隆抗体的用途，用于制备靶向活化型整合素α4β7的药物。这种靶向药物的设计和制备基于所述的单克隆抗体的特异性识别能力，可以将治疗药物携带到特定的存在活化型整合素α4β7的组织或器官位置，提高药物有效作用能力，有些情况下还能够降低药物对于其它组织或器官的损害。
本发明还提供了一种靶向活化型整合素α4β7的药物，所述的药物包括：所述的单克隆抗体以及与之相连(共价连接，偶联，耦合或复合)的治疗药物。所述的治疗药物可以是任何活化型整合素α4β7相关疾病的防治药物，例如是抗炎药物；更特别的例如是治疗炎症性肠病的药物。所述的治疗药物例如可以是一种干扰分子，如针对特定基因的siRNA。可采用本领域公知的连接方法将干扰分子连接到本发明的单克隆抗体上，从而被携带到特定的部位。
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的所述的靶向活化型整合素α4β7的药物，以及药学上可接受的载体。例如，本发明的药物组合物可用来治疗炎症。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的突变蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明的主要优点在于：
本发明人筛选得到的单克隆抗体能够特异性地识别活化形式的整合素α4β7，利用这种识别特异性可以作为靶向运输的载体把药物(如siRNA)带到病理组织部位(如用于治疗炎症性肠炎)，这样就可以很好的避免识别特异性不强带来的副作用。
另一方面，整合素α4β7的抗体有限性已经成为了研究其亲和性调节机制和生物功能的瓶颈，本发明人的单克隆抗体可以有效地克服这种科学研究上的不便。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、整合素α4β7野生型和突变体可溶性蛋白表达载体的构建及蛋白表达纯化
以下描述基于的α4亚基(人)的氨基酸序列如SEQ ID NO：33(999aa)。以下描述基于的β7亚基(人)的氨基酸序列如SEQ ID NO：9(779aa)。
已证实在整合素β亚基的I和Hybrid结构域间引入了一个N-糖基化位点，可将整合素分子活化。以此为基础，构建全长的整合素α4β7野生型和带有该突变的突变体可溶性蛋白表达载体，α4亚基在体内有剪接体的存在，所以为了得到全长的α4亚基， 本发明人突变了剪接位点R558A(即第558位的氨基酸从R突变为A)。可溶性整合素不带有跨膜区和胞内区，并在C-端融合表达His-tag(6×His)与Strep-tag(WSHPQFEK)用于纯化，分别在α4亚基和β7亚基后面连上酸肽(Acid)和碱肽(Basic)序列(酸肽序列为：ENAQCEKELQALEKENAQLEW(SEQ ID NO：34)；碱肽序列为：KNAQCKKKLQALKKKNAQLKW(SEQ ID NO：35))，使两个亚基能够结合成复合物(图1A)。C端还分别构建了TEV切点(序列为ENLYFQ(SEQ ID NO：36))，用于其他实验，譬如电镜观察整合素结构需要用TEV酶切掉人为加上去酸碱肽序列和纯化需要的His及Strep标签。表达α4亚基的系统插入到表达载体pCDNA3.1(-)(购自Invitrogen)中；表达β7亚基的系统插入到表达载体pEF1-Puro(获自The Immune Disease Institute，Children’s Hospital Boston，and Department of Pathology，Harvard Medical School)中。
因为整合素有大量的二硫键和糖基化位点，无法在原核或低等真核表达系统中表达，本发明人最终建立了293T真核表达系统。
蛋白表达后，通过Ni-NTA和Strep-Tactin两步亲和层析可以得到纯度高于95％的蛋白(图1B)。
实施例2、利用噬菌体抗体库技术筛选特异性识别活化整合素的抗体并进行表达
(1)利用纯化的野生型非活化和突变型活化的α4β7整合素蛋白，通过淘洗(panning)的方法，筛选scFv抗体库Tomlinson I+J(购自Geneservice)，经过三轮筛选并除去与野生型非活化α4β7整合素蛋白相结合的噬菌体，最后就可以得到能够表达特异性结合活化的α4β7整合素的scFv的噬菌体。具体筛选过程就是先把可溶性整合素蛋白用生物素标记，与人的单链抗体噬菌体库一起孵育，有特异性识别整合素的噬菌体就能很好的与整合素结合，然后用链亲和素包被的磁珠与之混合孵育，就把生物素标记的整合素全部固定在磁珠上，同样那些结合整合素的噬菌体也被固定在了磁珠上，最后通过一个磁性的分离器把磁珠分离出来，洗脱得到特异性结合的噬菌体，再进行扩增，做下一轮的筛选。三轮后的筛选结果，ELISA鉴定表明得到了十几个与活化型整合素α4β7结合比较高的阳性克隆。ELISA鉴定的具体过程：先在ELISA板上包被链亲和素，再加入生物素标记的整合素，然后加入单克隆扩增得到的噬菌体，孵育一段时间后加入连有辣根过氧化物酶的抗噬菌体外壳蛋白M13的抗体，加入底物就可以显色。在操作过程中，又设计了阳性对照，即以生物素和链亲和素的特异性反应作为对照；阴性对照就是没有加入生物素标记的整合素，进行显色。
根据ELISA结果，从中挑取了阳性克隆，并进一步与人源抗体轻链(λ链)恒定区以及重链(IgG1)恒定区连接，然后表达纯化得到抗体进行下一步的功能研究。J19单克隆抗体的制备具体如下：
筛选scFv抗体库得到J19scFv之后，用PCR方法分别扩增轻链可变区和重链可变 区，扩增轻链可变区的引物：
正向引物(SEQ ID NO：5)：
CGGGATCCACGGACATCCAGATGACCCAG(下划线为BamHI酶切位点)；
反向引物(SEQ ID NO：6)
CGGAATTCCGCCCGTTTGATTTCCACCTTGGTC(下划线为EcoRI酶切位点)；
扩增重链可变区的引物：
正向引物(SEQ ID NO：7)：
GCTCTAGACCGGCCATGGCCGAGGTG(下划线为XbaI酶切位点)：
反向引物(SEQ ID NO：8)：
CGGGATCCGACGGTGACCAGGGTTCCCTG(下划线为BamHI酶切位点)。
在扩出这两个可变区片段之后分别插入到两个分别带有重链恒定区和轻链恒定区的质粒中，恒定区的序列是人IgG1的序列，恒定区扩增的模板是抽取RPMI8866细胞(ATCC)RNA后反转的cDNA。带有轻链恒定区的质粒载体是pEF1/V5-His A(Invitrogen)，轻链恒定区插入的酶切位点是EcoR I和Xba I。带有重链恒定区的质粒载体是pcDNA3.1(-)(Invitrogen)，重链恒定区插入的酶切位点是BamHI和HindIII。然后轻链的可变区利用BamH I和EcoR I插入到含有轻链恒定区的质粒中，构成完整的全长轻链；重链的可变区利用Xba I和BamH I插入到含有重链恒定区的质粒中，构成完整的全长重链。
再利用PCR方法，扩增出全长的轻链和重链。
最终表达完整Y型抗体的载体是pIRES2-EGFP(Clontech)，首先全长重链序列替换EGFP序列插入到该载体中，相应的酶切位点是Nco I和Not I。然后全长轻链序列插入到已经含有全长重链的质粒中，插入位置相应的酶切位点是Nco I和Mlu I。将上述构建的表达载体转染293T细胞(ATCC)，培养细胞，最终可良好地表达出J19抗体(存在于培养上清中)。
J19抗体轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)如下(下划线为酶切位点引入序列，下划线位点之前为轻链可变区编码序列，之后为轻链恒定区编码序列)：
ATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCTAGTGATGGTCCTGCTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGAATTCCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG
J19抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)如下(下划线为酶切位点引入序列，下划线位点之前为轻链可变区，之后为轻链恒定区)：
MTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSDGPATFGQGTKVEIKRAEFQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYA ASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
J19抗体重链的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)如下(下划线为酶切位点引入序列，下划线位点之前为重链可变区编码序列，之后为重链恒定区编码序列)：
ATGGCCGAGGTGCAGTTGTTAGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAATTCTAGTGGTTATTATACAAATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATATTATGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCGGATCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
J19抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)如下(下划线为酶切位点引入序列，下划线位点之前为重链可变区，之后为重链恒定区)：
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTINSSGYYTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYYGYFDYWGQGTLVTVGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
实施例3、J19特异性地识别活化的整合素α4β7
纯化得到全长的J19以后，为了进一步验证其识别特异性，本发明人采用了流式细胞术检测方法。
图2A实验的具体过程：稳定表达整合素α4β7的K562细胞分别用含有1mM Ca2++1mM Mg2+和2mM Mn2+的HBS缓冲液洗两次，然后加入J19(10μg/ml)，对照中加入等量的hIgG(购自Pierce)，4℃孵育0.5小时；接着还是用含有1mM Ca2++1mM Mg2+和2mM Mn2+的HBS缓冲液分别洗两次，然后加入Alexa Fluor 488标记的山羊抗人IgG(1∶500)(购自Invitrogen)，4℃孵育0.5小时；然后用含有1mM Ca2++1mM Mg2+和2mM Mn2+的HBS缓冲液分别洗两次，流式细胞仪(购自BD)检测。
图2B的实验过程：基本操作与图2A相同，不同的是在加入抗体之前，细胞先分别与500μM的DTT和10μM的ADP(以不加入上述物质的为对照)在37℃孵育15分钟，对照同样在37℃孵育15分钟。
