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本发明公开了从红豆杉科植物枝叶中，采用现代分离手段提取得到具有很好降血糖作用的红豆杉提取物，该有效部位中精制双黄酮类的含量可达50%~80%，其中主要有效成分为金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、白果双黄酮、穗花双黄酮。经实验研究表明，该红豆杉提取物不仅可显著抑制α-葡萄糖苷酶活性，而且具有明显降低糖尿病大鼠血糖的作用，能够减轻或抑制糖尿病并发症的发生和发展，有望开发成新的降血糖药物。

权利要求书一种具有降血糖作用的红豆杉提取物，其特征在于：它通过以下方法制备得到：
(1)取红豆杉枝叶，用水或乙醇提取，浓缩得浓缩物，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物；再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物；
(2)取步骤(1)乙酸乙酯萃取物上大孔树脂柱，用浓度为50‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类和酚酸类化合物的混合物；
或者乙酸乙酯萃取物上聚酰胺柱进行柱层析分离，用浓度为10‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类和酚酸类化合物的混合物；
(3)取步骤(1)正丁醇萃取物上大孔树脂柱，用浓度为50‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类及其双黄酮苷类的混合物；
或正丁醇萃取物上聚酰胺柱进行柱层析分离，用浓度为10‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类及其双黄酮苷类的混合物。
根据权利要求1所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物，其特征在于：步骤(2)得到的精制双黄酮类化合物包括金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、白果双黄酮和穗花双黄酮。

3、  根据权利要求1所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物，其特征在于：步骤(3)得到的精制双黄酮类及其双黄酮苷类化合物包括金松双黄酮及其苷、银杏黄素及其苷、异银杏黄素及其苷、白果双黄酮及其苷、穗花双黄酮及其苷类化合物。
根据权利要求1所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物，其特征在于：所述提取物和药学上可接受的载体制成胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、脂肪乳剂、栓剂、注射剂或微囊剂型的药物。
权利要求1所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取红豆杉枝叶，用水或乙醇提取，浓缩得浓缩物，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物；再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物；
(2)取步骤(1)乙酸乙酯萃取物上大孔树脂柱，用浓度为50‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类的混合物；
或者乙酸乙酯萃取物上聚酰胺柱进行柱层析分离，用浓度为10‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类的混合物；
(3)取步骤(1)正丁醇萃取物上大孔树脂柱，用浓度为50‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类及其苷类混合物；
或正丁醇萃取物上聚酰胺柱进行柱层析分离，用浓度为10‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类及其苷类的混合物。
根据权利要求5所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的提取方法为浸渍提取法、超声提取法或加热回流提取法。
根据权利要求5所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的大孔树脂为AB‑8或D101大孔吸附树脂；聚酰胺的粒径为15‑60目。
权利要求1至3任一项所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物在制备降血糖药物中的应用。

说明书具有降血糖作用的红豆杉提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种植物提取物，具体涉及从南方红豆杉枝叶中制备得具有降血糖作用的有效部位及有效成分。 
背景技术
