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1、(10)申请公布号 CN 103319546 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103319546 A *CN103319546A* (21)申请号 201310241313.1 (22)申请日 2013.06.18 C07H 3/06(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (71)申请人 陕西新药技术开发中心 地址 710075 陕西省西安市高新区科技二路 69 号 (72)发明人 杨建刚 肖志强 殷雁鸣 倪亚会 孟祥海 王天 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 蔡和平 (54) 发明名称 一种从地黄中分离高纯度水苏糖。
2、的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种从地黄中分离高纯度水苏 糖的方法， 属于天然产物提取分离技术领域， 包括 以下步骤 ： 1） 将鲜地黄粗提物与水充分混匀后， 得到上样液 ； 2） 用氨丙基键合硅胶装填高压制备 液相色谱柱后， 将上样液上样于高压制备液相色 谱柱， 以乙腈 - 水系统为洗脱液进行洗脱 ； 3） 在 示差检测器检测下进行分段收集， 得到水苏糖液， 将水苏糖液低温减压浓缩干燥后得到高纯度水苏 糖。本发明能够直接、 快速的分离得到水苏糖， 分 离时间短， 分离量大， 收率达到 85% 以上， 纯度高 达到 98% 以上， 且产生的废料少， 柱效高， 所需的 洗脱液体积小， 占地。
3、面积小， 降低了整个工艺的消 耗成本， 填料及溶剂可回收利用， 环境友好， 适合 工业化生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103319546 A CN 103319546 A *CN103319546A* 1/1 页 2 1. 一种从地黄中分离水苏糖的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1） 将鲜地黄粗提物与水按 1g ： 3 7ml 的料液比， 充分混匀后， 得到上样液 ； 2） 用氨丙基键合硅胶装填高压制备液相色谱柱。
4、后， 将上样液上样于高压制备液相色谱 柱， 以乙腈-水系统为洗脱液， 以10200ml/min的速度恒流洗脱3040min， 所述洗脱液 中乙腈与水的体积比为 （68 73） ：（27 32） ； 3） 在示差检测器检测下依据色谱出峰时间进行分段收集， 在水苏糖对应峰开始上升时 收集， 当该峰下降至整个峰高的五分之一时结束收集， 得到水苏糖液， 将水苏糖液减压浓缩 后干燥， 得到高纯度水苏糖。 2. 根据权利要求 1 所述的一种从地黄中分离水苏糖的方法， 其特征在于， 步骤 2） 所述 的上样采用分次上样， 每次上样 10 20ml。 3. 根据权利要求 1 所述的一种从地黄中分离水苏糖的方法。
5、， 其特征在于， 步骤 3） 所述 的减压浓缩后干燥是将水苏糖液浓缩至相对密度为 1.10 1.15 后， 在 20 40下， 真空 干燥 20 40h。 4. 根据权利要求 1 所述的一种从地黄中分离水苏糖的方法， 其特征在于， 所述的氨丙 基键合硅胶在使用前经过活化处理， 首先， 将小颗粒球型氨丙基键合硅胶与乙醇按 1g ： 2 3ml 的料液比， 充分混匀后得到匀浆， 将匀浆超声处理 30 40min 脱除气泡后， 装填入色谱 柱内 ； 其次， 用水泵抽吸液体至硅胶表面无液体为止后， 加压至 45 50bar， 用高流速洗脱 液， 以 200ml/min 的流速， 冲洗掉柱内的乙醇 ； 。