实验结果表明，如图2A所示，J19在Ca2++Mg2+条件下对于整合素α4β7的识别 与对照等同，而在Mn2+条件下J19对于整合素α4β7的识别能力远远强于对照。因为以前研究表明整合素在Mn2+条件下是活化形式，所以J19是一个特异识别活化型整合素α4β7的抗体。
此外，J19也能识别小分子DTT和ADP对于整合素α4β7的活化(图2B)。
实施例4、J19抗原表位的鉴定
为了找到J19的抗原表位，首先检测了抗体J19的交叉免疫特性。实验具体过程是：表达小鼠、大鼠的整合素α4β7以及人的α4β1、αEβ7的质粒分别瞬时转染293T细胞，转染采用的常规磷酸钙转染，详见分子克隆：实验室指南。对于小鼠(Mouse)和大鼠(Rat)的整合素α4β7的识别，流式细胞术检测发现J19能够很好的识别Mouse和Rat的活化型整合素α4β7(图3A)。所以抗原表位的鉴定不能采用人鼠嵌合体来进行。此外，J19既不识别活化型的整合素α4β1也不识别活化型的整合素αEβ7，而只识别活化型的整合素α4β7，所以其抗原表位在于α4亚基和β7亚基上。本发明人采用了人源的β1和β7嵌合体来寻找J19在β7亚基上的抗原表位，同时利用人源的α4和αE嵌合体来寻找J19在α4亚基和β7亚基上的抗原表位。
首先构建了一系列β1和β7嵌合体(嵌合体插入到pcDNA3.1(-)(Invitrogen)的XbaI和AflII位点后转染293T细胞)。
嵌合体构建序列(氨基酸序列)如下：
β7氨基酸序列(SEQ ID NO：9)：
ELDAKIPSTGDATEWRNPHLSMLGSCQPAPSCQKCILSHPSCAWCKQLNFTASGEAEARRCARREELLARGCPLEELEEPRGQQEVLQDQPLSQGARGEGATQLAPQRVRVTLRPGEPQQLQVRFLRAEGYPVDLYYLMDLSYSMKDDLERVRQLGHALLVRLQEVTHSVRIGFGSFVDKTVLPFVSTVPSKLRHPCPTRLERCQSPFSFHHVLSLTGDAQAFEREVGRQSVSGNLDSPEGGFDAILQAALCQEQIGWRNVSRLLVFTSDDTFHTAGDGKLGGIFMPSDGHCHLDSNGLYSRSTEFDYPSVGQVAQALSAANIQPIFAVTSAALPVYQELSKLIPKSAVGELSEDSSNVVQLIMDAYNSLSSTVTLEHSSLPPGVHISYESQCEGPEKREGKAEDRGQCNHVRINQTVTFWVSLQATHCLPEPHLLRLRALGFSEELIVELHTLCDCNCSDTQPQAPHCSDGQGHLQCGVCSCAPGRLGRLCECSVAELSSPDLESGCRAPNGTGPLCSGKGHCQCGRCSCSGQSSGHLCECDDASCERHEGILCGGFGRCQCGVCHCHANRTGRACECSGDMDSCISPEGGLCSGHGRCKCNRCQCLDGYYGALCDQCPGCKTPCERHRDCAECGAFRTGPLATNCSTACAHTNVTLALAPILDDGWCKERTLDNQLFFFLVEDDARGTVVLRVRPQEKGADHTQAIVLGCVGGIVAVGLGLVLAYRLSVEIYDRREYSRFEKEQQQLNWKQDSNPLYKSAITTTINPRFQEADSPTL
β7核苷酸序列(其中下划线为信号肽编码序列)(SEQ ID NO：31)：
atggtggctttgccaatggtccttgttttgctgctggtcctgagcagaggtgagagtgaattggacgccaagatcccatccacaggggatgccacagaatggcggaatcctcacctgtccatgctggggtcctgccagccagccccctcctgccagaagtgcatcctctcacaccccagctgtgcatggtgcaagcaactgaacttcaccgcgtcgggagaggcggaggcgcggcgctgcgcccgacgagaggagctgctggctcgaggctgcccgctggaggagctggaggagccccgcggccagcaggaggtgctgcaggaccagccgctcagccagggcgcccgcggagagggtgccacccagctggcgccgcagcgggtccgggtcacgctgcggcctggggagccccagcagctccaggtccgcttccttcgtgctgagggatacccggtggacctgtactaccttatggacctgagctactccatgaaggacgacctggaacgcgtgcgccagctcgggcacgctctgctggtccggctgcaggaagtcacccattctgtgcgcattggttttggttcctttgtggacaaaacggtgctgccctttgtgagcacagtaccctccaaactgcgccacccctgccccacccggctggagcgctgccagtcaccattcagctttcaccatgtgctgtccctgacgggggacgcacaagccttcgagcgggaggtggggcgccagagtgtgtccggcaatctggactcgcctgaaggtggcttcgatgccattctgcaggctgcactctgccaggagcagattggctggagaaatgtgtcccggctgctggtgttcacttcagacgacacattccatacagctggggacgggaagttgggcggcattttcatgcccagtgatgggcactgccacttggacagcaatggcctctacagtcgcagcacagagtttgactacccttctgtgggtcaggtagcccaggccctctctgcagcaaatatccagcccatctttgctgtcaccagtgccgcactgcctgtctaccaggagctgagtaaactgattcctaagtctgcagttggggagctgagtgaggactccagcaacgtggtacagctcatcatggatgcttataatagcctgtcttccaccgtgacccttgaacactcttcactccctcctggggtccacatttcttacgaatcccagtgtgagggtcctgagaagagggagggtaaggctgaggatcgaggacagtgcaacc acgtccgaatcaaccagacggtgactttctgggtttctctccaagccacccactgcctcccagagccccatctcctgaggctccgggcccttggcttctcagaggagctgattgtggagttgcacacgctgtgtgactgtaattgcagtgacacccagccccaggctccccactgcagtgatggccagggacacctacaatgtggtgtatgcagctgtgcccctggccgcctaggtcggctctgtgagtgctctgtggcagagctgtcctccccagacctggaatctgggtgccgggctcccaatggcacagggcccctgtgcagtggaaagggtcactgtcaatgtggacgctgcagctgcagtggacagagctctgggcatctgtgcgagtgtgacgatgccagctgtgagcgacatgagggcatcctctgcggaggctttggtcgctgccaatgtggagtatgtcactgtcatgccaaccgcacgggcagagcatgcgaatgcagtggggacatggacagttgcatcagtcccgagggagggctctgcagtgggcatggacgctgcaaatgcaaccgctgccagtgcttggacggctactatggtgctctatgcgaccaatgcccaggctgcaagacaccatgcgagagacaccgggactgtgcagagtgtggggccttcaggactggcccactggccaccaactgcagtacagcttgtgcccataccaatgtgaccctggccttggcccctatcttggatgatggctggtgcaaagagcggaccctggacaaccagctgttcttcttcttggtggaggatgacgccagaggcacggtcgtgctcagagtgagaccccaagaaaagggagcagaccacacgcaggccattgtgctgggctgcgtagggggcatcgtggcagtggggctggggctggtcctggcttaccggctctcggtggaaatctatgaccgccgggaatacagtcgctttgagaaggagcagcaacaactcaactggaagcaggacagtaatcctctctacaaaagtgccatcacgaccaccatcaatcctcgctttcaagaggcagacagtcccactctctga
β1氨基酸序列(SEQ ID NO：10)：
QTDENRCLKANAKSCGECIQAGPNCGWCTNSTFLQEGMPTSARCDDLEALKKKGCPPDDIENPRGSKDIKKNKNVTNRSKGTAEKLKPEDITQIQPQQLVLRLRSGEPQTFTLKFKRAEDYPIDLYYLMDLSYSMKDDLENVKSLGTDLMNEMRRITSDFRIGFGSFVEKTVMPYISTTPAKLRNPCTSEQNCTSPFSYKNVLSLTNKGEVFNELVGKQRISGNLDSPEGGFDAIMQVAVCGSLIGWRNVTRLLVFSTDAGFHFAGDGKLGGIVLPNDGQCHLENNMYTMSHYYDYPSIAHLVQKLSENNIQTIFAVTEEFQPVYKELKNLIPKSAVGTLSANSSNVIQLIIDAYNSLSSEVILENGKLSEGVTISYKSYCKNGVNGTGENGRKCSNISIGDEVQFEISITSNKCPKKDSDSFKIRPLGFTEEVEVILQYICECECQSEGIPESPKCHEGNGTFECGACRCNEGRVGRHCECSTDEVNSEDMDAYCRKENSSEICSNNGECVCGQCVCRKRDNTNEIYSGKFCECDNFNCDRSNGLICGGNGVCKCRVCECNPNYTGSACDCSLDTSTCEASNGQICNGRGICECGVCKCTDPKFQGQTCEMCQTCLGVCAEHKECVQCRAFNKGEKKDTCTQECSYFNITKVESRDKLPQPVQPDPVSHCKEKDVDDCWFYFTYSVNGNNEVMVHVVENPECPTGPDIIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIWKLLMIIHDRREFAKFEKEKMNAKWDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGK
β1核苷酸序列(其中下划线为信号肽编码序列)(SEQ ID NO：32)：