当今，在全球范围内糖尿病已经成为继心脑血管疾病和肿瘤之后威胁人类的“第三号杀手”，无论在发达国家还是发展中国家，糖尿病的发病率都在急剧上升。据世界卫生组织公布的资料，1985年全世界有3000万糖尿病患者，到1997年已增加至1.35亿。据国际权威糖尿病流行病学专家预测，到2050年，全球糖尿病人将达3亿人，亚洲地区患者增长幅度非常快，我国的糖尿病患者总数已有6000万以上，预计每年发病增长率超过6%。此病不仅给患者带来极大的痛苦，生活质量受到很大影响，甚至威胁患者的生命，还给社会带来沉重的经济负担。因此，糖尿病作为一种严重的非传染性、慢性疾病，已成为世界各国关注的重大公共卫生问题。 
糖尿病作为一种伴随终身的慢性疾病，患者需要长期服药，如何合理用药显的尤其重要，而降糖药物就像一把双刃剑，既能治病，也存在一定副作用。口服降糖药，如磺酰脲类、双胍类等药物是治疗糖尿病、调节血糖的首选药物，严格掌握其适应证、作用机制、合理的联合应用等非常重要。然而这些药物具有一定的副作用，要严格在医生的指导下合理使用。 
红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属（Taxus.L）植物包括南方红豆杉[T.mairei var.mairei（Lemcc et Level）cheng et L.K.Fu]及西藏红豆杉（T.wallichiana Zucc)、云南红豆杉（T.yunnanensis Cheng et.L.K.Fu）、中国红豆杉 [ T.chinensis（Pilger）Rehd.]、东北红豆杉（T.cuspidata.Sieb.et.Zucc.）和曼地亚红豆杉（T.media），红豆杉在开发抗肿瘤药物中应用较多，但未见有在开发治疗糖尿病药物的报道。 
发明内容
发明目的：作为药用、绿化和观赏植物，现有大量的红豆杉栽培，每年产生大量的废弃枝叶，本发明的目的是解决现有技术的不足，实现红豆杉资源有效研究开发与利用，利用现代分离技术并结合大量药学实验筛选，提供一种高效的防治糖尿病的红豆杉提取物及其制备方法与应用。 
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为： 
一种具有降血糖作用的红豆杉提取物，它通过以下方法制备得到：
(1)取红豆杉枝叶，用水或乙醇提取，浓缩得浓缩物，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物；再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物；
(2)取步骤(1)乙酸乙酯萃取物上大孔树脂柱，用浓度为50‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类和酚酸类化合物的混合物；
或者乙酸乙酯萃取物上聚酰胺柱进行柱层析分离，用浓度为10‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类和酚酸类化合物的混合物；
(3)取步骤(1)正丁醇萃取物上大孔树脂柱，用浓度为50‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类及其双黄酮苷类的混合物；
或正丁醇萃取物上聚酰胺柱进行柱层析分离，用浓度为10‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类及其双黄酮苷类的混合物。
作为优选方案，以上所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物，步骤(2)制备得到的精制双黄酮类化合物包括金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、白果双黄酮和穗花双黄酮。所述的酚酸类化合物包括3,4‑二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸和3‑甲氧基‑4‑苯甲酸。 
作为优选方案，以上所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物，步骤(3)制备得到的精制双黄酮类及其双黄酮苷类化合物包括金松双黄酮及其苷、银杏黄素及其苷、异银杏黄素及其苷、白果双黄酮及其苷、穗花双黄酮及其苷类化合物。 
作为优选方案，以上所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物，所述提取物和药学上可接受的载体制成胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、喷雾剂、脂肪乳剂、栓剂或微囊剂型、外用制剂的药物。 
本发明提供的具有降血糖作用的红豆杉提取物制成片剂时，把各原料和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，整粒，然后压片制成片剂。 
本发明提供的具有降血糖作用的红豆杉提取物制成颗粒剂时，把各原料的提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。 
本发明提供的具有降血糖作用的红豆杉提取物制成胶囊剂时，把各原料的提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。 
本发明提供的具有降血糖作用的红豆杉提取物的制备方法，其包括以下步骤： 