6、最后， 以 100ml/min 的流速， 冲洗 1h， 得到活 化后的氨丙基键合硅胶。 5. 根据权利要求 4 所述的一种从地黄中分离水苏糖的方法， 其特征在于， 所述的加压 是采用活塞进行分步加压， 第一步加压到1520bar， 然后用高流速洗脱液冲洗柱子1h后， 再加压到 45 50bar。 6.根据权利要求4或5所述的一种从地黄中分离水苏糖的方法， 其特征在于， 所述高流 速洗脱液是乙腈与水按 70:30 的体积比配成的洗脱液。 7. 根据权利要求 4 所述的一种从地黄中分离水苏糖的方法， 其特征在于， 其特征在于， 所述的小颗粒球型氨丙基键合硅胶的粒径为 5 20m， 孔径为 8. 根。
7、据权利要求 1 所述的一种从地黄中分离水苏糖的方法， 其特征在于， 所述的高压 制备液相色谱柱柱效降低后， 用质量浓度为 5% 的氨水溶液进行洗脱再生， 再生后用纯水进 行洗脱， 洗脱至流出液中无氨离子。 9. 根据权利要求 1 所述的一种从地黄中分离水苏糖的方法， 其特征在于， 所述的示差 检测器的内部温度设为 30， 外部温度设为 35。 10. 根据权利要求 1 所述的一种从地黄中分离水苏糖的方法， 其特征在于， 所述的鲜 地黄粗提物是将鲜地黄洗净后， 切片， 加水浸提 1 4h 后， 在 80 100下， 加热回流提取 1 5h， 将提取液过滤后， 得滤液 ； 向滤液中加入无水乙醇至乙。
8、醇含量达到 90% 后， 在 0 4下， 静置1014h后， 在30004000r/min下， 离心2535min， 得沉淀 ； 将沉淀加水溶 解后， 用活性炭脱色后， 将脱色液减压浓缩后， 在 25 30下， 真空度达到 0.09 0.15Mpa 后， 真空干燥 20 40h， 得到鲜地黄粗提物。 权 利 要 求 书 CN 103319546 A 2 1/5 页 3 一种从地黄中分离高纯度水苏糖的方法 技术领域 0001 本发明属于天然产物提取分离技术领域， 具体涉及一种从地黄中分离提取水苏糖 的方法。 背景技术 0002 水苏糖作为一种新兴的功能性四聚寡糖， 是一种优良的功能性食品原料， 。
9、具有改 善机体健康的作用， 该功能性四聚寡糖具有调节肠道菌群、 改善脂质代谢。 提高身体免疫力 的功效， 同时该低聚寡糖具有降血糖、 降血脂、 增加胰岛素敏感性作用。 0003 目前， 水苏糖在分离纯化方面主要为离子交换树脂纯化和酶法制备水苏糖， 但是 使用离子交换树脂和酶法制备水苏糖， 制备周期长而且成本较高， 基于以上原因开发新型 分离纯化工艺， 寻找更加经济、 高效、 快捷的分离纯化技术， 越来越多的成为研究者关注的 焦点。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种从地黄中分离水苏糖的方法， 该方法操作简单， 分离 时间短， 成本低， 得到的产物纯度高， 收率高。 0005 本发明是。
10、通过以下技术方案来实现 ： 0006 一种从地黄中分离水苏糖的方法， 包括以下步骤 ： 0007 1） 将鲜地黄粗提物与水按 1g ： 3 7ml 的料液比， 充分混匀后， 得到上样液 ； 0008 2） 用氨丙基键合硅胶装填高压制备液相色谱柱后， 将上样液上样于高压制备液相 色谱柱， 以乙腈-水系统为洗脱液， 以10200ml/min的速度恒流洗脱3040min， 所述洗 脱液中乙腈与水的体积比为 （68 73） ：（27 32） ； 0009 3） 在示差检测器检测下依据色谱出峰时间进行分段收集， 在水苏糖对应峰开始上 升时收集， 当该峰下降至整个峰高的五分之一时结束收集， 得到水苏糖液，。