atgaatttacaaccaattttctggattggactgatcagttcagtttgctgtgtgtttgctcaaacagatgaaaatagatgtttaaaagcaaatgccaaatcatgtggagaatgtatacaagcagggccaaattgtgggtggtgcacaaattcaacatttttacaggaaggaatgcctacttctgcacgatgtgatgatttagaagccttaaaaaagaagggttgccctccagatgacatagaaaatcccagaggctccaaagatataaagaaaaataaaaatgtaaccaaccgtagcaaaggaacagcagagaagctcaagccagaggatattactcagatccaaccacagcagttggttttgcgattaagatcaggggagccacagacatttacattaaaattcaagagagctgaagactatcccattgacctctactaccttatggacctgtcttactcaatgaaagacgatttggagaatgtaaaaagtcttggaacagatctgatgaatgaaatgaggaggattacttcggacttcagaattggatttggctcatttgtggaaaagactgtgatgccttacattagcacaacaccagctaagctcaggaacccttgcacaagtgaacagaactgcaccagcccatttagctacaaaaatgtgctcagtcttactaataaaggagaagtatttaatgaacttgttggaaaacagcgcatatctggaaatttggattctccagaaggtggtttcgatgccatcatgcaagttgcagtttgtggatcactgattggctggaggaatgttacacggctgctggtgttttccacagatgccgggtttcactttgctggagatgggaaacttggtggcattgttttaccaaatgatggacaatgtcacctggaaaataatatgtacacaatgagccattattatgattatccttctattgctcaccttgtccagaaactgagtgaaaataatattcagacaatttttgcagttactgaagaatttcagcctgtttacaaggagctgaaaaacttgatccctaagtcagcagtaggaacattatctgcaaattctagcaatgtaattcagttgatcattgatgcatacaattccctttcctcagaagtcattttggaaaacggcaaattgtcagaaggcgtaacaataagttacaaatcttactgcaagaacggggtgaatggaacaggggaaaatggaagaaaatgttccaatatttccattggagatgaggttcaatttgaaattagcataacttcaaataagtgtccaaaaaaggattctgacagctttaaaattaggcctctgggctttacggaggaagtagaggttattcttcagtacatctgtgaatgtgaatgccaaagcgaaggcatccctgaaagtcccaagtgtcatgaaggaaatgggacatttgagtgtggcgcgtgcaggtgcaatgaagggcgtgttggtagacattgtgaatgcagcacagatgaagttaacagtgaagacatggatgcttactgcaggaaagaaaacagttcagaaatctgcagtaacaatggagagtgcgtctgcggacagtgtgtttgtaggaagagggataatacaaatgaaatttattctggcaaattctgcgagtgtgataatttcaactgtgatagatccaatggcttaatttgtggaggaaatggtgtttgcaagtgtcgtgtgtgtgagtgcaaccccaactacactggcagtgcatgtgactgttctttggatactagtacttgtgaagccagcaacggacagatctgcaatggccggggcatctgcgagtgtggtgtctgtaagtgtacagatccgaagtttcaagggcaaacgtgtgagatgtgtcagacctgccttggtgtctgtgctgagcataaagaatgtgttcagtgcagagccttcaataaaggagaaaagaaagacacatgcacacaggaatgttcctattttaacattaccaaggtagaaagtcgggacaaattaccccagccggtccaacctgatcctgtgtcccattgtaaggagaaggatgttgacgactgttggttctattttacgtattcagtgaatgggaacaacgaggtcatggttcatgttgtggagaatccagagtgtcccactggtccagacatcattccaattgtagctggtgtggttgctggaattgttcttattggccttgcattactgctgatatggaagcttttaatgataattcatgacagaagggagtttgctaaatttgaaaaggagaaaatgaatgccaaatgggacacgggtgaaaatcctatttataagagtgccgtaacaactgtggtcaatccgaagtatgagggaaaatga
β1535β7(β1的第1-535位连接β7的第543-779位)氨基酸序列(SEQ ID NO：11)：
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β7542β1(即β7的第1-542位连接β1的第536-778位)氨基酸序列(SEQ ID NO：12)：
ELDAKIPSTGDATEWRNPHLSMLGSCQPAPSCQKCILSHPSCAWCKQLNFTASGEAEARRCARREELLARGCPLEELEEPRGQQEVLQDQPLSQGARGEGATQLAPQRVRVTLRPGEPQQLQVRFLRAEGYPVDLYYLMDLSYSMKDDLERVRQLGHALLVRLQEVTHSVRIGFGSFVDKTVLPFVSTVPSKLRHPCPTRLERCQSPFSFHHVLSLTGDAQAFEREVGRQSVSGNLDSPEGGFDAILQAALCQEQIGWRNVSRLLVFTSDDTFHTAGDGKLGGIFMPSDGHCHLDSNGLYSRSTEFDYPSVGQVAQALSAANIQPIFAVTSAALPVYQELSKLIPKSAVGELSEDSSNVVQLIMDAYNSLSSTVTLEHSSLPPGVHISYESQCEGPEKREGKAEDRGQCNHVRINQTVTFWVSLQATHCLPEPHLLRLRALGFSEELIVELHTLCDCNCSDTQPQAPHCSDGQGHLQCGVCSCAPGRLGRLCECSVAELSSPDLESGCRAPNGTGPLCSGKGHCQCGRCSCSGQSSGHLCECDNFNCDRSNGLICGGNGVCKCRVCECNPNYTGSACDCSLDTSTCEASNGQICNGRGICECGVCKCTDPKFQGQTCEMCQTCLGVCAEHKECVQCRAFNKGEKKDTCTQECSYFNITKVESRDKLPQPVQPDPVSHCKEKDVDDCWFYFTYSVNGNNEVMVHVVENPECPTGPDIIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIWKLLMIIHDRREFAKFEKEKMNAKWDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGK
β1336β7(β1的第1-336位连接β7的第349-779位)氨基酸序列(SEQ ID NO：37)：
QTDENRCLKANAKSCGECIQAGPNCGWCTNSTFLQEGMPTSARCDDLEALKKKGCPPDDIENPRGSKDIKKNKNVTNRSKGTAEKLKPEDITQIQPQQLVLRLRSGEPQTFTLKFKRAEDYPIDLYYLMDLSYSMKDDLENVKSLGTDLMNEMRRITSDFRIGFGSFVEKTVMPYISTTPAKLRNPCTSEQNCTSPFSYKNVLSLTNKGEVFNELVGKQRISGNLDSPEGGFDAIMQVAVCGSLIGWRNVTRLLVFSTDAGFHFAGDGKLGGIVLPNDGQCHLENNMYTMSHYYDYPSIAHLVQKLSENNIQTIFAVTEEFQPVYKELKNLIPKSAVGELSEDSSNVVQLIMDAYNSLSSTVTLEHSSLPPGVHISYESQCEGPEKREGKAEDRGQCNHVRINQTVTFWVSLQATHCLPEPHLLRLRALGFSEELIVELHTLCDCNCSDTQPQAPHCSDGQGHLQCGVCSCAPGRLGRLCECSVAELSSPDLESGCRAPNGTGPLCSGKGHCQCGRCSCSGQSSGHLCECDDASCERHEGILCGGFGRCQCGVCHCHANRTGRACECSGDMDSCISPEGGLCSGHGRCKCNRCQCLDGYYGALCDQCPGCKTPCERHRDCAECGAFRTGPLATNCSTACAHTNVTLALAPILDDGWCKERTLDNQLFFFLVEDDARGTVVLRVRPQEKGADHTQAIVLGCVGGIVAVGLGLVLAYRLSVEIYDRREYSRFEKEQQQLNWKQDSNPLYKSAITTTINPRFQEADSPTL
β7348β1(即β7的第1-348位连接β1的第337-778位)氨基酸序列(SEQ ID NO：38)：ELDAKIPSTGDATEWRNPHLSMLGSCQPAPSCQKCILSHPSCAWCKQLNFTASGEAEARRCARREELLARGCPLEELEEPRGQQEVLQDQPLSQGARGEGATQLAPQRVRVTLRPGEPQQLQVRFLRAEGYPVDLYYLMDLSYSMKDDLERVRQLGHALLVRLQEVTHSVRIGFGSFVDKTVLPFVSTVPSKLRHPCPTRLERCQSPFSFHHVLSLTGDAQAFEREVGRQSVSGNLDSPEGGFDAILQAALCQEQIGWRNVSRLLVFTSDDTFHTAGDGKLGGIFMPSDGHCHLDSNGLYSRSTEFDYPSVGQVAQALSAANIQPIFAVTSAALPVYQELSKLIPKSAVGTLSANSSNVIQLI IDAYNSLSSEVILENGKLSEGVTISYKSYCKNGVNGTGENGRKCSNISIGDEVQFEISITSNKCPKKDSDSFKIRPLGFTEEVEVILQYICECECQSEGIPESPKCHEGNGTFECGACRCNEGRVGRHCECSTDEVNSEDMDAYCRKENSSEICSNNGECVCGQCVCRKRDNTNEIYSGKFCECDNFNCDRSNGLICGGNGVCKCRVCECNPNYTGSACDCSLDTSTCEASNGQICNGRGICECGVCKCTDPKFQGQTCEMCQTCLGVCAEHKECVQCRAFNKGEKKDTCTQECSYFNITKVESRDKLPQPVQPDPVSHCKEKDVDDCWFYFTYSVNGNNEVMVHVVENPECPTGPDIIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIWKLLMIIHDRREFAKFEKEKMNAKWDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGK
β1131β7348β1(β1的第131-336位被β7的第141-348位取代，也即β1的第1-130位连接 β7的第141-348位连接β1第337-778位)氨基酸序列(SEQ ID NO：13)：
QTDENRCLKANAKSCGECIQAGPNCGWCTNSTFLQEGMPTSARCDDLEALKKKGCPPDDIENPRGSKDIKKNKNVTNRSKGTAEKLKPEDITQIQPQQLVLRLRSGEPQTFTLKFKRAEDYPIDLYYLMDLSYSMKDDLERVRQLGHALLVRLQEVTHSVRIGFGSFVDKTVLPFVSTVPSKLRHPCPTRLERCQSPFSFHHVLSLTGDAQAFEREVGRQSVSGNLDSPEGGFDAILQAALCQEQIGWRNVSRLLVFTSDDTFHTAGDGKLGGIFMPSDGHCHLDSNGLYSRSTEFDYPSVGQVAQALSAANIQPIFAVTSAALPVYQELSKLIPKSAVGTLSANSSNVIQLIIDAYNSLSSEVILENGKLSEGVTISYKSYCKNGVNGTGENGRKCSNISIGDEVQFEISITSNKCPKKDSDSFKIRPLGFTEEVEVILQYICECECQSEGIPESPKCHEGNGTFECGACRCNEGRVGRHCECSTDEVNSEDMDAYCRKENSSEICSNNGECVCGQCVCRKRDNTNEIYSGKFCECDNFNCDRSNGLICGGNGVCKCRVCECNPNYTGSACDCSLDTSTCEASNGQICNGRGICECGVCKCTDPKFQGQTCEMCQTCLGVCAEHKECVQCRAFNKGEKKDTCTQECSYFNITKVESRDKLPQPVQPDPVSHCKEKDVDDCWFYFTYSVNGNNEVMVHVVENPECPTGPDI IPIVAGVVAGIVLIGLALLLIWKLLMI IHDRREFAKFEKEKMNAKWDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGK
β7141β1336β7(即β7的第141-348位被β1的第131-336位取代，也即β7的第1-140位连接β1的第131-336位连接β7的第349-779位)氨基酸序列(SEQ ID NO：14)：
ELDAKIPSTGDATEWRNPHLSMLGSCQPAPSCQKCILSHPSCAWCKQLNFTASGEAEARRCARREELLARGCPLEELEEPRGQQEVLQDQPLSQGARGEGATQLAPQRVRVTLRPGEPQQLQVRFLRAEGYPVDLYYLMDLSYSMKDDLENVKSLGTDLMNEMRRITSDFRIGFGSFVEKTVMPYISTTPAKLRNPCTSEQNCTSPFSYKNVLSLTNKGEVFNELVGKQRISGNLDSPEGGFDAIMQVAVCGSLIGWRNVTRLLVFSTDAGFHFAGDGKLGGIVLPNDGQCHLENNMYTMSHYYDYPSIAHLVQKLSENNIQTIFAVTEEFQPVYKELKNLIPKSAVGELSEDSSNVVQLIMDAYNSLSSTVTLEHSSLPPGVHISYESQCEGPEKREGKAEDRGQCNHVRINQTVTFWVSLQATHCLPEPHLLRLRALGFSEELIVELHTLCDCNCSDTQPQAPHCSDGQGHLQCGVCSCAPGRLGRLCECSVAELSSPDLESGCRAPNGTGPLCSGKGHCQCGRCSCSGQSSGHLCECDDASCERHEGILCGGFGRCQCGVCHCHANRTGRACECSGDMDSCISPEGGLCSGHGRCKCNRCQCLDGYYGALCDQCPGCKTPCERHRDCAECGAFRTGPLATNCSTACAHTNVTLALAPILDDGWCKERTLDNQLFFFLVEDDARGTVVLRVRPQEKGADHTQAIVLGCVGGIVAVGLGLVLAYRLSVEIYDRREYSRFEKEQQQLNWKQDSNPLYKSAITTTINPRFQEADSPTL
β1255β7348β1(即β1的第255-336位被β7的第266-348位取代，也即β1的第1-254位连接β7的第266-348位连接β1的第337-778位)氨基酸序列(SEQ ID NO：39)：
QTDENRCLKANAKSCGECIQAGPNCGWCTNSTFLQEGMPTSARCDDLEALKKKGCPPDDIENPRGSKDIKKNKNVTNRSKGTAEKLKPEDITQIQPQQLVLRLRSGEPQTFTLKFKRAEDYPIDLYYLMDLSYSMKDDLENVKSLGTDLMNEMRRITSDFRIGFGSFVEKTVMPYISTTPAKLRNPCTSEQNCTSPFSYKNVLSLTNKGEVFNELVGKQRISGNLDSPEGGFDAIMQVAVCGSLIGWRNVTRLLVVFTSDDTFHTAGDGKLGGIFMPSDGHCHLDSNGLYSRSTEFDYPSVGQVAQALSAANIQPIFAVTSAALPVYQELSKLIPKSAVGTLSANSSNVIQLIIDAYNSLSSEVILENGKLSEGVTISYKSYCKNGVNGTGENGRKCSNISIGDEVQFEISITSNKCPKKDSDSFKIRPLGFTEEVEVILQYICECECQSEGIPESPKCHEGNGTFECGACRCNEGRVGRHCECSTDEVNSEDMDAYCRKENSSEICSNNGECVCGQCVCRKRDNTNEIYSGKFCECDNFNCDRSNGLICGGNGVCKCRVCECNPNYTGSACDCSLDTSTCEASNGQICNGRGICECGVCKCTDPKFQGQTCEMCQTCLGVCAEHKECVQCRAFNKGEKKDTCTQECSYFNITKVESRDKLPQPVQPDPVSHCKEKDVDDCWFYFTYSVNGNNEVMVHVVENPECPTGPDI IPIVAGVVAGIVLIGLALLLIWKLLMI IHDRREFAKFEKEKMNAKWDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGK
β7266β1336β7(即β7的第266-348位被β1的第255-336位取代，也即β7的第1-265位连接β1的第255-336位连接β7的第349-779位)氨基酸序列(SEQ ID NO：16)：
ELDAKIPSTGDATEWRNPHLSMLGSCQPAPSCQKCILSHPSCAWCKQLNFTASGEAEARRCARREELLARGCPLEELEEPRGQQEVLQDQPLSQGARGEGATQLAPQRVRVTLRPGEPQQLQVRFLRAEGYPVDLYYLMDLSYSMKDDLERVRQLGHALLVRLQEVTHSVRIGFGSFVDKTVLPFVSTVPSKLRHPCPTRLERCQSPFSFHHVLSLTGDAQAFEREVGRQSVSGNLDSPEGGFDAILQAALCQEQIGWRNVSRLLVVFSTDAGFHFAGDGKLGGIVLPNDGQCHLENNMYTMSHYYDYPSIAHLVQKLSENNIQTIFAVTEEFQPVYKELKNLIPKSAVGELSEDSSNVVQLIMDAYNSLSSTVTLEHSSLPPGVHISYESQCEGPEKREGKAEDRGQCNHVRINQTVTFWVSLQATHCLPEPHLLRLRALGFSEELIVELHTLCDCNCSDTQPQAPHCSDGQGHLQCGVCSCAPGRLGRLCECSVAELSSPDLESGCRAPNGTGPLCSGKGHCQCGRCSCSGQSSGHLCECDDASCERHEGILCGGFGRCQCGVCHCHANRTGRACECSGDMDSCISPEGGLCSGHGRCKCNRCQCLDGYYGALCDQCPGCKTPCERHRDCAECGAFRTGPLATNCSTACAHTNVTLALAPILDDGWCKERTLDNQLFFFLVEDDARGTVVLRVRPQEKGADHTQAIVLGCVGGIVAVGLGLVLAYRLSVEIYDRREYSRFEKEQQQLNWKQDSNPLYKSAITTTINPRFQEADSPTL
β1319β7348β1(即β1的第319-336位被β7的第331-348位取代，也即β1的第1-318位连接β7的第331-348位连接β1的第337-778位)氨基酸序列(SEQ ID NO：15)：
QTDENRCLKANAKSCGECIQAGPNCGWCTNSTFLQEGMPTSARCDDLEALKKKGCPPDDIENPRGSKDIKKNKNVTNRSKGTAEKLKPEDITQIQPQQLVLRLRSGEPQTFTLKFKRAEDYPIDLYYLMDLSYSMKDDLENVKSLGTDLMNEMRRITSDFRIGFGSFVEKTVMPYISTTPAKLRNPCTSEQNCTSPFSYKNVLSLTNKGEVFNELVGKQRISGNLDSPEGGFDAIMQVAVCGSLIGWRNVTRLLVFSTDAGFHFAGDGKLGGIVLPNDGQCHLENNMYTMSHYYDYPSIAHLVQKLSENNIQTIFAVTSAALPVYQELSKLIPKSAVGTLSANSSNVIQLIIDAYNSLSSEVILENGKLSEGVTISYKSYCKNGVNGTGENGRKCSNISIGDEVQFEISITSNKCPKKDSDSFKIRPLGFTEEVEVILQYICECECQSEGIPESPKCHEGNGTFECGACRCNEGRVGRHCECSTDEVNSEDMDAYCRKENSSEICSNNGECVCGQCVCRKRDNTNEIYSGKFCECDNFNCDRSNGLICGGNGVCKCRVCECNPNYTGSACDCSLDTSTCEASNGQICNGRGICECGVCKCTDPKFQGQTCEMCQTCLGVCAEHKECVQCRAFNKGEKKDTCTQECSYFNITKVESRDKLPQPVQPDPVSHCKEKDVDDCWFYFTYSVNGNNEVMVHVVENPECPTGPDIIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIWKLLMIIHDRREFAKFEKEKMNAKWDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGK
β7331β1336β7(即β7的第331-348位被β1的第319-336位取代，也即β7的第1-330位连接β1的第319-336位连接β7的第349-779位)氨基酸序列(SEQ ID NO：40)：