(1)取红豆杉枝叶，用水或乙醇提取，浓缩得浓缩物，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物；再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物；
(2)取步骤(1)乙酸乙酯萃取物上大孔树脂柱，用浓度为50‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类和酚酸类化合物的混合物；
或者乙酸乙酯萃取物上聚酰胺柱进行柱层析分离，用浓度为10‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类和酚酸类化合物的混合物；
(3)取步骤(1)正丁醇萃取物上大孔树脂柱，用浓度为50‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类及其双黄酮苷类混合物；
或正丁醇萃取物上聚酰胺柱进行柱层析分离，用浓度为10‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类及其双黄酮苷类的混合物。
作为优选方案，以上所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物的制备方法，步骤(1)所述的提取方法为浸渍提取法、超声提取法或加热回流提取法。 
作为优选方案，以上所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物的制备方法，步骤(2)所述的大孔树脂为AB‑8、D101大孔吸附树脂；聚酰胺的粒径为15‑60目。 
以上所述的具有降血糖作用的红豆杉提取物的制备方法，乙醇提取乙醇的浓度为30‑99%。 
本发明制备得到的将得到的精制双黄酮类提取物用反复硅胶柱法，得到的精制双黄酮类有效部位进行硅胶柱层析，用氯仿‑甲醇梯度洗脱分别得到金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、白果双黄酮、穗花双黄酮单体化合物。 
本发明提供的具有降血糖作用的红豆杉提取物在制备降血糖药物中的应用。 
有益效果：本发明提供的组合物和现有技术相比具有以下优点： 
1. 本发明所用的原材料为红豆杉的枝叶，现有技术大量枝叶均都废弃，本发明变费为宝，原材料来源丰富，价格低廉，可实现工业化生产。
2. 本发明通过现代化分离纯化方法，结合大量体内外药理实验筛选，优选得到具有很好降血糖作用的精制红豆杉总精制双黄酮类部位，该有效部位成分清楚，活性强，药效好， 质量安全可控。 
3. 本发明提供的具有降血糖作用的红豆杉提取物可方便和不同的赋形剂制备成不同的药物剂型，能方便临床应用。同时本发明提供的红豆杉提取物的制备方法，工艺设计合理、提取有效成分含量高，可操作性强，适合工业化大生产。 
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。 
实施例1 
一种具有降血糖作用的红豆杉提取物，其通过以下方法制备得到：
南方红豆杉枝叶5 kg，切成饮片规格，用10倍体积量95%乙醇，8倍50%醇各回流提取一次，合并药液将药液浓缩至无醇味，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物上AB‑8型大孔树脂，用蒸馏水和0%‑80%乙醇洗脱，合并60%‑70%乙醇洗脱液减压浓缩、冷冻干燥即得精制双黄酮类和酚酸类化合物。  
用90%乙醇溶解有效部位，用紫外分光光度法，将样品在350‑600nm波长处扫描。在504nm处有最大吸收，确定测定波长为504nm。以穗花双黄酮为对照品，测出总黄酮含量为72%。经HPLC测定测得总黄酮含有五个双黄酮，依次为金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、白果双黄酮、穗花双黄酮。所述的酚酸类化合物包括3,4‑二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸和3‑甲氧基‑4‑苯甲酸。
实施例2 
一种具有降血糖作用的红豆杉提取物，其通过以下方法制备得到：
南方红豆杉枝叶5 kg，切成饮片规格，用8倍体积量95%乙醇回流提取3次，合并药液将药液浓缩至无醇味，先用石油醚萃取除去色素，然后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物上粒径为15‑60目的聚酰胺柱进行柱层析分离，用浓度为10‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类和酚酸类化合物的混合物；按实施例1方法测得总黄酮含量为70%。经HPLC测定测得总黄酮含有五个双黄酮依次为金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、白果双黄酮、穗花双黄酮，所述的酚酸类化合物包括3,4‑二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸和3‑甲氧基‑4‑苯甲酸。
实施例3 
一种具有降血糖作用的红豆杉提取物，其通过以下方法制备得到：