11、 将水苏糖液减压 浓缩后干燥， 得到高纯度水苏糖。 0010 步骤 2） 所述的上样采用分次上样， 每次上样 10 20ml。 0011 步骤 3） 所述的减压浓缩后干燥是将水苏糖液浓缩至相对密度为 1.10 1.15 后， 在 20 40下， 真空干燥 20 40h。 0012 所述的氨丙基键合硅胶在使用前经过活化处理， 首先， 将小颗粒球型氨丙基键合 硅胶与乙醇按 1g ： 2 3ml 的料液比， 充分混匀后得到匀浆， 将匀浆超声处理 30 40min 脱 除气泡后， 装填入色谱柱内 ； 其次， 用水泵抽吸液体至硅胶表面无液体为止后， 加压至 45 50bar， 用高流速洗脱液， 以200。
12、ml/min的流速， 冲洗掉柱内的乙醇 ； 最后， 以100ml/min的流 速， 冲洗 1h， 得到活化后的氨丙基键合硅胶。 0013 所述的加压是采用活塞进行分步加压， 第一步加压到 15 20bar， 然后用高流速 洗脱液冲洗柱子 1h 后， 再加压到 45 50bar。 0014 所述的高流速洗脱液是乙腈与水按 70:30 的体积比配成的洗脱液。 说 明 书 CN 103319546 A 3 2/5 页 4 0015 所述的小颗粒球型氨丙基键合硅胶的粒径为 5 20m， 孔径为 0016 所述的高压制备液相色谱柱柱效降低后， 用质量浓度为 5% 的氨水溶液进行洗脱 再生， 再生后用纯水。
13、进行洗脱， 洗脱至流出液中无氨离子。 0017 所述的示差检测器的内部温度设为 30， 外部温度设为 35。 0018 所述的鲜地黄粗提物是将鲜地黄洗净后， 切片， 加水浸提14h后， 在80100 下， 加热回流提取 1 5h， 将提取液过滤后， 得滤液 ； 向滤液中加入无水乙醇至乙醇含量达 到 90% 后， 在 0 4下， 静置 10 14h 后， 在 3000 4000r/min 下， 离心 25 35min， 得 沉淀 ； 将沉淀加水溶解后， 用活性炭脱色后， 将脱色液减压浓缩后， 在 25 30下， 真空度 达到 0.09 0.15Mpa 后， 真空干燥 20 40h， 得到鲜地黄粗。
14、提物。 0019 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ： 0020 本发明将高压制备色谱分离首次应用到水苏糖的提取中， 使用氨丙基键合硅胶作 为柱填料， 成功分离得到高纯度水苏糖， 分离过程中只使用乙腈和水这一种色谱体系， 进行 恒流等速等梯度洗脱， 采用示差检测器在线监测法分离产物和杂质， 做到精确收集， 分离过 程简单快捷， 一次分离就能达到目的， 不需要任何化学处理方法， 不会损失水苏糖， 能直接、 快速的分离得到水苏糖， 且分离时间短， 分离量大， 收率达到 85% 以上， 且得到的水苏糖纯 度高达到 98% 以上。 0021 本发明方法产生的废料少， 柱效高， 所需的洗脱。
15、液体积小， 占地面积小， 降低了整 个工艺的消耗成本， 填料及溶剂可回收利用， 环境友好， 适合工业化生产。 附图说明 0022 图 1 为本发明分段收集地黄粗提物中各成分的 HPLC 色谱图 ； 0023 图 2 为本发明分离得到的水苏糖的 HPLC 测定色图谱。 0024 其中， 1 为葡萄糖， 2 为果糖， 3 为蔗糖， 4 为水苏糖， 5 为棉子糖。 具体实施方式 0025 下面结合具体的附图及实施例对本发明做进一步的详细说明， 所述是对本发明的 解释而不是限定。 0026 本发明所用的试剂及实验仪器 0027 1、 试剂 ： 制备用乙腈、 乙醇、 氨均为分析纯， 分析用乙腈为色谱纯，。
16、 水为二次重蒸 水 ； 0028 2、 实验仪器 ： 本发明采用了国外进口的小颗粒球型氨丙基键合硅胶填料， 可在高 压下使用， 该氨丙基键合硅胶相关杂质的分离度接近分析型 HPLC， 同时具有良好的反复使 用能力， 大直径制备柱为美国进口 （VARIAN） 可自填装高压色谱柱， 高压制备液相系统为美 国进口 （VARIAN） ， 制备用示差折光检测器为美国进口 （VARIAN） ， 自动馏分收集系统为美国 进口 （VARIAN） ， 产品分析使用高效液相色谱仪为美国 （Waters） 生产。 0029 一种从地黄中分离水苏糖的方法， 包括以下步骤 ： 0030 1） 将鲜地黄粗提物与水按 1g。