ELDAKIPSTGDATEWRNPHLSMLGSCQPAPSCQKCILSHPSCAWCKQLNFTASGEAEARRCARREELLARGCPLEELEEPRGQQEVLQDQPLSQGARGEGATQLAPQRVRVTLRPGEPQQLQVRFLRAEGYPVDLYYLMDLSYSMKDDLERVRQLGHALLVRLQEVTHSVRIGFGSFVDKTVLPFVSTVPSKLRHPCPTRLERCQSPFSFHHVLSLTGDAQAFEREVGRQSVSGNLDSPEGGFDAILQAALCQEQIGWRNVSRLLVFTSDDTFHTAGDGKLGGIFMPSDGHCHLDSNGLYSRSTEFDYPSVGQVAQALSAANIQPIFAVTEEFQPVYKELKNLIPKSAVGELSEDSSNVVQLIMDAYNSLSSTVTLEHSSLPPGVHISYESQCEGPEKREGKAEDRGQCNHVRINQTVTFWVSLQATHCLPEPHLLRLRALGFSEELIVELHTLCDCNCSDTQPQAPHCSDGQGHLQCGVCSCAPGRLGRLCECSVAELSSPDLESGCRAPNGTGPLCSGKGHCQCGRCSCSGQSSGHLCECDDASCERHEGILCGGFGRCQCGVCHCHANRTGRACECSGDMDSCISPEGGLCSGHGRCKCNRCQCLDGYYGALCDQCPGCKTPCERHRDCAECGAFRTGPLATNCSTACAHTNVTLALAPILDDGWCKERTLDNQLFFFLVEDDARGTVVLRVRPQEKGADHTQAIVLGCVGGIVAVGLGLVLAYRLSVEIYDRREYSRFEKEQQQLNWKQDSNPLYKSAITTTINPRFQEADSPTL
嵌合体质粒构建方法：
β1535β7、β7542β1、β1336β7、β7348β1、β1131β7348β1、β7141β1336β7、β1255β7348β1、β7266β1336β7、β1319β7348β1和β7331β1336β7这几个质粒的构建采用的是一种方法，就是重叠延伸PCR(overlapping extension PCR)。具体构建方法，以β7542β1为例，序列比对β1和β7的DNA序列，发现在β7的第542位aa的DNA编码序列附近和β1在此处的DNA序列完全相同，以此相同序列设计一对反向互补的引物，然后分别结合β7DNA序列的5’端引物PCR扩出编码β7的1-542aa的序列，结合β1DNA序列的3’端引物PCR扩出编码β1的543到C端的序列。因为这两段序列分别有一端是互补的序列，所以在进行第二轮PCR就扩出了整个嵌合体的编码序列。最后全长的每一个嵌合体的5’端引物都有一个XbaI酶切位点，3’端引物都有一个AflII酶切位点，最后插入到pcDNA3.1(-)(Invitrogen)载体中。同理β7141β1348β7的构建也是同一种方法，只是第一轮PCR是三段，然后第二轮三段一块做模板扩出全长嵌合体编码序列。
构建所用引物序列为：
β7-F：gctctagaatggtggctttgccaatggtcc(SEQ ID NO：17)；
β7-R：cccttaagtcagagagtgggactgtctgcctc(SEQ ID NO：18)；
β1-F：gctctagaatgaatttacaaccaattttc(SEQ ID NO：19)；
β1-R：cccttaagtcattttccctcatacttcg(SEQ ID NO：20)；
β7-542-F：tgcgagtgtga(SEQ ID NO：21)；
β7-542-R：tcacactcgca(SEQ ID NO：22)；
β7-348-F：cctaagtctgcagt(SEQ ID NO：25)；
β7-348-R：actgcagacttagg(SEQ ID NO：26)；
β7-141-F：tactaccttatggacctg(SEQ ID NO：23)；
β7-141-R：caggtccataaggtagta(SEQ ID NO：24)；
β7-266-F：cggctgctggtgtt(SEQ ID NO：41)；
β7-266-R：aacaccagcagccg(SEQ ID NO：42)。
β1319β7348β1和β7331β1336β7的构建是采用定点突变的常规方法，如β7331β1345β7就表示把β7的331-348位氨基酸序列突变为β1上相应的319-336位氨基酸序列，反之亦然。
引物序列为：
β7331β1336β7-F：aaggagctgaaaaacttgatccctaagtctgcagttg(SEQ ID NO：27)；
β7331β1336β7-R：gtaaacaggctgaaattcttcggtgacagcaaagatg(SEQ ID NO：28)；
β1319β7348β1-F：caggagctgagtaaactgattcctaagtcagcagtaggaacatta(SEQ ID NO：29)；
β1319β7348β1-R：gtagacaggcagtgcggcactagtaactgcaaaaattgtctgaat(SEQ ID NO：30)。
然后将所构建的能够表达嵌合体蛋白的质粒瞬转293T细胞并进行流式细胞术检测，最后得到J19识别的抗原表位在β7亚基的第331-348位氨基酸(图3B，序列是SAALPVYQELSKLIPKSA)。每个嵌合体都可以正常表达，其表达效率通过α4的抗体9F10(由购自Developmental Studies Hybridoma Bank，University of Iowa的杂交瘤细胞纯化)来测定，然后根据野生型α4β7的表达效率以及J19的识别进行标准化。
其次构建了一系列α4和αE嵌合体(嵌合体插入到pcDNA3.1(-)(Invitrogen)的XbaI和AflII位点后转293T细胞)。
嵌合体构建序列(氨基酸序列)如下：
α4氨基酸序列(SEQ ID NO：33)：
YNVDTESALLYQGPHNTLFGYSVVLHSHGANRWLLVGAPTANWLANASVINPGAIYRCRIGKNPGQTCEQLQLGSPNGEPCGKTCLEERDNQWLGVTLSRQPGENGSIVTCGHRWKNIFYIKNENKLPTGGCYGVPPDLRTELSKRIAPCYQDYVKKFGENFASCQAGISSFYTKDLIVMGAPGSSYWTGSLFVYNITTNKYKAFLDKQNQVKFGSYLGYSVGAGHFRSQHTTEVVGGAPQHEQIGKAYIFSIDEKELNILHEMKGKKLGSYFGASVCAVDLNADGFSDLLVGAPMQSTIREEGRVFVYINSGSGAVMNAMETNLVGSDKYAARFGESIVNLGDIDNDGFEDVAIGAPQEDDLQGAIYIYNGRADGISSTFSQRIEGLQISKSLSMFGQSISGQIDADNNGYVDVAVGAFRSDSAVLLRTRPVVIVDASLSHPESVNRTKFDCVENGWPSVCIDLTLCFSYKGKEVPGYIVLFYNMSLDVNRKAESPPRFYFSSNGTSDVITGSIQVSSREANCRTHQAFMRKDVRDILTPIQIEAAYHLGPHVISKRSTEEFPPLQPILQQKKEKDIMKKTINFARFCAHENCSADLQVSAKIGFLKPHENKTYLAVGSMKTLMLNVSLFNAGDDAYETTLHVKLPVGLYFIKILELEEKQINCEVTDNSGVVQLDCSIGYIYVDHLSRIDISFLLDVSSLSRAEEDLSITVHATCENEEEMDNLKHSRVTVAIPLKYEVKLTVHGFVNPTSFVYGSNDENEPETCMVEKMNLTFHVINTGNSMAPNVSVEIMVPNSFSPQTDKLFNILDVQTTTGECHFENYQRVCALEQQKSAMQTLKGIVRFLSKTDKRLLYCIKADPHCLNFLCNFGKMESGKEASVHIQLEGRPSILEMDETSALKFEIRATGFPEPNPRVIELNKDENVAHVLLEGLHHQRPKRYFTIVIISSSLLLGLIVIIIISYVMWKAGFFKRQYKSILQEENRRDSWSYINSKSNDD
α4核苷酸序列(其中下划线为信号肽编码序列)(SEQ ID NO：43)：
atggcttgggaagcgaggcgcgaacccggcccccgaagggccgccgtccgggagacggtgatgctgttgctgtgcctgggggtcccgaccggccgcccctacaacgtggacactgagagcgcgctgctttaccagggcccccacaacacgctgttcggctactcggtcgtgctgcacagccacggggcgaaccgatggctcctagtgggtgcgcccactgccaactggctcgccaacgcttcagtgatcaatcccggggcgatttacagatgcaggatcggaaagaatcccggccagacgtgcgaacagctccagctgggtagccctaatggagaaccttgtggaaagacttgtttggaagagagagacaatcagtggttgggggtcacactttccagacagccaggagaaaatggatccatcgtgacttgtgggcatagatggaaaaatatattttacataaagaatgaaaataagctccccactggtggttgctatggagtgccccctgatttacgaacagaactgagtaaaagaatagctccgtgttatcaagattatgtgaaaaaatttggagaaaattttgcatcatgtcaagctggaatatccagtttttacacaaaggatttaattgtgatgggggccccaggatcatcttactggactggctctctttttgtctacaatataactacaaataaatacaaggcttttttagacaaacaaaatcaagtaaaatttggaagttatttaggatattcagtcggagctggtcattttcggagccagcatactaccgaagtagtcggaggagctcctcaacatgagcagattggtaaggcatatatattcagcattgatgaaaaagaactaaatatcttacatgaaatgaaaggtaaaaagcttggatcgtactttggagcttctgtctgtgctgtggacctcaatgcagatggcttctcagatctgctcgtgggagcacccatgcagagcaccatcagagaggaaggaagagtgtttgtgtacatcaactctggctcgggagcagtaatgaatgcaatggaaacaaacctcgttggaagtgacaaatatgctgcaagatttggggaatctatagttaatcttggcgacattgacaatgatggctttgaagatgttgctatcggagctccacaagaagatgacttgcaaggtgctatttatatttacaatggccgtgcagatgggatctcgtcaaccttctcacagagaattgaaggacttcagatcagcaaatcgttaagtatgtttggacagtctatatcaggacaaattgatgcagataataatggctatgtagatgtagcagttggtgcttttcggtctgattctgctgtcttgctaaggacaagacctgtagtaattgttgacgcttctttaagccaccctgagtcagtaaatagaacgaaatttgactgtgttgaaaatggatggccttctgtgtgcatagatctaacactttgtttctcatataagggcaaggaagttccaggttacattgttttgttttataacatgagtttggatgtgaacagaaaggcagagtctccaccaagattctatttctcttctaatggaacttctgacgtgattacaggaagcatacaggtgtccagcagagaagctaactgtagaacacatcaagcatttatgcggaaagatgtgcgggacatcctcaccccaattcagattgaagctgcttaccaccttggtcctcatgtcatcagtaaacgaagtacagaggaattcccaccacttcagccaattcttcagcagaagaaagaaaaagacataatgaaaaaaacaataaactttgcaaggttttgtgcccatgaaaattgttctgctgatttacaggtttctgcaaagattgggtttttgaagccccatgaaaataaaacatatcttgctgttgggagtatgaagacattgatgttgaatgtgtccttgtttaatgctggagatgatgcatatgaaacgactctacatgtcaaactacccgtgggtctttatttcattaagattttagagctggaagagaagcaaataaactgtgaagtcacagataactctggcgtggtacaacttgactgcagtattggctatatatatgtagatcatctctcaaggatagatattagctttctcctggatgtgagctcactcagcagagcggaagaggacctcagtatcacagtgcatgctacctgtgaaaatgaagaggaaatggacaatctaaagcacagcagagtgactgtagcaatacctttaaaatatgaggttaagctgactgttcatgggtttgtaaacccaacttcatttgtgtatggatcaaatgatgaaaatgagcctgaaacgtgcatggtggagaaaatgaacttaactttccatgttatcaacactggcaatagtatggctcccaatgttagtgtggaaataatggtaccaaattcttttagcccccaaactgataagctgttcaacattttggatgtccagactactactggagaatgccactttgaaaattatcaaagagtgtgtgcattagagcagcaaaagagtgcaatgcagaccttgaaaggcatagtccggttcttgtccaagactgataagaggctattgtactgcataaaagctgatccacattgtttaaatttcttgtgtaattttgggaaaatggaaagtggaaaagaagccagtgttcatatccaactggaaggccggccatccattttagaaatggatgagacttcagcactcaagtttgaaataagagcaacaggttttccagagccaaatccaagagtaattgaactaaacaaggatgagaatgttgcgcatgttctactggaaggactacatcatcaaagacccaaacgttatttcaccatagtgattatttcaagtagcttgctacttggacttattgtacttctgttgatctcatatgttatgtggaaggctggcttctttaaaagacaatacaaatctatcctacaagaagaaaacagaagagacagttggagttatatcaacagtaaaagcaatgatgattaa
αE氨基酸序列(SEQ ID NO：44)：
FNVDVARPWLTPKGGAPFVLSSLLHQDPSTNQTWLLVTSPRTKRTPGPLHRCSLVQDEILCHPVEHVPIPKGRHRGVTVVRSHHGVLICIQVLVRRPHSLSSELTGTCSLLGPDLRPQAQANFFDLENLLDPDARVDTGDCYSNKEGGGEDDVNTARQRRALEKEEEEDKEEEEDEEEEEAGTEIAIILDGSGSIDPPDFQRAKDFISNMMRNFYEKCFECNFALVQYGGVIQTEFDLRDSQDVMASLARVQNITQVGSVTKTASAMQHVLDSIFTSSHGSRRKASKVMVVLTDGGIFEDPLNLTTVINSPKMQGVERFAIGVGEEFKSARTARELNLIASDPDETHAFKVTNYMALDGLLSKLRYNIISMEGTVGDALHYQLAQIGFSAQILDERQVLLGAVGAFDWSGGALLYDTRSRRGRFLNQTAAAAADAEAAQYSYLGYAVAVLHKTCSLSYIAGAPRYKHHGAVFELQKEGREASFLPVLEGEQMGSYFGSELCPVDIDMDGSTDFLLVAAPFYHVHGEEGRVYVYRLSEQDGSFSLARILSGHPGFTNARFGFAMAAMGDLSQDKLTDVAIGAPLEGFGADDGASFGSVYIYNGHWDGLSASPSQRIRASTVAPGLQYFGMSMAGGFDISGDGLADITVGTLGQAVVFRSRPVVRLKVSMAFTPSALPIGFNGVVNVRLCFEISSVTTASESGLREALLNFTLDVDVGKQRRRLQCSDVRSCLGCLREWSSGSQLCEDLLLMPTEGELCEEDCFSNASVKVSYQLQTPEGQTDHPQPILDRYTEPFAIFQLPYEKACKNKLFCVAELQLATTVSQQELVVGLTKELTLNINLTNSGEDSYMTSMALNYPRNLQLKRMQKPPSPNIQCDDPQPVASVLIMNCRIGHPVLKRSSAHVSVVWQLEENAFPNRTADITVTVTNSNERRSLANETHTLQFRHGFVAVLSKPSIMYVNTGQGLSHHKEFLFHVHGENLFGAEYQLQICVPTKLRGLQVVAVKKLTRTQASTVCTWSQERACAYSSVQHVEEWHSVSCVIASDKENVTVAAEISWDHSEELLKDVTELQILGEISFNKSLYEGLNAENHRTKITVVFLKDEKYHSLPIIIKGSVGGLLVLIVILVILFKC GFFKRKYQQLNLESIRKAQLKSENLLEEEN
αE核苷酸序列(其中下划线为信号肽编码序列)(SEQ ID NO：45)：
atgtggctcttccacactctgctctgcatagccagcctggccctgctggccgctttcaatgtggatgtggcccggccctggctcacgcccaagggaggtgcccctttcgtgctcagctcccttctgcaccaagaccccagcaccaaccagacctggctcctggtcaccagccccagaaccaagaggacaccagggcccctccatcgatgttcccttgtccaggatgaaatcctttgccatcctgtagagcatgtccccatccccaaggggaggcaccggggagtgaccgttgtccggagccaccacggtgttttgatatgcattcaagtgctggtccggcggcctcacagcctcagctcagaactcacaggcacctgtagcctcctgggccctgacctccgtccccaggctcaggccaacttcttcgaccttgaaaatctcctggatccagatgcacgtgtggacactggagactgctacagcaacaaagaaggcggtggagaagacgatgtgaacacagccaggcagcgccgggctctggagaaggaggaggaggaagacaaggaggaggaggaagacgaggaggaggaggaagctggcaccgagattgccatcatcctggatggctcaggaagcattgatcccccagactttcagagagccaaagacttcatctccaacatgatgaggaacttctatgaaaagtgttttgagtgcaactttgccttggtgcagtatggaggagtgatccagactgagtttgaccttcgggacagccaggatgtgatggcctccctcgccagagtccagaacatcactcaagtggggagtgtcaccaagactgcctcagccatgcaacacgtcttagacagcatcttcacctcaagccacggctccaggagaaaggcatccaaggtcatggtggtgctcaccgatggtggcatattcgaggaccccctcaaccttacgacagtcatcaactcccccaaaatgcagggtgttgagcgctttgccattggggtgggagaagaatttaagagtgctaggactgcgagggaactgaacctgatcgcctcagacccggatgagacccatgctttcaaggtgaccaactacatggcgctggatgggctgctgagcaaactgcggtacaacatcatcagcatggaaggcacggttggagacgcccttcactaccagctggcacagattggcttcagtgctcagatcctggatgagcggcaggtgctgctcggcgccgtcggggcctttgactggtccggaggggcgttgctctacgacacacgcagccgccggggccgcttcctgaaccagacagcggcggcggcggcagacgcggaggctgcgcagtacagctacctgggttacgctgtggccgtgctgcacaagacctgcagcctctcctacatcgcgggggctccacggtacaaacatcatggggccgtgtttgagctccagaaggagggcagagaggccagcttcctgccagtgctggagggagagcagatggggtcctattttggctctgagctgtgccctgtggacattgacatggatggaagcacggacttcttgctggtggctgctccattttaccacgttcatggagaagaaggcagagtctacgtgtaccgtctcagcgagcaggatggttctttctccttggcacgcatactgagtgggcaccccgggttcaccaatgcccgctttggctttgccatggcggctatgggggatctcagtcaggataagctcacagatgtggccatcggggcccccctggaaggttttggggcagatgatggtgccagcttcggcagtgtgtatatctacaatggacactgggacggcctctccgccagcccctcgcagcggatcagagcctccacggtggccccaggactccagtacttcggcatgtccatggctggtggctttgatattagtggcgacggccttgccgacatcaccgtgggcactctgggccaggcggttgtgttccgctcccggcctgtggttcgcctgaaggtctccatggccttcacccccagcgcactgcccatcggcttcaacggcgtcgtgaatgtccgtttatgttttgaaatcagctctgtaaccacagcctctgagtcaggcctccgcgaggcacttctcaacttcacgctggatgtggatgtggggaagcagaggagacggctgcagtgttcagacgtaagaagctgtctgggctgcctgagggagtggagcagcggatcccagctttgtgaggacctcctgctcatgcccacagagggagagctctgtgaggaggactgcttctccaatgccagtgtcaaagtcagctaccagctccagacccctgagggacagacggaccatccccagcccatcctggaccgctacactgagccctttgccatcttccagctgccctatgagaaggcctgcaagaataagctgttttgtgtcgcagaattacagttggccaccaccgtctctcagcaggagttggtggtgggtctcacaaaggagctgaccctgaacattaacctaactaactccggggaagattcctacatgacaagcatggccttgaattaccccagaaacctgcagttgaagaggatgcaaaagcctccctctccaaacattcagtgtgatgaccctcagccggttgcttctgtcctgatcatgaactgcaggattggtcaccccgtcctcaagaggtcatctgctcatgtttcagtcgtttggcagctagaggagaatgcctttccaaacaggacagcagacatcactgtgactgtcaccaattccaatgaaagacggtctttggccaacgagacccacacccttcaattcaggcatggcttcgttgcagttctgtccaaaccatccataatgtacgtgaacacaggccaggggctttctcaccacaaagaattcctcttccatgtacatggggagaacctctttggagcagaataccagttgcaaatttgcgtcccaaccaaattacgaggtctccaggttgtagcagtgaagaagctgacgaggactcaggcctccacggtgtgcacctggagtcaggagcgcgcttgtgcgtacagttcggttcagcatgtggaagaatggcattcagtgagctgtgtcatcgcttcagataaagaaaatgtcaccgtggctgcagagatctcctgggatcactctgaggagttactaaaagatgtaactgaactgcagatccttggtgaaatatctttcaacaaatctctatatgagggactgaatgcagagaaccacagaactaagatcactgtcgtcttcctgaaagatgagaagtaccattctttgcctatcatcattaaaggcagcgttggtggacttctggtgttgatcgtgattctggtcatcctgttcaagtgtggcttttttaaaagaaaatatcaacaactgaacttggagagcatcaggaaggcccagctgaaatcagagaatctgctcgaagaagagaattag
α4184αE190α4(α4的第184-190位被αE的第404-410位取代，也即α4的第1-183位连接αE的第404-410位连接α4第191-999位)氨基酸序列(SEQ ID NO：46)：
YNVDTESALLYQGPHNTLFGYSVVLHSHGANRWLLVGAPTANWLANASVINPGAIYRCRIGKNPGQTCEQLQLGSPNGEPCGKTCLEERDNQWLGVTLSRQPGENGSIVTCGHRWKNIFYIKNENKLPTGGCYGVPPDLRTELSKRIAPCYQDYVKKFGENFASCQAGISSFYTKDLIVMGAPGAFDWSGSLFVYNITTNKYKAFLDKQNQVKFGSYLGYSVGAGHFRSQHTTEVVGGAPQHEQIGKAYIFSIDEKELNILHEMKGKKLGSYFGASVCAVDLNADGFSDLLVGAPMQSTIREEGRVFVYINSGSGAVMNAMETNLVGSDKYAARFGESIVNLGDIDNDGFEDVAIGAPQEDDLQGAIYIYNGRADGISSTFSQRIEGLQISKSLSMFGQSISGQIDADNNGYVDVAVGAFRSDSAVLLRTRPVVIVDASLSHPESVNRTKFDCVENGWPSVCIDLTLCFSYKGKEVPGYIVLFYNMSLDVNRKAESPPRFYFSSNGTSDVITGSIQVSSREA NCRTHQAFMRKDVRDILTPIQIEAAYHLGPHVISKRSTEEFPPLQPILQQKKEKDIMKKTINFARFCAHENCSADLQVSAKIGFLKPHENKTYLAVGSMKTLMLNVSLFNAGDDAYETTLHVKLPVGLYFIKILELEEKQINCEVTDNSGVVQLDCSIGYIYVDHLSRIDISFLLDVSSLSRAEEDLSITVHATCENEEEMDNLKHSRVTVAIPLKYEVKLTVHGFVNPTSFVYGSNDENEPETCMVEKMNLTFHVINTGNSMAPNVSVEIMVPNSFSPQTDKLFNILDVQTTTGECHFENYQRVCALEQQKSAMQTLKGIVRFLSKTDKRLLYCIKADPHCLNFLCNFGKMESGKEASVHIQLEGRPSILEMDETSALKFEIRATGFPEPNPRVIELNKDENVAHVLLEGLHHQRPKRYFTIVIISSSLLLGLIVLLLISYVMWKAGFFKRQYKSILQEENRRDSWSYINSKSNDD
αE404α4410αE(αE的第404-410位被α4的第184-190位取代，也即αE的第1-403位连接α4的第184-190位连接αE第411-1161位)氨基酸序列(SEQ ID NO：47)：
FNVDVARPWLTPKGGAPFVLSSLLHQDPSTNQTWLLVTSPRTKRTPGPLHRCSLVQDEILCHPVEHVPIPKGRHRGVTVVRSHHGVLICIQVLVRRPHSLSSELTGTCSLLGPDLRPQAQANFFDLENLLDPDARVDTGDCYSNKEGGGEDDVNTARQRRALEKEEEEDKEEEEDEEEEEAGTEIAIILDGSGSIDPPDFQRAKDFISNMMRNFYEKCFECNFALVQYGGVIQTEFDLRDSQDVMASLARVQNITQVGSVTKTASAMQHVLDSIFTSSHGSRRKASKVMVVLTDGGIFEDPLNLTTVINSPKMQGVERFAIGVGEEFKSARTARELNLIASDPDETHAFKVTNYMALDGLLSKLRYNIISMEGTVGDALHYQLAQIGFSAQILDERQVLLGAVGSSYWTGGALLYDTRSRRGRFLNQTAAAAADAEAAQYSYLGYAVAVLHKTCSLSYIAGAPRYKHHGAVFELQKEGREASFLPVLEGEQMGSYFGSELCPVDIDMDGSTDFLLVAAPFYHVHGEEGRVYVYRLSEQDGSFSLARILSGHPGFTNARFGFAMAAMGDLSQDKLTDVAIGAPLEGFGADDGASFGSVYIYNGHWDGLSASPSQRIRASTVAPGLQYFGMSMAGGFDISGDGLADITVGTLGQAVVFRSRPVVRLKVSMAFTPSALPIGFNGVVNVRLCFEISSVTTASESGLREALLNFTLDVDVGKQRRRLQCSDVRSCLGCLREWSSGSQLCEDLLLMPTEGELCEEDCFSNASVKVSYQLQTPEGQTDHPQPILDRYTEPFAIFQLPYEKACKNKLFCVAELQLATTVSQQELVVGLTKELTLNINLTNSGEDSYMTSMALNYPRNLQLKRMQKPPSPNIQCDDPQPVASVLIMNCRIGHPVLKRSSAHVSVVWQLEENAFPNRTADITVTVTNSNERRSLANETHTLQFRHGFVAVLSKPSIMYVNTGQGLSHHKEFLFHVHGENLFGAEYQLQICVPTKLRGLQVVAVKKLTRTQASTVCTWSQERACAYSSVQHVEEWHSVSCVIASDKENVTVAAEISWDHSEELLKDVTELQILGEISFNKSLYEGLNAENHRTKITVVFLKDEKYHSLPIIIKGSVGGLLVLIVILVILFKCGFFKRKYQQLNLESIRKAQLKSENLLEEEN
α4211αE216α4(α4的第211-216位被αE的第436-441位取代，也即α4的第1-210位连接αE的第436-441位连接α4第217-999位)氨基酸序列(SEQ ID NO：48)：
YNVDTESALLYQGPHNTLFGYSVVLHSHGANRWLLVGAPTANWLANASVINPGAIYRCRIGKNPGQTCEQLQLGSPNGEPCGKTCLEERDNQWLGVTLSRQPGENGSIVTCGHRWKNIFYIKNENKLPTGGCYGVPPDLRTELSKRIAPCYQDYVKKFGENFASCQAGISSFYTKDLIVMGAPGSSYWTGSLFVYNITTNKYKAFLDKQNEAAQYSYLGYSVGAGHFRSQHTTEVVGGAPQHEQIGKAYIFSIDEKELNILHEMKGKKLGSYFGASVCAVDLNADGFSDLLVGAPMQSTIREEGRVFVYINSGSGAVMNAMETNLVGSDKYAARFGESIVNLGDIDNDGFEDVAIGAPQEDDLQGAIYIYNGRADGISSTFSQRIEGLQISKSLSMFGQSISGQIDADNNGYVDVAVGAFRSDSAVLLRTRPVVIVDASLSHPESVNRTKFDCVENGWPSVCIDLTLCFSYKGKEVPGYIVLFYNMSLDVNRKAESPPRFYFSSNGTSDVITGSIQVSSREANCRTHQAFMRKDVRDILTPIQIEAAYHLGPHVISKRSTEEFPPLQPILQQKKEKDIMKKTINFARFCAHENCSADLQVSAKIGFLKPHENKTYLAVGSMKTLMLNVSLFNAGDDAYETTLHVKLPVGLYFIKILELEEKQINCEVTDNSGVVQLDCSIGYIYVDHLSRIDISFLLDVSSLSRAEEDLSITVHATCENEEEMDNLKHSRVTVAIPLKYEVKLTVHGFVNPTSFVYGSNDENEPETCMVEKMNLTFHVINTGNSMAPNVSVEIMVPNSFSPQTDKLFNILDVQTTTGECHFENYQRVCALEQQKSAMQTLKGIVRFLSKTDKRLLYCIKADPHCLNFLCNFGKMESGKEASVHIQLEGRPSILEMDETSALKFEIRATGFPEPNPRVIELNKDENVAHVLLEGLHHQRPKRYFTIVIISSSLLLGLIVLLLISYVMWKAGFFKRQYKSILQEENRRDSWSYINSKSNDD