南方红豆杉枝叶5 kg，切成饮片规格，用8倍体积量95%乙醇回流提取3次，合并药液将药液浓缩至无醇味，先用石油醚萃取除去色素，再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物。正丁醇萃取物上AB‑8型大孔树脂柱，用浓度为50‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类及其苷类混合物；按实施例1方法测得总黄酮含量为70%。经HPLC测定测得总黄酮含五个双黄酮及其苷类依次为金松双黄酮及其苷、银杏黄素及其苷、异银杏黄素及其苷、白果双黄酮及其苷、穗花双黄酮及其苷。
实施例4 
一种具有降血糖作用的红豆杉提取物，其通过以下方法制备得到：
南方红豆杉枝叶5 kg，切成饮片规格，用10倍体积量90%乙醇回流提取3次，合并药液将药液浓缩至无醇味，先用石油醚萃取除去色素，再用正丁醇萃取得正丁醇萃取物。正丁醇萃取物上粒径为15‑60目的聚酰胺柱进行柱层析分离，用浓度为10‑80%的乙醇进行梯度洗脱，得到精制双黄酮类及其苷类化合物，按实施例1方法测得总黄酮含量为69%。经HPLC测定测得总黄酮含有五个双黄酮及其苷类依次为金松双黄酮及其苷、银杏黄素及其苷、异银杏黄素及其苷、白果双黄酮及其苷、穗花双黄酮及其苷。
实施例5  南方红豆杉不同部位降血糖的活性筛选实验 
糖尿病模型小鼠模型的建立：取雄性昆明小鼠100只，随机取10只为空白组。空白组给予标准颗粒饲料直至试验结束，其余小鼠喂食高脂饲料（配方：颗粒标准饲料74.5%，蔗糖10%，猪油10%，蛋黄粉5%，胆固醇0.5%）。喂养4周后，除空白组外，小鼠禁食不禁水18 h,腹腔注射170 mg/kg链脲霉素。72h后，尾静脉取血测定小鼠空腹血糖值，血糖值在10‑25 mmol/L之间并出现多饮多尿症状的小鼠被选为糖尿病模型小鼠。
给药与测定：将糖尿病小鼠按体重、血糖随即分成6组，即为模型组、阳性药组、南方红豆杉乙醇提取物的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位。各组的给药剂量按生药量（1.5 gkg‑1d‑1）折算，按以下计量灌胃，南方红豆杉石油醚部位（52.5 mgkg‑1d‑1）、乙酸乙酯部位（52. 5 mgkg‑1d‑1）、正丁醇部位（52. 5 mgkg‑1d‑1）、水部位（52. 5 mgkg‑1d‑1）。阳性药为二甲双胍，模型、空白组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠。每天灌胃1次，连续给药3周。 
用罗氏Advantange 血糖仪；罗康泉Advantange血糖试纸定期测量小鼠血糖。 
实验结果显示南方红豆沙乙酸乙酯部位与正丁醇部位能明显降低糖尿病小鼠的空腹血糖，为降血糖的有效部位。具体实验结果如表1所示。 
表1  南方红豆杉不同提取部位对糖尿病模型小鼠FBG的影响（，n=10） 

与模型组比较ap<0.05,aap<0.01;与给药前比较bp<0.05,bbp<0.01
实施例6  南方红豆杉不同部位对α‑葡萄糖苷酶活性的抑制作用
南方红豆杉枝叶1kg，用10倍90%乙醇，8倍50%乙醇各提取一次，合并药液将药液浓缩至无醇味后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取余下的水溶液为水部位，得到各个部位。
96微孔板上加磷酸钾缓冲液(pH 6.8)110 μL，再加入0.2 U/mLα‑glucosidase 20 μL，10 μL样品溶液，混匀，37 ℃恒温15 min后，加入2.5 mmol/L 4‑硝基苯‑α‑D‑吡喃葡萄糖苷酶(PNPG) 20 μL，混匀后37℃恒温反应15 min。最后加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液，于405 nm波长下测OD值。 
以阿卡波糖为阳性对照，同时设定对照组（缓冲液+酶液+底物），空白组对照组（缓冲液）。 
酶活性抑制率=（1‑（A样品‑A样品对照）/(A对照‑A空白)）×100% 
标准曲线的测定  用磷酸缓冲液（pH 6.8 ）配制 1000 µmol·L‑1对硝基苯酚，稀释成400，300，200，150，100，50，25，5，0 µmol·L‑1，分别取每不同浓度的 PNP 溶液各160 µL，加入0.2 moL·L‑1Na2CO3 溶液80 µL，混匀，在405 nm 下测定A值，测3组取平均值。以 A 值为纵坐标，对硝基苯酚浓度为横坐标，做出标准曲线Y=0.336 X‑0.027 (R2=1)。
α‑葡萄糖苷酶活力的测定  根据反应体系加入110 µL 磷酸钾缓冲液（pH 6.8 ），加入 20 µL 0.2 U·mL‑1α‑葡萄糖苷酶，8 µL DMSO ，37℃恒温15 min 后加入2.5 mmoL·L‑1 PNPG 20 µL，37℃恒温反应15 min。再加入80 µL 0.2 moL·L‑1的Na2CO3溶液，于405 nm波长下测A值。 
酶活力单位定义：37 ℃，pH 6.8 条件下，每分钟水解底物所产生1 µmoL对硝基苯酚的酶量，规定为1 个酶活力单位（U）。 
南方红豆杉不同部位对α‑葡萄糖苷酶活性的抑制作用见表2，抑制α‑葡萄糖苷酶活性为乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位>石油醚部位>acarbose。详细结果见表2. 