17、 ： 3 7ml 的料液比， 充分混匀后， 得到样品 ； 0031 2） 用氨丙基键合硅胶装填高压制备液相色谱柱后， 将样品分次上样于高压制备液 相色谱柱， 以乙腈-水系统为洗脱液， 以10200ml/min的速度恒流洗脱2040min， 所述 说 明 书 CN 103319546 A 4 3/5 页 5 洗脱液中乙腈与水的体积比为 （68 73） ：（27 32） ； 所述的分次上样， 是每次上样 10 20ml 样品 ； 0032 3） 在示差检测器检测下进行分段收集， 得到水苏糖液， 将水苏糖液低温减压干燥 后得到高纯度水苏糖。 0033 使用的鲜地黄粗提物是将鲜地黄洗净后， 切片， 加。
18、水浸提 1 4h 后， 再在 80 100下， 加热回流提取 1 5h， 收集提取液， 将提取液趁热过滤后， 向滤液中加入无水乙醇 摇匀至含醇量达90%后， 低温放置1014小时， 取出后在30004000r/min下， 离心25 35min， 弃去上清液， 沉淀物用水溶解使用活性炭脱色， 将脱色液减压浓缩后， 在 20 40 下， 真空度达到 0.09 0.15Mpa 时， 真空干燥 20 40h， 得到地黄粗提物。 0034 在纯化水苏糖之前， 需要进行色谱柱填装， 称取适量的氨丙基键合硅胶填料， 按 1g ： 2 3ml 的料液比， 加入用乙醇充分混匀制成匀浆， 将匀浆超声处理 30 5。
19、0min 脱除气 泡后， 倒入色谱柱管内， 用真空水泵抽吸液体直到硅胶表面刚好没有液体为止， 盖上法兰后 用活塞进行分步加压， 第一次加压到1520bar， 然后用高流速的洗脱液冲洗柱子1h后， 再 加压到 45 50bar， 继续用洗脱液冲洗柱子等速活化， 待用 ； 为取得最佳的分离效果， 柱子 填装高度为 25cm 左右。 0035 将鲜地黄粗提物溶解在水中， 溶解的比例约为 1:3 7， 然后用过滤膜进行过滤， 溶解好的样品分批进样高压制备液相色谱系统进行恒速等梯度洗脱， 洗脱时间为 20 40min ； 洗脱液由乙腈和水两部分组成， 洗脱液的极性控制在水苏糖在高压色谱里的保留时 间为 。
20、10 20min 之间， 整个制备过程的流速保持在 10 200ml/min 之间。 0036 产品在示差检测器检测下依据色谱峰出峰时间进行分段收集 （内部温度 30， 外 部温度35） 。 本发明的色谱分离中， 葡萄糖、 蔗糖、 果糖处于水苏糖的前段， 峰型比较对称， 但峰没有达到基线分离因此分离过程中在峰开始上升时收集， 峰下降至整高的五分之一时 结束收集。 0037 色谱分离过程中收集到的水苏糖洗脱液， 通过旋转蒸发仪浓缩至相对密度 1.10 1.15（60测） 时使用真空干燥， 在 20 40下， 真空度为 0.09 0.15Mpa 下， 真 空干燥 20 40h， 干燥得到的粉末， 。
21、通过高效液相色谱法定量分析纯度在 98% 以上。 0038 经过多次色谱分离， 高压制备液相色谱柱的分离柱效降低， 此时可用质量浓度为 5% 的氨水溶液进行反向冲洗制备柱， 柱流速为色谱分离流速的 10 20%， 然后使用纯水冲 去色谱柱上多余的氨， 来恢复色谱柱柱效。 0039 实施例 1 0040 一种从地黄中分离水苏糖的方法， 包括以下步骤 ： 0041 1） 在 5L 的敞口玻璃容器中， 加入 700g 的 10m 的球型氨丙基键合硅胶， 加入分析 乙醇 2100mL， 搅拌成匀浆， 超声 40min 后， 倒入准备好的直径 5cm， 柱长为 30cm 的不锈钢色 谱柱管内， 抽取液体。
22、盖上法兰， 用乙腈与水按 70:30 的体积比配成的洗脱液， 以 200ml/min 的流速进行洗脱， 冲洗掉色谱柱内乙醇， 柱内用活塞进行分步加压， 第一步加压到 15bar， 然 后用 100ml/min 的流速冲洗 1h 后， 再加压至 50bar， 活化 ； 0042 2） 色谱柱准备完成后， 称取鲜地黄粗提物 100g（水苏糖含量为 38.9%） ， 溶解在 500ml水中， 过滤， 高压制备泵流速50ml/min， 进样10ml， 以乙腈与水的体积比68:32为洗脱 液， 进行恒速洗脱， 在示差检测器下 （内部温度 30， 外部温度 35） 检测整个洗脱过程， 通 说 明 书 CN。
23、 103319546 A 5 4/5 页 6 过软件观察色谱峰， 参见图 1， 在 15.8min 水苏糖产物峰上升， 通过自动馏分收集器进行收 集， 收集时间为水苏糖峰开始上升阶段 15.87 分钟， 水苏糖峰下降整峰高五分之一结束收 集， 30min 后结束本次洗脱系统， 图谱中 1 为葡萄糖， 2 为果糖， 3 为蔗糖， 4 为水苏糖， 5 为棉 子糖 ； 本次洗脱结束后进行重复进样收集， 直至配制的鲜地黄粗提取样品进样完毕 ； 0043 3） 收集液在旋转蒸发仪中回收溶剂， 至相对密度 1.10 （60测） ， 使用真空干燥 （真 空度为 0.09 0.15Mpa， 温度不高于 30）。
24、 干燥 20 40h， 得到干燥粉末 32.6g， 通过高效 液相色谱法定量分析， 参见图 2， 水苏糖含量为 98.6%， 得率为 87.4%。 0044 实施例 2 0045 一种从地黄中分离水苏糖的方法， 包括以下步骤 ： 0046 1） 在 5L 的敞口玻璃容器中， 加入 200g 的 5m 的球型氨丙基键合硅胶， 加入分析 乙醇 600mL， 搅拌成匀浆， 超声 30min 后， 倒入准备好的直径 1.5cm， 柱长为 20cm 的不锈钢色 谱柱管内， 抽取液体盖上法兰， 用乙腈与水按 70:30 的体积比配成的洗脱液， 以 200ml/min 的流速进行洗脱， 冲洗掉色谱柱内乙醇，。
25、 柱内用活塞进行分步加压， 第一步加压到 15bar， 然 后用 100ml/min 的流速冲洗 1h 后， 再加压至 45bar， 活化 ； 0047 2） 色谱柱准备完成后， 称取鲜地黄粗提物 150g（水苏糖含量为 38.9%） ， 溶解在 900ml 水中， 过滤， 高压制备泵流速 100ml/min， 进样 20ml， 以乙腈与水的体积比 70:30 为洗 脱液， 进行恒速洗脱， 在示差检测器下 （内部温度 30， 外部温度 35） 检测整个洗脱过程， 通过软件观察色谱峰， 在 14.6min 水苏糖产物峰上升， 通过自动馏分收集器进行收集， 收集 时间为水苏糖峰开始上升阶段14.6。
26、7分钟， 峰下降整峰高五分之一结束收集。 40min后结束 本次洗脱系统， 进行重复进样收集， 直至配制的鲜地黄粗提取样品进样完毕， 收集液在旋转 蒸发仪中回收溶剂， 至相对密度 1.10（60测） ， 使用真空干燥 （真空度为 0.09 0.15Mpa） 在 25 30下， 干燥 20 40h， 得到干燥粉末 52.3g， 通过高效液相色谱法定量分析， 水苏 糖含量为 98.9%， 得率为 88.6%。 0048 实施例 3 0049 一种从地黄中分离水苏糖的方法， 包括以下步骤 ： 0050 1） 在 5L 的敞口玻璃容器中， 加入 700g 的 20m 的球型氨丙基键合硅胶， 加入分析 。
27、乙醇 1800mL， 搅拌成匀浆， 超声 35min 后， 倒入准备好的直径 15cm， 柱长为 35cm 的不锈钢色 谱柱管内， 抽取液体盖上法兰， 用乙腈与水按 70:30 的体积比配成的洗脱液， 以 200ml/min 的流速进行洗脱， 冲洗掉色谱柱内乙醇， 柱内用活塞进行分步加压， 第一步加压到 15bar， 然 后用 100ml/min 的流速冲洗 1h 后， 再加压至 45bar， 活化 ； 0051 2） 色谱柱准备完成后， 称取鲜地黄粗提物 100g（水苏糖含量为 38.9%） ， 溶解在 700ml 水中， 过滤， 高压制备泵流速 200ml/min， 进样 15ml， 以乙。
28、腈与水的体积比 73:27 为洗 脱液， 进行恒速洗脱， 在示差检测器下 （内部温度 30， 外部温度 35） 检测整个洗脱过程， 通过软件观察色谱峰， 在 14.5min 水苏糖产物峰上升， 通过自动馏分收集器进行收集， 收集 时间为水苏糖峰开始上升阶段14.56分钟， 峰下降整峰高五分之一结束收集。 40min后结束 本次洗脱系统， 进行重复进样收集， 直至配制的鲜地黄粗提取样品进样完毕， 收集液在旋转 蒸发仪中回收溶剂， 至相对密度 1.15（60测） ， 使用真空干燥 （真空度为 0.09 0.15Mpa） 在 25 30下， 干燥 20 40h， 得到干燥粉末 47.9g， 通过高效。
29、液相色谱法定量分析， 水苏 糖含量为 98.3%， 得率为 87.9%。 说 明 书 CN 103319546 A 6 5/5 页 7 0052 实施例 4 0053 一种从地黄中分离水苏糖的方法， 包括以下步骤 ： 0054 1） 在 5L 的敞口玻璃容器中， 加入 700g 的 10m 的球型氨丙基键合硅胶， 加入分析 乙醇 1400mL， 搅拌成匀浆， 超声 35min 后， 倒入准备好的直径 8cm， 柱长为 40cm 的不锈钢色 谱柱管内， 抽取液体盖上法兰， 用乙腈与水按 70:30 的体积比配成的洗脱液， 以 200ml/min 的流速进行洗脱， 冲洗掉色谱柱内乙醇， 柱内用活塞。
30、进行分步加压， 第一步加压到 15bar， 然 后用 100ml/min 的流速冲洗 1h 后， 再加压至 45bar， 活化 ； 0055 2） 色谱柱准备完成后， 称取鲜地黄粗提物 100g（水苏糖含量为 38.9%） ， 溶解在 300ml水中， 过滤， 高压制备泵流速10ml/min， 进样10ml， 以乙腈与水的体积比69:31为洗脱 液， 进行恒速洗脱， 在示差检测器下 （内部温度 30， 外部温度 35） 检测整个洗脱过程， 通 过软件观察色谱峰， 在 15.3min 水苏糖产物峰上升， 通过自动馏分收集器进行收集， 收集时 间为水苏糖峰开始上升阶段 15.38 分钟， 峰下降整。
31、峰高五分之一结束收集。40min 后结束 本次洗脱系统， 进行重复进样收集， 直至配制的鲜地黄粗提取样品进样完毕， 收集液在旋转 蒸发仪中回收溶剂， 至相对密度 1.12（60测） ， 使用真空干燥 （真空度为 0.09 0.15Mpa） 在 25 30下， 干燥 20 40h， 得到干燥粉末 44.2g， 通过高效液相色谱法定量分析， 水苏 糖含量为 98.3%， 得率为 87.2%。 0056 综上， 本发明所提供的高效制备液相色谱分离水苏糖的方法， 在示差检测器在线 监测下进行分离产物和杂质的精确收集， 分离过程简单快捷， 一次分离就能达到目的， 不需 要任何化学处理方法， 有效保证了水苏糖不会损失， 分离过程用时短， 分离量大， 水苏糖的 收率能够达到 85% 以上， 特别是纯度能够达到 98% 以上。本方法运行成本低， 填料可以长期 重复循环使用， 溶剂可回收重复使用， 分离时间短， 分离量大， 适合工业化生产。 说 明 书 CN 103319546 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103319546 A 8 。