αE436α4441αE(αE的第436-441位被α4的第211-216位取代，也即αE的第1-435位连接α4的第211-216位连接αE第442-1161位)氨基酸序列(SEQ ID NO：49)：
FNVDVARPWLTPKGGAPFVLSSLLHQDPSTNQTWLLVTSPRTKRTPGPLHRCSLVQDEILCHPVEHVPIPKGRHRGVTVVRSHHGVLICIQVLVRRPHSLSSELTGTCSLLGPDLRPQAQANFFDLENLLDPDARVDTGDCYSNKEGGGEDDVNTARQRRALEKEEEEDKEEEEDEEEEEAGTEIAIILDGSGSIDPPDFQRAKDFISNMMRNFYEKCFECNFALVQYGGVIQTEFDLRDSQDVMASLARVQNITQVGSVTKTASAMQHVLDSIFTSSHGSRRKASKVMVVLTDGGIFEDPLNLTTVINSPKMQGVERFAIGVGEEFKSARTARELNLIASDPDETHAFKVTNYMALDGLLSKLRYNIISMEGTVGDALHYQLAQIGFSAQILDERQVLLGAVGAFDWSGGALLYDTRSRRGRFLNQTAAAAADAQVKFGSYLGYAVAVLHKTCSLSYIAGAPRYKHHGAVFELQKEGREASFLPVLEGEQMGSYFGSELCPVDIDMDGSTDFLLVAAPFYHVHGEEGRVYVYRLSEQDGSFSLARILSGHPGFTNARFGFAMAAMGDLSQDKLTDVAIGAPLEGFGADDGASFGSVYIYNGHWDGLSASPSQRIRASTVAPGLQYFGMSMAGGFDISGDGLADITVGTLGQAVVFRSRPVVRLKVSMAFTPSALPIGFNGVVNVRLCFEISSVTT ASESGLREALLNFTLDVDVGKQRRRLQCSDVRSCLGCLREWSSGSQLCEDLLLMPTEGELCEEDCFSNASVKVSYQLQTPEGQTDHPQPILDRYTEPFAIFQLPYEKACKNKLFCVAELQLATTVSQQELVVGLTKELTLNINLTNSGEDSYMTSMALNYPRNLQLKRMQKPPSPNIQCDDPQPVASVLIMNCRIGHPVLKRSSAHVSVVWQLEENAFPNRTADITVTVTNSNERRSLANETHTLQFRHGFVAVLSKPSIMYVNTGQGLSHHKEFLFHVHGENLFGAEYQLQICVPTKLRGLQVVAVKKLTRTQASTVCTWSQERACAYSSVQHVEEWHSVSCVIASDKENVTVAAEISWDHSEELLKDVTELQILGEISFNKSLYEGLNAENHRTKITVVFLKDEKYHSLPIIIKGSVGGLLVLIVILVILFKCGFFKRKYQQLNLESIRKAQLKSENLLEEEN
α4240αE246α4(α4的第240-246位被αE的第463-469位取代，也即α4的第1-239位连接αE的第463-469位连接α4第247-999位)氨基酸序列(SEQ ID NO：50)：
YNVDTESALLYQGPHNTLFGYSVVLHSHGANRWLLVGAPTANWLANASVINPGAIYRCRIGKNPGQTCEQLQLGSPNGEPCGKTCLEERDNQWLGVTLSRQPGENGSIVTCGHRWKNIFYIKNENKLPTGGCYGVPPDLRTELSKRIAPCYQDYVKKFGENFASCQAGISSFYTKDLIVMGAPGSSYWTGSLFVYNITTNKYKAFLDKQNQVKFGSYLGYSVGAGHFRSQHTTEVVGGAPQYKHHGKAYIFSIDEKELNILHEMKGKKLGSYFGASVCAVDLNADGFSDLLVGAPMQSTIREEGRVFVYINSGSGAVMNAMETNLVGSDKYAARFGESIVNLGDIDNDGFEDVAIGAPQEDDLQGAIYIYNGRADGISSTFSQRIEGLQISKSLSMFGQSISGQIDADNNGYVDVAVGAFRSDSAVLLRTRPVVIVDASLSHPESVNRTKFDCVENGWPSVCIDLTLCFSYKGKEVPGYIVLFYNMSLDVNRKAESPPRFYFSSNGTSDVITGSIQVSSREANCRTHQAFMRKDVRDILTPIQIEAAYHLGPHVISKRSTEEFPPLQPILQQKKEKDIMKKTINFARFCAHENCSADLQVSAKIGFLKPHENKTYLAVGSMKTLMLNVSLFNAGDDAYETTLHVKLPVGLYFIKILELEEKQINCEVTDNSGVVQLDCSIGYIYVDHLSRIDISFLLDVSSLSRAEEDLSITVHATCENEEEMDNLKHSRVTVAIPLKYEVKLTVHGFVNPTSFVYGSNDENEPETCMVEKMNLTFHVINTGNSMAPNVSVEIMVPNSFSPQTDKLFNILDVQTTTGECHFENYQRVCALEQQKSAMQTLKGIVRFLSKTDKRLLYCIKADPHCLNFLCNFGKMESGKEASVHIQLEGRPSILEMDETSALKFEIRATGFPEPNPRVIELNKDENVAHVLLEGLHHQRPKRYFTIVIISSSLLLGLIVLLLISYVMWKAGFFKRQYKSILQEENRRDSWSYINSKSNDD
αE463α4469αE(αE的第463-469位被α4的第240-246位取代，也即αE的第1-462位连接α4的第240-246位连接αE第470-1161位)氨基酸序列(SEQ ID NO：51)：
FNVDVARPWLTPKGGAPFVLSSLLHQDPSTNQTWLLVTSPRTKRTPGPLHRCSLVQDEILCHPVEHVPIPKGRHRGVTVVRSHHGVLICIQVLVRRPHSLSSELTGTCSLLGPDLRPQAQANFFDLENLLDPDARVDTGDCYSNKEGGGEDDVNTARQRRALEKEEEEDKEEEEDEEEEEAGTEIAIILDGSGSIDPPDFQRAKDFISNMMRNFYEKCFECNFALVQYGGVIQTEFDLRDSQDVMASLARVQNITQVGSVTKTASAMQHVLDSIFTSSHGSRRKASKVMVVLTDGGIFEDPLNLTTVINSPKMQGVERFAIGVGEEFKSARTARELNLIASDPDETHAFKVTNYMALDGLLSKLRYNIISMEGTVGDALHYQLAQIGFSAQILDERQVLLGAVGAFDWSGGALLYDTRSRRGRFLNQTAAAAADAEAAQYSYLGYAVAVLHKTCSLSYIAGAPQHEQIGAVFELQKEGREASFLPVLEGEQMGSYFGSELCPVDIDMDGSTDFLLVAAPFYHVHGEEGRVYVYRLSEQDGSFSLARILSGHPGFTNARFGFAMAAMGDLSQDKLTDVAIGAPLEGFGADDGASFGSVYIYNGHWDGLSASPSQRIRASTVAPGLQYFGMSMAGGFDISGDGLADITVGTLGQAVVFRSRPVVRLKVSMAFTPSALPIGFNGVVNVRLCFEISSVTTASESGLREALLNFTLDVDVGKQRRRLQCSDVRSCLGCLREWSSGSQLCEDLLLMPTEGELCEEDCFSNASVKVSYQLQTPEGQTDHPQPILDRYTEPFAIFQLPYEKACKNKLFCVAELQLATTVSQQELVVGLTKELTLNINLTNSGEDSYMTSMALNYPRNLQLKRMQKPPSPNIQCDDPQPVASVLIMNCRIGHPVLKRSSAHVSVVWQLEENAFPNRTADITVTVTNSNERRSLANETHTLQFRHGFVAVLSKPSIMYVNTGQGLSHHKEFLFHVHGENLFGAEYQLQICVPTKLRGLQVVAVKKLTRTQASTVCTWSQERACAYSSVQHVEEWHSVSCVIASDKENVTVAAEISWDHSEELLKDVTELQILGEISFNKSLYEGLNAENHRTKITVVFLKDEKYHSLPIIIKGSVGGLLVLIVILVILFKCGFFKRKYQQLNLES I RKAQLKSENLLEEEN
嵌合体质粒构建方法：
α4和αE的嵌合体构建方法是采用定点突变的常规方法，如α4184αE190α4就表示把α4的184-190位氨基酸序列突变为αE上相对应的404-410位氨基酸序列，反之亦然。
引物序列为：
α4184αE190α4-F：gactggtccggatctctttttgtctacaatat(SEQ ID NO：52)；
α4184αE190α4-R：aaaggcccctggggcccccatcacaatta(SEQ ID NO：53)；
αE404α4410αE-F：tactggactggcggggcgttgctctacgacac(SEQ ID NO：54)；
αE404α4410αE-R：agatgatccgacggcgccgagcagcacctg(SEQ ID NO：55)；
α4211αE216α4-F：cagtacagctatttaggatattcagtcggagc(SEQ ID NO：56)；
α4211αE216α4-R：cgcagcctcattttgtttgtctaaaaaagcc(SEQ ID NO：57)；
αE436α4441αE-F：tttggaagttacctgggttacgctgtggccgt(SEQ ID NO：58)；
αE436α4441αE-R：ttttacttgcgcgtctgccgccgccgctgtctg(SEQ ID NO：59)；
α4240αE246α4-F：aacatcatgggaaggcatatatattcagcattg(SEQ ID NO：60)；
α4240αE246α4-R：tgtaccgtggagctcctccgactacttcggtag(SEQ ID NO：61)；
αE463α4469αE-F：gcagattggtgccgtgtttgagctccagaag(SEQ ID NO：62)；
αE463α4469αE-R：tcatgttgaggagcccccgcgatgtaggaga(SEQ ID NO：63)。
然后将所构建的能够表达嵌合体蛋白的质粒瞬转293T细胞并进行流式细胞术检测，最后得到J19识别的抗原表位在α4亚基的第184-190位氨基酸(图3B，序列是GSSYWTG)。每个嵌合体都可以正常表达，其表达效率通过β7的抗体FIB27(购自BD)来测定，然后根据野生型α4β7的表达效率以及J19的识别进行标准化。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。