表2  南方红豆杉提取物抑制α‑葡萄糖苷酶活性的能力（，n=3）

实施例7  红豆杉提取物对2型糖尿病大鼠降血糖作用
糖尿病模型大鼠模型的建立：取雄性SD 65只，随机取8 只为空白组。空白组给予标准颗粒饲料直至试验结束，其余大鼠喂食高脂饲料（配方：颗粒标准饲料74.5%，蔗糖10%，猪油10%，蛋黄粉5%，胆固醇0.5%）。喂养4周后，除空白组外，大鼠禁食不禁水18 h,腹腔注射35 mg/kg链脲霉素。72h后，尾静脉取血测定大鼠空腹血糖值，血糖值在10‑25 mmol/L之间并出现多饮多尿症状的大鼠被选为糖尿病模型大鼠。
给药与测定：将糖尿病大鼠按体重、血糖随即分成7组，即为模型组、阳性药组、实施例1、实施例2、实施例3和实施例4制备得到的提取物。各组的给药剂量按生药量（1.5 gkg‑1d‑1）折算，灌胃给药。阳性药为二甲双胍，模型、空白组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠。每天灌胃1次，连续给药3周。 
实验结果表明本发明制备得到的南方红豆杉提取物对2型糖尿病大鼠具有很好的降血糖作用，具体实验结果见表3和表4。 
表3 红豆杉提取物对2型糖尿病模型大鼠空腹血糖的影响 

与模型组比较ap<0.05,aap<0.01;与给药前比较bp<0.05,bbp<0.01
表4 红豆杉提取物对2型糖尿病模型血液生化指标的影响

与模型组比较ap<0.05,aap<0.01;
实施例8  南方红豆杉提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响
HepG2细胞的培养：HepG2细胞复苏后采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基置于37℃、5%CO2培养箱培养，待贴壁长满后，用0.25%胰蛋白酶消化，每3天1:3传代一次，选取对数生长期细胞进行实验。
胰岛素抵抗HepG2细胞模型的葡萄糖消耗实验及MTT实验：将处于对数生长期的细胞消化后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL细胞悬液。本实验设正常对照组、模型组、二甲双胍组（终剂量为10‑3mol/L）、实施例1南方红豆杉提取物不同浓度组。 
待细胞单层贴壁后，模型组更换新配制的含有胰岛素浓度为5×10‑7mol/L的DMEM高糖培养基，于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h，以造成胰岛素抵抗细胞模型。弃去培养基，给药组加入不同浓度的不含血清的含药培养基，正常对照组及模型组则加入不含血清的培养基，各组均包括含生理胰岛素组与不含生理胰岛素组。于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h后，用葡萄糖临床试剂盒检测培养基中的葡萄糖含量，计算各组细胞的葡萄糖消耗量。 
葡萄糖消耗实验结束后，每孔加入5g/LMTT溶液20μL，于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，4h后终止培养，小心吸弃孔中的培养基，每孔加入150μLDMSO，震荡器震荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm波长下测定各孔的吸光度值，以检测细胞的数目与活力。 
表5的实验表明南方红豆杉提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗具有促进作用，当给药浓度为0.05mg/mL时，效果最佳。同时，MTT结果显示，所设的给药剂量对HepG2细胞均具有不同程度的抑制作用，即表示南方红豆杉提取物表现出很好的促进糖消耗作用。 
表5 南方红豆杉提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响 

由以上实验结果表明，本发明提供的南方红豆杉提取物，不仅可显著抑制α‑葡萄糖苷酶活性，而且具有明显降低糖尿病大鼠血糖的作用，对胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗具有促进作用，能够有效纠正糖尿病的糖代谢紊乱，提高糖耐量的作用，且未见有不良反应，能够减轻或抑制糖尿病并发症的发生和发展，有望开发成新的降血糖药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。